Summary
황색 포도상 구균의 발광 생물 공학적 변형을 이용하여, 정형 외과 임플란트 감염 마우스 모델에서 광과 μCT 화상을 결합하여, 비 침습적으로 및 종 방향에서의 세균 감염의 역학뿐만 아니라 대응하는 염증 반응 및 해부학 적 변화를 모니터 할 수있는 기능을 구비 뼈.
Abstract
Multimodality 영상은 모두 전임상 및 임상 연구에 사용되는 일반적인 기술 방법으로 떠오르고있다. 생체 광학 및 μCT 영상에 결합하여 고급 기술은 해부학 적 맥락에서 생명 현상의 시각화 할 수 있습니다. 이 영상 방식은 조건에게 영향을 미치는 뼈를 연구하기 위해 특히 유용 할 수 있습니다. 특히, 정형 외과 임플란트 감염은 임상 정형 외과에서 중요한 문제이다. 이러한 감염은 세균 바이오 필름은 외국 이식 수술 재료에 형성하기 때문에 지속적인 염증, 골수염 궁극적으로 임플란트 이완과 실패 결과 임플란트 주변 뼈의 궁극적 인 골 용해에 이르는 치료하기가 어렵습니다. 여기서, 감염된 정형 보철 임플란트의 마우스 모델은 이러한 방식으로 대퇴골의 골수 관내로 KIRSCHNER 와이어 임플란트 수술 위치를 포함하는 것을 사용 하였다 임플란트 (E)의 단부무릎 관절에 xtended. 이 모델 LysEGFP 마우스, EGFP 형광 호중구가 마우스 균주에서, 자연적으로 발광하는 발광 생물 포도상 구균 균주와 함께 사용 하였다. 박테리아. 전에 수술 부위를 폐쇄하여 마우스의 무릎 관절에 접종 및 생체 내 생물 발광 형광 촬상 각각 세균 부담 및 호중구 염증 반응을 정량화하는 데 사용되었다 하였다. 생물 발광 및 형광 광 신호들의 3D 위치가 해부학 μCT 이미지와 공동 등록 할 수 있도록 또한 μCT 촬상는 동일한 쥐에 대해 수행 하였다. 시간이 지남에 따라 뼈의 변화를 정량화하기 위해, 원위 대퇴골의 외측 골 부피는 반자동 형상 기반 세그멘테이션 프로세스를 이용하여 특정 시점에서 측정했다. μCT 촬상으로 생체 내 생물 발광 / 형광 영상의 조합은 F 특히 유용 할 수 있고, 종합적또는 감염, 염증 반응 및 시간에 따른 뼈의 해부학 적 변화의 비 침습적 모니터링.
Introduction
광학 및 해부학 적 정보의 조합을 포함 Multimodality 전임상 이미징 기술은 3 차원 시각화 및 1-4의 생물학적 현상의 모니터링을 허용한다. μCT 영상은 광학 영상 뼈 생물학 5-7를 포함하는 프로세스를 조사에 특히 유용 할 수 있습니다 고유 한 조합을 나타냅니다와의 연계 μCT 이미징을 사용하여 뼈의 해부학의 절묘한 시각화를 가능하게하기 때문이다. 예를 들어 정형 외과 수술 8,9 다음과 같은 최악의 합병증을 나타내는 정형 외과 임플란트 감염을 연구하기 위해 이러한 기술을 사용하는 것입니다. 세균 바이오 필름은 박테리아 (10, 11)에 액세스 감염 차단 항생제를 감지에서 면역 세포를 방지하는 물리적 장벽 역할을하여 세균의 생존을 촉진 이식 된 이물질에 형성한다. 공동 조직 (패 혈성 관절염)의 만성 지속성 감염D 뼈 (골수염)는 보철물과 최종 실패 8,9 이완에 이르게 골 흡수를 유도한다. 이 결과 삽입물 주위 골 용해가 증가 이환율과 사망률 (12, 13)와 연결되어 있습니다.
우리의 이전 연구에서 생체 내 생물 발광 및 형광 이미징은 생쥐에서 14-19 정형 인공 관절 감염 모델에서 X 선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 영상 (μCT)와 함께 사용 하였다. 이 모델은 이러한 방식으로 티탄 KIRSCHNER 선 (K-선)을 배치하는 것을 포함 14-19 생쥐의 대퇴골로부터 무릎 관절의 확장 된 임플란트의 절단 끝. 수술 부위는 14-19 폐쇄되기 전에 황색 포도상 구균 (생물 발광 균주 Xen29 또는 Xen36)의 접종 후. 무릎 관절에서 임플란트의 표면에 피펫 팅 하였다 생체 내 광 이미징, 생물 발광 신호를 검출하고 정량화하기 위해 사용 된 뉴에 해당감염된 관절과 뼈 조직을 14 ~ 19 세균의 mber. 또한, 형광체 (20)를 보유 호중구 LysEGFP 생쥐의 생체 내 형광 영상, K-와이어를 포함하는 임플란트 14,19 감염된 무릎 관절에 이주 호중구의 수를 정량화하는 데 사용되었다. 마지막으로, 고분해능 X 선 촬영과 μCT 촬상 비롯한 해부학 적 영상 방식은 우리가 임의로 (2) 및 (6) 술 주 (16) 사이에 일반적으로 끝날 것 만성 감염의 전 기간에 걸쳐 영향을 뼈의 각각의 2 차원 및 3 차원의 해부학 적 영상을 허용 18. 이 모델을 이용하여 로컬 및 전신적 항균 치료, 보호 면역 반응 및 뼈의 병리 해부학 적 변화의 효능을 평가 하였다 (14-18) 될 수있다. 이 논문에서, 본 정형 인공 관절 감염 모델 및 광학 μCT 영상 방식에 대한 상세한 프로토콜은 representati로서 제공 하였다뼈의 해부학 적 맥락에서 생물학적 과정을 연구하는 시스템을했습니다. 이러한 마우스에서 정형 보철 관절 감염을 모델링하는 수술 절차를 포함, 2D 및 생체 내 광 이미징 절차 3D (박테리아 생물 발광 신호 및 형광 호중구 신호를 검출하기 위해)와 3D 광 화상, μCT 촬상 수집 및 분석하고 공동 등록 μCT 이미지.
