Summary
Questo studio descrive un metodo dettagliato per l'isolamento e la caratterizzazione di cellule tumorali ovariche primarie da campioni clinici solidi. Cancro ovarico campioni clinici sono sottoposti a digestione enzimatica per ottenere praticabile, privo di fibroblasti cancro ovarico epiteliale (EOC), le cellule particolarmente adatto per applicazioni a valle.
Abstract
Sono urgentemente necessari strumenti affidabili per indagare l'iniziazione e la progressione del cancro ovarico. Mentre l'uso di linee di cellule di cancro ovarico rimane uno strumento utile per comprendere il cancro ovarico, il loro uso ha molte limitazioni. Questi includono la mancanza di eterogeneità e la pletora di alterazioni genetiche associate con prolungato passaging in vitro. Qui si descrive un metodo che consente di fissare rapidamente cellule tumorali ovariche primarie formare campioni clinici solidi raccolti al momento dell'intervento. Il metodo consiste nel sottoporre campioni clinici per digestione enzimatica per 30 min. La sospensione cellulare isolato è permesso di crescere e può essere usato per applicazioni a valle compreso screening di farmaci. Il vantaggio di linee primarie di cellule di cancro ovarico su linee di cellule di cancro ovarico stabilito è che sono rappresentativi dei campioni clinici specifiche originali sono stati derivati da e possono essere derivati da diversi siti se primacarcinoma ovarico ry o metastatico.
Introduction
Nonostante la sua relativamente bassa incidenza, il cancro ovarico è il più letale delle malattie ginecologiche e la quinta causa di decessi per cancro tra le donne 1,2. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di strumenti affidabili e modelli che ricapitolano fedelmente l'inizio e la progressione della malattia 3. La maggior parte delle nostre conoscenze oggi sul cancro ovarico è stato possibile attraverso l'uso di cellule immortalizzate ovarici epiteliali di superficie (IOSEs), linee di cellule di cancro ovarico e le cellule tumorali ovariche primarie recuperati dal liquido ascitico 4-7. Purtroppo, il loro utilizzo ha diverse limitazioni, tra cui una serie di modifiche genetiche e fenotipiche associate a processi immortalization o nei passaggi in vitro e l'eterogeneità della popolazione risultante dalla preparazione del liquido ascitico.
Pertanto, le cellule tumorali ovariche primarie derivate da campioni solidi identificabili e specifici del cancro ovarico rappresentano un unique strumento per studiare la progressione del cancro ovarico.
Le principali difficoltà che comporta l'ottenimento queste cellule maligne sono dovute ad una crescita eccessiva di cellule stromali o fibroblasti con perdita di vitalità e prematura mancanza di capacità proliferativa nella cultura di queste cellule EdC. Attualmente esistono diversi metodi per creare sospensioni monocellulari da tumori solidi, con mezzi meccanici o dissociazione enzimatica, tuttavia alcune tecniche producono una quantità maggiore del risultato preferito 8. Qui mostriamo che la digestione enzimatica con dispasi II si traduca in un effettivo recupero di, privo di fibroblasti cellule EdC vitali. Le culture EOC così ottenuti sono altamente suscettibili alla manipolazione genetica e sono utili anche nel test di screening di farmaci, indicando che queste culture EOC sono adatti per molte applicazioni a valle.
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Protocol
Dichiarazione Etica
Esemplari solide di cancro ovarico sono stati ottenuti dalla University of Minnesota Procurement Tissue Facility (TPF) dopo che il Comitato Institutional Review Board: Human Subject Board (IRB) di approvazione.
1. Setup reagente
- Preparare Complete mezzo DMEM completandola DMEM con 10% FBS, e 100 unità di penicillina-streptomicina. Conservare il terreno a 4 ° C e riscaldare a 37 ° C prima dell'uso.
- Aliquota dispasi II in volumi separati di 5-10 ml per evitare di congelare più scongela e conservare a -20 ° C in un congelatore no-nonfrost.
2. Tissue Collection
- Raccogliere campioni solidi di cancro ovarico (~ 5 g di dimensione) al momento dell'intervento da aree macroscopicamente identificate come cancro da un patologo. Campioni clinici sono de-identificati e registrati secondo i protocolli istituzionali.
- Mettere i campioni in una sterile, sccoperchio rew, polipropilene campioni contenitore riempito con 30 ml di PBS freddo. Trasportare i campioni dal laboratorio patologia chirurgica al laboratorio di ricerca per la trasformazione in ghiaccio, e in 30 min dalla raccolta del campione (Figura 1).
3. Tissue Processing
- Lavorando in condizioni sterili, trasferire i campioni sul piatto Petri (60 mm x 60 mm) contenenti 10 ml di fresco, PBS freddo e con una lama di rasoio sterile, ulteriormente tagliato in piccoli pezzi possibili (2 mm o meno) ( Figure 2A e 2 B).