Protocol
윤리 문 : 모든 동물은 동물 복지법 (AWA)에 명시된 연방 규정에 정의 된대로의 동물 관행에 따라 엄격하게 처리하고, 동물 애호에 대한 관리 및 실험 동물의 사용 및 PHS 정책에 대한 1996 가이드 관리 및 실험 동물 모든 동물 작업의 사용은 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 : MO12M465)에 의해 승인되었습니다.
(1)의 접종 준비 중순을 대수 생물 발광 박테리아
- 킬 생물 발광 S. 트립 틱 소이 한천 플레이트 상 구균 균주 Xen29 (또는 Xen36 bioluminscent 같은 다른 균주) (한천 [1.5 %]의 트립 틱 소이 액체 배지).
참고 : S. 구균 Xen29 21 유전자 조작이다 S. 이 균주에서 발견 안정적인 기본 플라스미드에 통합되어 Photorhabdus의 luminescens에서 파생 된 변형 된 럭셔리 오페론을 포함 구균 균주. 이 엔진겹 살아있는 박테리아는 구조적 및 대사 적 활성 세포에서 광을 방출한다. - 약 16 시간 (O / N) 37 ° C에서 그들을 배양하여 접시에 식민지를 성장.
- 약 16 시간 (O / N)를위한 액체 TSB (240 회전)을 흔들어에 하나의 세균 CFU와 문화를 선택합니다.
- 중간 대수 증식기 박테리아 (약 2 시간의 기간)을 얻었다 O / N 배양 1/50 희석 서브 배양을 수행한다.
- 펠렛, 재현 탁 씻어 박테리아는 PBS에 3 배.
- 600 nm에서 광학 밀도의 흡광도를 측정하여 (2 ㎕의 PBS에 1 × 103 CFU) 박테리아 접종 추정된다.
- 접시에 박테리아 O / N를 배양 한 후 접종의 CFU를 확인합니다.
2 마우스 외과 적 치료
참고 : 이러한 실험을 위해, 십이 주 세 남자 LysEGFP 마우스를 사용합니다. 이러한 마우스는 m으로 구성 골수 세포 (녹색 형광 단백질 발현 (EGFP)를 소유한다 향상된ostly 호중구) 20. 수술 중 및 난방 패드를 순환 단단한 표면 물 위에 무균 드레이프 각 마우스를 배치하여 betadine와 70 % 알코올로 수술 준비 후 무균 조건을 유지한다. 가운, 멸균 장갑, 마스크를 사용하여 악기를 소독.
- 이소 플루 란의 2 % 흡입을 사용하여 마우스를 마취. 마취 동안 건조 함을 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. , 근육, 발가락 핀치, 각막 반사와 점막의 색을 호흡 수를 관찰하여 마취의 적절한 수준을 평가합니다. 오른쪽 무릎에 수술 부위 구멍 무균 수술 드레이프와 마우스를 포함한다. 마우스를 마취 동안 체온을 유지하기 위해지지 가열 수단을 얻어야한다. 따뜻한 물 재킷 담요 또는 하드 플라스틱 가열 워크 스테이션 (ProStation, 패터슨, 과학)를 순환하는 물 순환 따뜻한 37 ° C의 물 저체온증을 방지하기 위해 좋은 방법입니다.
- buprenorph 주사오프라인 (서방 성 제제) (2.5 밀리그램 / kg)을 피하로 수술 직전. 진통을 위해 필요에 따라 서방 성 프레 노르 핀의 추가 접종 3 일 간격으로 투여 될 수있다.
- 수술 무릎을 면도하고 betadine 70 % 알코올을 사용하여 세 교류 스크럽을 사용하여 예비 학교.
- 오른쪽 무릎 관절을 덮고 피부에 중간 선 절개를 수행합니다. 신근기구가 잘 정의되도록 피부 절개를 연장한다.
- 내측 슬개골 arthrotomy을 수행하고 Adson 집게 측 방향으로 대퇴사 두근 - 슬개 건 신근 메커니즘을 sublux.
참고 :이 일반보기로 대퇴골 과간 노치을 제공합니다. - 수동으로 23 G 바늘 다음에 25 G 바늘을 사용하여 골수 관내를 리머.
주 : 대퇴골의 손상을 방지하기 위해, 안정화 플랫폼을 사용할 수있다. 이렇게 대퇴골 골절 사고를 최소화하는 기술에 중요 할 것이다. - 의료용 티타늄 Kirsc 삽입수동 골수 관내로 역행 방향으로, 핀 홀더를 사용하여 추진 수반 압입 방법을 사용하여 hner 와이어 (0.8 mm 직경).
참고 : 스테인레스 스틸 K-선 (16)에 비해 티타늄 K-와이어 μCT 이미지에서 본 적은 유물이 있었던 것에 티타늄 K-선을 사용 하였다. - K-와이어의 절단 끝이 약 1mm 무릎 관절 공간으로 확장되도록 핀 절단기 KIRSCHNER 와이어의 끝을 잘라.
- 마이크로 피펫, 피펫 생물 발광 S.의 1 × 103 CFU의 2 μl를 사용 무릎 관절 공간 내에서 임플란트의 끝 상 구균 Xen29.
참고 : 더 볼륨이 넓은 조직 오염을 덜 이산 영상에 연결됩니다.
참고 : 제어 감염되지 않은 쥐에서 박테리아 않고 멸균 생리 식염수 2 μl를 추가합니다. - 집게를 사용하여 중간 선을 다시 대퇴사 두근 - 슬개골 복합체를 줄이고 위에있는 피하 조직과 피부가 흡수하여 닫습니다subcuticular 봉합.
참고 :이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을했습니다 동물을 반환하지 않습니다. - 실험의 끝에, 존스 홉킨스 동물 보호 및 사용위원회의 지침에 따라 이산화탄소를 흡입하여 모든 동물을 안락사. 동물을 관찰하여 사망 확인 이산화탄소 노출 단부와 경추 탈구 후 10 분 이내에 회복하지 못한다.
3 차원 광학 이미징 (생체 내 생물 발광 및 형광 이미징)
- LysEGFP 마우스 (예 : 2 % 흡입 이소 플루 란을) 마취 및 영상 실에 최대 복부 측면에 배치합니다.
- 생체 촬상 시스템 IVIS 광 스펙트럼 전체 동물을 사용하는 생체 내 이미징 생물 발광을 수행한다. 첫째, 발광을 확인 오픈 (F)의 선택을 확정ilter 선택, 뷰 (FOV) C의 필드 - 13의 cm, 아래로 자동 (자동 노출 설정) 노출 시간을 스크롤합니다. 자동 노출 자동 포화를 피하면서 신호 강도를 최적화하기위한 획득 시간 (셔터 속도), 비닝 (디지털 픽셀 비닝), 그리고 악기의 F-스톱 (조리개)을 조정한다. 그런 생물 발광 이미지를 캡처 획득을 클릭합니다.
참고 : 생체 발광 생물 이미징 들어, 이미지를 마우스 1 사이 - 분 5. - 형광등 옆에있는 상자를 선택하여 생체 내 형광 이미징 순차적를 수행합니다. 465 nm의 여기 필터와 520 nm의 방출 필터를 선택합니다. 아래로 자동으로 노출 시간을 이동하고 FOV C (3.2.1 단계)를 선택합니다. 이어서 형광 이미지를 캡처 획득 클릭.
참고 : 생체 내 형광 이미징, 0.5 초 사이의 이미지를 마우스하십시오. - 제를 확대하여 생활 이미지 소프트웨어를 이용하여 이익 (ROI)의 영역에서의 생체 내 생물 발광 신호로서 전체 광속 (광자 / 초)를 정량화툴 팔레트의 ROI 도구 섹션.
- FOV에서 대상 동물의 수에 해당하는 원형 아이콘과 로아의 수를 선택합니다. 이자 즉의 영역을 포함하는 투자 수익 (ROI)의 크기를 조정, 생물 발광 확산 패턴이 수집.
- 도구 팔레트 및 ROI 측정 창에서 ROI 도구의 선택 측정 로아가 나타납니다. 전체 래디언스 (광자 / 초)의 값은 생성 된 ROI 내에 생물 발광 화소의 합을 나타낸다.
- SELECT ALL을 선택하고이 창 오른쪽 아래 구석에 COPY 탭 분석을 위해 후속 프로그램에 붙여 넣기 클립 보드에 정보를 전송하고 수 있습니다.
- 리빙 이미지 소프트웨어를 이용하여 이익 (ROI)의 원형 영역 내에 전체 방사 효율 등의 생체 내 형광 시그널 ([포톤 / 초] / [μW / cm 2]) 정량화.
- 생활 이미지 소프트웨어 창 내에서 도구 팔레트의 투자 수익 (ROI) 도구를 확장합니다. 선택동그라미 아이콘과 FOV에서 피사체 동물의 수에 대응 로아의 수.
- 이전 이미지 수집의 생물 발광 신호에 밀접하게 대응하는 관심 영역을 포함하는 ROI 크기를 조정합니다.
- 도구 팔레트 및 ROI 측정 창에서 ROI 도구의 선택 측정 로아가 나타납니다.