- Trasferire i tessuti macinate in una provetta conica da 15 ml contenente 10 ml di preriscaldata (37 ° C per 30 min) dispasi II (2,4 U / ml) in DMEM e incubare a 5% di CO 2 e 37 ° C per 30 min. Per assicurare una digestione ottimale dei campioni, agitare manualmente lo slurry cella ogni 5 min.
- Dopo 30 minuti di incubazione, il trasferimento (usandoA 10 ml pipetta sierologica) slurry cella su un filtro cella (70 micron mesh) collocata sopra un tubo conico da 50 ml e applicare una leggera pressione contro la maglia utilizzando uno stantuffo della siringa. Scartare qualsiasi tessuto non dissociato (rimanente sulla parte superiore della maglia) e raccogliere la sospensione cellulare ottenuta nella provetta sterile da 50 ml. Centrifugare a 320 xg per 7 minuti a 4 ° C (Figura 3).
- Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di DMEM contenente 10% FBS.
- Incubare la sospensione cellulare in una capsula di Petri in 5% CO 2 e 37 ° C (Figura 4).
- Cambia il mezzo dopo 24 ore dal fasciame iniziale. Questo consente la rimozione di detriti cellulari e la maggior parte degli eritrociti presenti in coltura.
- Cambia il mezzo ogni tre giorni per le due settimane successive, dopo di che le culture di primaria EOC sono pronti per le applicazioni a valle.
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Representative Results
Campioni clinici freschi di cancro ovarico vengono raccolti dopo l'intervento (Figura 1) e tagliati in piccoli pezzi (figure 2a e 2b) costituenti il liquame cella. Questo permette l'esposizione ottimale dei campioni al trattamento enzimatico. Slurry cellula è esposta a digestione enzimatica ed incubato a 37 ° C per 30 min. Durante il tempo di incubazione slurry diventa sempre più torbida (soprattutto dopo ogni agitazione) e questo è un segno di disaggregazione tessuto. Al termine del periodo di incubazione, la miscela viene trasferita su un filtro cellule per separarle EOC da qualsiasi tessuto non dissociato (Figura 3). La sospensione cellulare recuperato è posto al 5% di CO 2 e 37 ° C (F igure 4). In questa fase la morfologia delle colture cellulari rivela la presenza di entrambe le celle EOC come una sospensione di cellule singole e in piccoli grumi. La cultura a questo punto rivela anche la presentazione ce di eritrociti e piccoli detriti come mostrato in Figura 5. È importante sottolineare che mentre l'EOC lentamente (in un periodo di 1-3 giorni) aderire alla plastica, eritrociti e detriti cellulari non sarà e alla fine si e progressivamente "scompare dalla cultura". Di giorno 3 da placcatura iniziale, le culture EOC esprimono una crescente aderenti raggruppamenti cellulari EOC e progressivamente meno eritrociti e detriti, come mostrato in Figura 6. Di giorno 6-7, cellule EOC formano ricciolo forme simili (freccia) e cominciano a diffondersi alla plastica per formare grandi aggregati multicellulari portano alla tipica morfologia ciottoli di cellule EOC come mostrato in Figura 7. Entro il giorno 14, cellule EOC genere diventano confluenti (Figura 8) e sono ora pronti per test e applicazioni a valle.
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Figura 1. Insieme di campioni clinici. Campioni solidi di cancro ovarico sono raccolti al momento della chirurgia e collocato in una sterile, coperchio a vite, contenitore in polipropilene campione riempito con 30 ml di PBS ghiacciato.
Figura 2. Trattamento di campioni clinici. A) del campione solido trasferiti su una piastra di Petri contenente 10 ml di fresca, ghiacciata 1x PBS. B) I campioni clinici ulteriormente tagliate a pezzi di circa 2 mm di dimensioni.
Figura 3. Separazione di cellule EOC da tessuti non dissociato. Dopo la digestione enzimatica, campioni clinici vengono trasferite su un filtro cella e una leggera pressione viene applicata sui campioni clinici digeriti utilizzando uno stantuffo della siringa. Questo permette di distacco meccanico di EOC dai tessuti connettivi e il recupero delle cellule EdC.
Figura 4. Placcatura del risultante EOC cellule sospensione. Dopo aver rimosso eventuali tessuti indissociate, la sospensione cellulare viene centrifugato e risospeso in 10 ml di DMEM containing 10% FBS e incubato in una capsula di Petri al 5% di CO 2 e 37 ° C.
Figura 5. Morfologia di colture cellulari EOC immediatamente dopo sospensione di elaborazione. Cellulare subito dopo placcatura mostra EOC come unico sospensioni cellulari e in grumi (sia indicato dalle frecce), eritrociti e detriti cellulari abbondano ancora in questa fase. Ingrandimento originale, 20X.
Figura 6. Morfologia delle colture cellulari EOC al giorno 3 dopo la placcatura coltura cellulare. EOC al giorno 3 dopo la placcatura mostra semi-aderente EOC cell di cluster (indicato dalla freccia) e la contaminazione degli eritrociti meno. Ingrandimento originale, 20X.