참고 : 총 방사 효율 ([광자 / s의] / [μW / cm 2])는 투자 수익 (ROI) 내에서 형광 픽셀의 합계를 나타냅니다. - 분석을위한 후속 프로그램에 붙여 넣기 클립 보드에 정보를 전송하고 수이 윈도우의 오른쪽 하단 모서리에 모든 및 복사 탭을 선택합니다.
4 μCT 이미지 인식
- 영상 실에 마취 LysEGFP 마우스를 놓습니다.
NOTE :이 촬상 챔버는 허용 IVIS 스펙트럼 영상 시스템 및 양자 FX 생체 μCT 이미징 시스템 모두에 적합하도록 설계광학 및 μCT 이미지의 공동 등록. - CT 소프트웨어를 열고 드롭 다운에서 동적 메뉴 미리 60mm의 FOV의 표준을 선택합니다.
- 대구경 커버와 기기에 영상 셔틀에 대한 어댑터 팔을 삽입합니다.
- 다음 구멍에 팔을 밀어 어댑터 팔에 마우스 영상 셔틀을 놓고 문을 닫습니다. 라이브 모드 (컨트롤 패널의 아이 버튼)을 켜고 X 캡처 창에서 동물을 중앙에 X 축과 Y 축 컨트롤을 사용하여 0 °와 90 ° 갠트리 위치에 피사체를 배치합니다. 그런 다음 눈 버튼을 클릭하여 라이브 모드를 해제합니다.
- (다음 라이브 모드 버튼에) CT 스캔 버튼을 클릭하여 60mm의 FOV로 동적 스캔 이미지를 획득. 나중에 액세스 할 수있는 위치에 DICOM 형식과 상점에서 획득 한 이미지를 보냅니다.
참고 : 대략적인 용량은 스캔 당 26 mGy의 것입니다. 더 나은 해상도를 원하는 경우 30mm의 FOV를 사용할 수있다.
5.3D 광학 이미지 인식, 형성과 μCT 공동 등록
- 이 인서트로 마우스를 포함하는 영상 셔틀을 배치하여 스펙트럼에 마우스 영상 셔틀 인서트를 놓고 마우스를 이동하지 않습니다 확인합니다.
- 생활 이미지를 사용하여 마법사 설치를 시작하기 위해 취득 제어판에서 이미징 마법사를 선택합니다. 시작하려면, 생물 발광, 다음 DLIT을 선택한 다음,이 경우 자동으로 500 선택됩니다 드롭 다운 메뉴와 모델에 적합한 배출 필터에서 기자 "박테리아"를 선택 - 620 nm의.
- 다음을 선택하고, 획득 매개 변수와 마지막 창에서 대상 정보를 지정합니다. 특히, 이미징 주제 마우스 것, 자동 설정 포화를 피하면서 신호 품질을 극대화하기 위해 자동 노출을 허용 선택하고,보기의 필드는 C로 설정됩니다 - 13cm.
- 선택 마지막 창에서 마침을 취득 패널의 순서 창이 될 것입니다utomatically DLIT 순서로 채워집니다. 이미징 마법사의 선택에 따라 각각의 파장에서 방출 선택 필터와 최적의 설정을 선택합니다 자동 노출 당 획득 한 이미지가있을 것입니다. 생성 순서는 아래에 자세히 설명 표면 지형 도구를 통해 대상 표면 생성에 필요한 구조화 된 빛 이미지가 포함되어 있습니다.
- DLIT 데이터를 수집하기 위해 획득 시퀀스를 선택합니다.
- 화상 취득이 완료되면, 표면 지형을 생성. 도구 팔레트에서 표면 지형 탭을 확장하여 시작합니다.
- 다음으로, 정확하게 IVIS 악기의 카메라 또는 상부 대향 동물의 측면을 반영 방향을 선택한다. 그런 다음 표면 생성을 클릭합니다. 동물을 포함 FOV의 영역을 자릅니다.
- 그리고 동물의 경계를 정의하는 보라색 마스크를 사용합니다.
참고 : 어두운 모피 피부와 동물의에서 적절하게 마스크되지 않도록 마스킹 도구는 색상 대비를 사용다케. - 마침을 선택하고 표면이 자동으로 나타납니다. 우리가 더 이상 필요하지 않습니다대로 탭을 닫으 표면 지형 탭에서 결과를 저장합니다.
- DLIT 3D 재건 탭을 확장하여 이미지 (22) 생활에 구현 된 확산 광 재구성 알고리즘을 사용하여 3D 광원의 위치를 재구성.
- DLIT 순서를 위해 획득 된 영상이 표시됩니다.
참고 : 소프트웨어가 자동으로 수집 된 데이터의 품질을 확인하고 이미지가 너무 어둡 것으로 간주 또는 채도가있는 경우 선택을 취소합니다. 하단 오른쪽에 시작을 선택합니다. - 필요한 경우, 한 번 누름으로써 각각의 생물 발광 이미지를위한 임계 값을 조정하고 하단 좌측 임계 슬라이더를 사용 할 수있다.
참고 :이 문제는 최종 복원 된 소스의 전반적인 강도를 조절할 수 있으므로 더 높은 임계 화 할 때 연습을해야합니다 낮은 신호 강도 및주의를 포함하는 중심이다.
- DLIT 순서를 위해 획득 된 영상이 표시됩니다.
- (왼쪽에서 세 번째) 소프트웨어의 맨 위에있는 도구 모음에서 3D 아이콘을 클릭하여 DICOM 브라우저를 열고 이전에 취득한 양자 FX 이미지를 검색합니다.
- 가져 오기를 위해 파일을 더블 클릭하여 생활 이미지 3D보기 탭에 이미지를로드합니다.
참고 : 기준점을 자동으로 감지하고 μCT 이미지가 발생한다은 3D 광학 이미지에 등록된다.
- 가져 오기를 위해 파일을 더블 클릭하여 생활 이미지 3D보기 탭에 이미지를로드합니다.
- 표면 탭에서 체크 박스 라벨 표시 주제 표면을 도구 팔레트에서 3D 광학 도구를 확장하고 취소하여 표면 지형 시각화 맵을 취소합니다.
- 수동으로 3D 멀티 Modali의 볼륨 탭에서 히스토그램을 사용하여 μCT 이미지에서 볼 수 있습니다 골격과 K-와이어 임플란트를 시각화하는 룩업 테이블을 생성툴 팔레트의 타이 도구 섹션.
- 히스토그램은 3D 용적의 데이터와 그 색 불투명도 복셀 강도의 분포를 나타낸다. 관심있는 특정 조직 히스토그램에 위치를 확인하기 위해 조직 될 때까지 임계 값과 렌더링을 슬라이더 도구를 사용하거나 구조를 볼 수 있습니다.
- 그리고 나서 오른쪽 포인트를 생성하고 히스토그램의 영역을 분리하기 위해 곡선을 형성하기 위해 히스토그램을 클릭. K-와이어 임플란트 다음 골격과 미래에 대한 조회 테이블 분석으로 저장할 수 있습니다 - 이것은 각각의 구조에 대해서 반복합니다.
- 구성 요소는 그렇게 두 번 클릭하여 히스토그램에 생성 된 모든 포인트를 원하는하고 팝업 창에서 원하는 색상을 선택하면 색상 코딩이 될 수 있습니다.
6 μCT 이미지 시각화 및 분석
- 양자 FX 소프트웨어를 사용하여 관심있는 이미지를 선택하고 뷰어를 실행합니다. 회전 도구를 선택하고 visuali 이미지를 바꾸거나 방향을대퇴골의 길이 방향 축선을 ZE. 측정 도구를 선택하고 대퇴골의 길이를 측정합니다.
- 3D 렌더링을 생성하는 3D 뷰어를 시작합니다. 임플란트 감염과 연관된 뼈의 해부학에서 변경 사항을 표시하도록 임계 값을 조정합니다.
- 3D 렌더링은 대퇴골에 대한 관심의 영역의 단면을 원하는 부분에 한정되도록 클리핑 평면 적용합니다.
- 분석 11.0 소프트웨어 패키지를 실행합니다. 3D 렌더링을 만드는 데 사용 된 * .VOX 파일을로드합니다.
- 이미지 계산기 도구를 시작합니다. (대퇴골을 포함하지 않는면을 제거) 이미지를 자르려면 '지역 패드'도구를 사용합니다.
- 사선 섹션 도구를 실행합니다. 대퇴골 대전 자부와 핀의 끝의 중간에 지점을 찾기 위해 3 점 옵션을 사용합니다. 이러한 점 경사면을 확인하고 새로운 조각 이미지를 생성합니다.
- 이자 도구의 지역을 시작합니다. transaxial 슬라이스를 표시합니다. 최소 및 최대 설정을 조정S는 피질골을 표시합니다. 대퇴골 원위부 25 %에 해당하는 슬라이스 (5 조각의 대략적인 간격으로) 여러 조각에 해당하는 조각에 대한 윤곽을 만들 수 있습니다. 이러한 윤곽 보간 관심의 3D 영역을 생성하기 위해 '전파 지역'도구를 사용합니다. 객체 맵으로 관심이 지역을 저장합니다.
- '샘플 옵션'도구를 실행합니다. 방금 만든 객체 맵에 대한 확인란을 선택하고 해당 옵션에 대한 라디오 버튼을 선택합니다. '볼륨'확인란이 선택되어 있는지 확인하기 위해 '구성 로그 통계'버튼을 클릭합니다. 실제 측정을 할 수있는 '샘플 이미지'버튼을 클릭합니다.
- 데이터 분석 프로그램으로 볼륨 측정 내보내기. 수식을 이용하여 상기 제 묘화 시점 나중에 시점부터 외측 뼈 부피를 정상화 : Δ 양 (%) =를 ([볼륨 (데이 X) - 양 (하루 2)] / [양 (하루 2)]) × 100 .
주 :이 수식에서, 변수 "X"는 관심의 시점을 나타낸다. 얻어진 수는 시간이 지남에 따라 원위 대퇴골의 외측 뼈 볼륨의 크기의 변화를 나타내는 것이다. - 뼈의 상단에 관심있는 3D 영역을 시각화하기 위해, '볼륨 렌더링'도구의 CT 이미지를로드합니다. 관심의 3D 영역을 포함하는 객체 맵을로드합니다. 'View''Objects'로 이동하여 '원본'이 '에서'로 설정합니다. '미리보기'창을 엽니 다. '렌더링 유형'메뉴를 실행하고 '개체 합성'을 선택합니다.