Figura 7. Culture EOC stabilito dopo una settimana di placcatura cultura. Cella EOC una settimana dopo la placcatura iniziale mostra cluster ricciolo-come delle cellule diffusione sulla plastica coltura dei tessuti. Ingrandimento originale, 20X.
Figura 8. Colture confluenti EOC. Confluenti monostrato di cellule EOC mostrano il tipico acciottolato morfologia epiteliale dopo 14 giorni di coltura.
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Discussion
Una migliore comprensione della eziologia cancro ovarico e sviluppo è fondamentale per migliorare l'esito delle donne affette da questa malattia devastante. In questo contesto, l'uso di stabilito e "disponibili commercialmente" ovarico linea cellulare di cancro è stato indubbiamente estremamente utile. Tuttavia, oggi sappiamo che le linee cellulari del cancro non sono rappresentativi del tumore umano hanno avuto origine da molti aspetti, tra cui la mancanza di eterogeneità 9,10.
Qui riportiamo un metodo rapido e affidabile per l'isolamento e la coltura di cellule tumorali ovariche primarie direttamente da campioni clinici di cancro ovarico meno di 30 min di isolamento campione chirurgico.
Poiché le cellule primarie sono isolati da un campione solido rispetto liquido ascitico, questa ha il vantaggio di isolare cellule dai primi stadi della malattia prima del momento in cui si verifica la formazione di fluido ascitico. Questa tecnica ha anche la advantage di isolare cellule tumorali ovariche primarie da un sito specifico. Il successo nell'ottenere cellule tumorali ovariche primarie vitali utilizzando questo protocollo è in gran parte dipende da quanto velocemente il campione può essere elaborato dopo l'intervento. Per ottenere i migliori risultati, i campioni devono essere ricevuti entro 30 minuti da un intervento chirurgico. Se ciò non è possibile, i campioni devono essere conservati a 4 ° C (in PBS) per una notte e trattati il giorno seguente. Nella nostra esperienza, l'elaborazione dei campioni seguente archiviazione durante la notte diminuisce il rendimento. L'esposizione a dispasi II per più di 30 min riduce anche la vitalità cellulare e non deve essere eseguita. Un'alternativa a dispasi trattamento II può essere trattamento con collagenasi o ialuronidasi. Tuttavia, questo si traduce in una riduzione della resa 8. A causa della grande variabilità nei campioni clinici, alcuni possono avere contaminazione globuli rossi più grande rispetto agli altri. Se questo è il caso, vi consigliamo di "lavaggio" dei tessuti tritati (step3.1) con PBS prima esponendoli alla digestione enzimatica. Questo ridurrà il numero di globuli rossi nella preparazione e facilitarne l'adesione delle cellule epiteliali primarie.
Poiché i campioni clinici non sono sterili (perdono sterilità non appena arrivano al laboratorio di patologia chirurgica), è fondamentale per eseguire tutte le operazioni in condizioni rigorosamente sterili. Mentre contaminazione della cultura è possibile, in genere si verifica in meno del 10% dei casi. Il protocollo di cui sopra può essere utilizzato con qualsiasi consistenza del campione clinico.
Il principale limite di questo protocollo è che il numero di cellule recuperate da ciascun campione è fortemente dipendente dalla dimensione dei campioni forniti. Dimensione di un tipico esemplare è di circa 3 cm x 3 cm. Un altro limite è rappresentato dal fatto che, mentre le cellule tumorali ovariche primarie crescono esponenzialmente fino a 10 passaggi in vitro (quindi disposiding l'opportunità di fare le scorte vitali) che in ultima analisi senesce e morire, limitando così la disponibilità di cellule da un singolo donatore. Anche se non si esegue alcuna separazione delle cellule tumorali da fibroblasti, ipotizziamo che la relativamente alta (10%) la concentrazione di siero durante tutto il processo può dare cellule tumorali ovariche un vantaggio di sopravvivenza rispetto fibroblasti. È anche probabile che le cellule che sono meno soggette a separazione dal compartimento stromale (fibroblasti) non possono disaggregare e rimarranno sul filtro durante la separazione.
Le cellule ottenute con questo protocollo sono molto adatti per le applicazioni future, tra cui indagini volte alla comprensione dei processi che portano alla iniziazione cancro ovarico e sviluppo. Le applicazioni future includono anche usando queste cellule primarie per in vitro e nei test in vivo di nuovi agenti chemioterapici per il cancro ovarico così come biomarcatori per la diagnosi precoce.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il personale del Fondo prelievo del tessuto della University of Minnesota di assistenza e raccolta campioni di tessuto del paziente. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa Programma Ovarian Cancer Research (OCRP) OC093424 a MB, con la Randy Shaver Cancer Research Fund e Comunità MB, dal Minnesota Ovarian Cancer Alliance a MB e dal fondo di Oncologia Ginecologica del Dipartimento di MB. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
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