- '임계'버튼을 도구를 클릭하고 뼈와 객체의지도를 표시 할 임계 값을 조정합니다. 모든 시점에 대해 동일한 고정 된 임계 값 범위를 사용한다. '회전'버튼을 클릭하고 진정한 외측보기로 방향을 설정합니다. 최종 렌더링을 생성하는 '렌더링'을 클릭합니다. 주 '볼륨에서 렌더링을 저장'창을 렌더링합니다.
Representative Results
생체 생물 발광 및 형광 이미징
본 연구에서, 프로토콜은 관절로 대퇴골의 골수 관내에서 연장 티탄 K-와이어 임플란트 수술 위치를 포함 생쥐 14-19에서 정형 인공 관절 감염이 이전에 발행 된 모델에 대해 설명한다 공간이 14 ~ 19. S. 생물 발광 구균 균주 Xen29 (2 ㎕의 PBS에 1 × 103 CFU)는 조인트 전에 수술 부위 (16)를 폐쇄하여 무릎 단부 티타늄 임플란트의 상부에 직접 피펫 팅 하였다. 시각화 마취 LysEGFP 생쥐에 간접적으로 세균 부담 및 호중구 유입을 정량화하기 위해, 생체 내 동물 전체 광학 영상은 영상을 순차적으로 실시 하였다 IVIS 스펙트럼 광학 전체 동물을 사용 침윤 호중구에서 박테리아 생물 발광 신호와 EGFP 형광 신호 생체세 수술 후 일 (즉, 일 2, 14, 28)에 영상 시스템. Xen29 감염된 마우스의 생물 발광 신호는 실험 (도 1a, C) (16)의 지속 기간에 대한 모의 감염된 마우스의 배경 신호 위에 남아 있었다. 우리의 이전 연구는 생체 내 생물 발광 신호가 밀접 임플란트 (17, 18)에 관절 / 뼈 조직으로부터 분리 및 부착 생체 CFU의 수를 근사 것을 보여 주었다. 또한, EGFP 형광 신호는 이른 시점에서 모의 감염된 쥐보다 높았지만 감염 과정 (도 2B, C) 16시 배경 수준에 접근했다.
μCT 이미지와 함께 생체 내 광 신호의 3D 공동 등록
수술 후 무릎 관절의 해부학 적 상황에서 광 신호 (즉, 박테리아 생물 발광 및 형광 신호 EGFP)를 시각화하는 IN 차원, IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 생성 된 이미지는 광학 공동 등록 양자 FX μCT 이미징 시스템을 사용하여 생성 된 이미지와 함께 μCT이었다. 마우스 이미징 챔버는 쥐가 동일한 방향으로되었는지 확인하려면 다음 중 하나를 컴퓨터에 삽입 될 수 있기 때문에이 공동 등록을 수행 할 수 있습니다. 화상 획득이 동물의 신체 재배치 할 필요없이 하나의 장비로 두 양상을 통합 IVIS 스펙트럼 CT 생체 이미징 시스템을 사용하여 수행하여이 정확도를 확인하기 위해, 결과를 비교 하였다. 3D에서 μCT 이미지 상에 광 데이터를 매핑하기 위해, 우리는 확산 광 단층 촬영 재구성 알고리즘 (16)을 이용했다. 생성 된 3D 재구성 (동영상 1) 표시됩니다.
또한, μCT 이미징 동안 발생한 골 결과적 품질 변화 및 치수의 시각화 및 정량화를 허용감염 (그림 2) 16. 이전에보고 된 바와 같이, 대퇴골 원위부의 바깥 쪽 뼈의 부피는 실질적으로 시간 (그림 2A) 16 이상 증가했다. 이러한 변화를 정량화하기 위해, 3D 이미지 분석 부피는 대퇴골 보니 표면의 원위 25 %에서 수행하고, 시간이 지남에 따라 골 부피 변화는 초기 뼈 부피로 표준화했다. 외측 골 부피는 대략 모의 감염된 마우스 (도 2B)에 비해 16 감염된 마우스에서 증가 하였다. 대퇴골 바깥 쪽 뼈 볼륨의 증가로 인해 μCT 이미징 및 조직 학적 분석 (16)을 사용하여 관찰 하였다 관절 조직과 뼈의 감염에 의한 뼈의 손상 가능성이 있었다.
그림 1 차원 생체 생물 발광 및 형광 신호. S. 구균 Xen29 없거나 박테리아 (비감염)는 K-와이어 배치 및 LysEGFP 생쥐 IVIS 스펙트럼 이미징 시스템 (16)을 이용하여 촬상 된 후, 무릎 관절에 접종 하였다. (A) 평균 생체 내 생물 발광 신호를 전체 광속 (광자 / 초)에 의해 측정 ± SEM. (B) 평균 생체 EGFP 형광 신호를 총 방사 효율 (광자 / 초)로 측정 한 흑백 사진을 입혔다 생체 생물 발광 및 형광 신호의 SEM. (C) 대표 ± / (μW / cm 2) 마우스의 이미지입니다. 생체 촬상 생물 발광을 이용한 세균 부담의 검출 한계는 3 10 × 10 × 2 일 내지 1 CFU이다. * P <0.05, †의 P <0.01, ‡ p <가짜 감염된 생쥐에 비해 0.001 Xen29에 감염된 마우스 (학생의 t-테스트 [이 꼬리). 제발이 Xen29을 사용하여 생성 및 IVIS 루미나 XR 이미징 시스템 16 군데 이전에 발표 된 자료를 포함하는 대표적인 인물이다 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Xen29의 그림 2 3D μCT 영상. 황색 포도상 구균 Xen29 또는 전혀 박테리아 (감염되지 않은)이 K-선 배치 후 무릎 관절에 접종하고, 마우스는 양자 FX 생체 내 μCT 시스템을 사용하여 몇 군데 있었다. (A) 대표 3D μCT 렌더링 -infected 마우스 (상부 패널) 및 모의 감염된 마우스 (하부 패널). 초기 TI 정규화 외측 뼈 부피 변화 (원위 대퇴골의 25 %)의 (B) 백분율나 (± SEM을 의미)를 가리 킵니다. * P <0.05, †의 P <0.01, ‡ p <가짜 감염된 생쥐에 비해 0.001 Xen29에 감염된 마우스 (학생의 t-테스트 [이 꼬리). 이 생물 발광 균주 S.을 사용하여 생성 이전에 발표 된 자료를 포함하는 대표적인 인물이다 유의하시기 바랍니다 구균 Xen29은과 양자 FX 생체 내 μCT 이미징 시스템 16 군데. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 . 주제 μCT 3D 이미지와 조합 Xen29 생물 발광 신호와 EGFP-호중구 형광 신호의 해부학 적 공동 등록. 이미지는 수직축상에서 회전된다.
Discussion
같은 μCT 영상과 함께 생체 광학 영상에 활용 이미징 기술로 Multimodality 영상은 해부학 적 맥락 1-4 3D 시각화, 정량화 및 생물학적 프로세스의 길이 모니터링을 할 수있는 새로운 기술적 접근 방식을 제공합니다. 본 연구 프로토콜은 비 침습적으로 및 종 이상의 뼈에 세균 부담 호중구 염증 및 해부학 적 변화를 모니터하기 위해 마우스에서 정형 보철 임플란트 감염 모델에서 μCT 촬상 결합되는 방법을 생체 내 생물 발광 및 형광 영상의 자세한 정보를 제공 시간입니다. 이와 함께, 광학 및 구조 영상을 결합하여 얻은 정보는 특히 근육 - 골격에 영향을 미치는 생물학적 과정 및 병리학 적 조건을 연구하기에 매우 적합 될 수있는 중요한 기술적 진보를 나타냅니다.
한 관심지적되어야 보내고 발견은 우리가 EGFP-호중구 형광 신호 14-21일 의해 배경 레벨로 감소 및 생물 발광 박테리아의 존재에도 불구하고 실험 기간 동안 배경 레벨로 남아 있다는 것을 알 것이다. 우리가 비 조사 생쥐 19 호중구 신호 유사한 동역학 관찰 X 선 조사가 호중구 생존 영향 같지는 않다. 우리의 이전 연구에서 S.의 모델을 포함하는 구균 감염 상처, 호중구 침투 감염의 사이트가 로컬 호중구 23 성숙 야기 할 농양에 KIT + 전구 세포의 원점에서 순환에서 강력한 호중구 채용, 장기간 호중구 생존의 출진했습니다. 그것은 유사한 프로세스가 정형 외과 임플란트 S.에서 호중구의 침윤에 기여 가능성이 높습니다 구균 감염 모델입니다. 그것이 알려지지 않지만 호중구 신호 orthop 감소 이유aedic 감염 모델은,이 감염의 만성 감염에서 급성 진행이 미래 조사 될으로 면역 반응이 시간이 지남에 따라 변경 될 수 있음.
정형 외과 인공 관절 감염이 마우스 모델과 주목해야한다 생체 multimodality 이미징과 제한 사항이 있습니다. 첫째,이 마우스 모델은 인간 24에 정형 외과 수술에 사용 된 실제 절차와 재료의 지나친 단순화이다. 그럼에도 불구하고,이 모델은 인간의 정형 외과 임플란트 감염 8,9에서 볼 뼈와 관절 조직의 만성 감염과 계속되는 염증을 요점을 되풀이한다. 또한, μCT 이미지를 얻기 위해, X 선 조사의 비교적 낮은 투여 량은 감염 과정 중에 동물의 건강에 악영향을 최소화하기 위해 사용되었다. μCT 촬상에 사용될 수 뼈 나은 해상도, X 선 방사선의 고용량의 경우에 안락사nimals. 그러나,이 비 침습적으로 및 길이 방향의 실험 기간 동안 뼈의 변화를 모니터링 할 수있는 능력을 제거 할 것이다.
결론적으로, 해부학 μCT 영상과 생체 내 동물 전체 광학 영상의 조합을 포함 multimodality 이미징은 감염과 염증 반응에 대한보다 포괄적 인 정보를 허용하고 있습니다. 또한, 이들 기술은 뼈 및 관절 조직의 감염 및 염증의 영향의 평가를 허용했다. 우리는 14-18을 조사하기 시작했다로 미래 연구는 항균 요법, 면역 반응, 질병의 발병 기전과 뼈의 반응 변화의 효과를 평가하기 위해 multimodality 영상을 활용할 수 있습니다. 이전 동물 모델 대퇴부 감염 심내막염, 폐 감염에서 설명한 또한 multimodality 이미징 감염의 존재를 진단하는 프로브 및 트레이서를 평가할 수있다이온 및 생체 재료 감염 25 ~ 28. 마지막으로, multimodality 이미징의 사용은 같은 골격 암, 전이성 질환, 골절 및 관절염 5-7으로 영향을 미치는에게 다른 조건들에게 근골격계을 조사하기 위해 전염병을 넘어 확장 및 정형 외과, 류마티스 및 종양학을 포함하여 분야에 걸쳐 사용할 수 있습니다 .
Disclosures
JAM, BNT, EL, 뉴질랜드, KPF는 Xen29 생물 발광 S.을 제공, 영상 장비를 제조 퍼킨 엘머의 직원을 지불 구균 균주,이 비디오 문서의 출판 비용을 지불했다. 나머지 저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 (JAN에) H & H 리 외과 주민 연구 장학생 프로그램에 의해 지원되었다 AO 재단 스타트 업 보조금 S-12-03M (LSM에)와 (LSM에) 건강 보조금 R01-AI078910의 국립 연구소 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
| Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
| Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
| LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
| Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
| Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
| Wire Cutter - Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
| Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
| Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
| Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
| Quantum FX in vivo µCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | µCT in vivo imaging system | |
| IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and µCT in vivo imaging system | |
| Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |
References
- Dothager, R. S., et al. Advances in bioluminescence imaging of live animal models. Curr Opin Biotechnol. 20, 45-53 (2009).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging progress and applications. Trends Biotechnol. 29, 624-633 (2011).
- Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging current applications and future directions. J Nucl Med. 49, 1-4 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- Reumann, M. K., Weiser, M. C., Mayer-Kuckuk, P. Musculoskeletal molecular imaging a comprehensive overview. Trends Biotechnol. 28, 93-101 (2010).
- Snoeks, T. J., Khmelinskii, A., Lelieveldt, B. P., Kaijzel, E. L., Lowik, C. W. Optical advances in skeletal imaging applied to bone metastases. Bone. 48, 106-114 (2011).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Del Pozo, J. L., Patel, R. Clinical practice. Infection associated with prosthetic joints. N Engl J Med. 361, 787-794 (2009).
- Parvizi, J., Adeli, B., Zmistowski, B., Restrepo, C., Greenwald, A. S. Management of periprosthetic joint infection the current knowledge AAOS exhibit selection. J Bone Joint Surg Am. 94, e104 (2012).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Speziale, P., Montanaro, L., Costerton, J. W. Biofilm formation in Staphylococcus implant infections. A review of molecular mechanisms and implications for biofilm-resistant materials. Biomaterials. 33, 5967-5982 (2012).
- Zimmerli, W., Moser, C. Pathogenesis and treatment concepts of orthopaedic biofilm infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 158-168 (2012).
- Cram, P., et al. Total knee arthroplasty volume utilization and outcomes among Medicare beneficiaries 1991-2010. JAMA. 308, 1227-1236 (2012).
- Wolf, B. R., Lu, X., Li, Y., Callaghan, J. J., Cram, P. Adverse outcomes in hip arthroplasty long-term trends. J Bone Joint Surg Am. 94, (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5, (2010).
- Bernthal, N. M., et al. Protective role of IL-1beta against post-arthroplasty Staphylococcus aureus infection. J Orthop Res. 29, DOI. 1621-1626 (2011).
- Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and µCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS ONE. 7, e47397 (2012).
- Niska, J. A., et al. Daptomycin and tigecycline have broader effective dose ranges than vancomycin as prophylaxis against a Staphylococcus aureus surgical implant infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 56, 2590-2597 (2012).
- Niska, J. A., et al. Vancomycin-Rifampin Combination Therapy has Enhanced Efficacy Against an Experimental Staphylococcus aureus Prosthetic Joint Infection. Antimicrob Agents Chemother. 57, 5080-5086 (2013).
- Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. J Orthop Res. 30, 335-340 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Direct continuous method for monitoring biofilm infection in a mouse model. Infect Immun. 71, 882-890 (2003).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007 (2007).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117, 3343-3352 (2011).
- Deirmengian, C. A., Lonner, J. H. What's new in adult reconstructive knee surgery. J Bone Joint Surg Am. 94, 182-188 (2012).
- Ning, X., et al. Maltodextrin-based imaging probes detect bacteria in vivo with high sensitivity and specificity. Nat Mater. 10, 602-607 (2011).
- Panizzi, P., et al. In vivo detection of Staphylococcus aureus endocarditis by targeting pathogen-specific prothrombin activation. Nat Med. 17, 1142-1146 (2011).
- van Oosten, M., et al. Realtime in vivo imaging of invasive and biomaterial associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nat Commun. 4, 2584 (2013).
- Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous beta lactamase reporter enzyme fluorescence in live mice. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 12239-12244 (2010).
