Summary
الجمع بين التصوير الضوئي وμCT في نموذج الفأر العدوى زرع العظام، وذلك باستخدام إضاءة الحيوية سلالة هندسيا من المكورات العنقودية الذهبية، شريطة القدرة على noninvasively طوليا ومراقبة ديناميات عدوى بكتيرية، فضلا عن الاستجابة الالتهابية المقابلة والتغيرات التشريحية في العظام.
Abstract
وقد برز التصوير Multimodality كنهج التكنولوجي شيوعا في كل من البحوث قبل السريرية والسريرية. التقنيات المتقدمة التي تجمع في التصوير الضوئي وμCT فيفو تسمح التصور من الظواهر البيولوجية في سياق التشريحية. قد تكون هذه الطرائق التصوير مفيدا بشكل خاص لدراسة الظروف التي عظم تأثير. على وجه الخصوص، والتهابات زرع العظام هي مشكلة هامة في جراحة العظام السريرية. هذه الالتهابات هي صعبة لعلاج بسبب الأغشية الحيوية البكتيرية تشكل على المواد الأجنبية مزروع جراحيا، مما يؤدي إلى التهاب مستمر، التهاب العظم والنقي وعظام النهايات نهاية المطاف العظم المحيطة الزرع، مما يؤدي في النهاية إلى تخفيف الزرع والفشل. هنا، تم استخدام نموذج الفأر من زرع العظام الاصطناعية المصابة التي تنطوي على وضع الجراحي لزرع أسلاك كيرشنر إلى القناة داخل النقي في عظم الفخذ في مثل هذه الطريقة أن نهاية الغرسة الإلكترونيةxtended في مفصل الركبة. في هذا النموذج، الفئران LysEGFP، سلالة الفأر الذي لديه العدلات EGFP-الفلورسنت، وكانوا يعملون جنبا إلى جنب مع سلالة المكورات العنقودية الذهبية للإضاءة الحيوية التي تنبعث ضوء طبيعي. تم تلقيح البكتيريا في مفاصل الركبة من الفئران قبل إغلاق موقع الجراحية. إضاءة الحيوية في الجسم الحي واستخدمت التصوير الفلورسنت لقياس عبء الاستجابة الالتهابية البكتيرية والمتعادلة، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، تم تنفيذ μCT التصوير على نفس الفئران بحيث موقع 3D للإضاءة الحيوية والإشارات الضوئية الفلورية يمكن أن يشترك المسجلة مع الصور μCT التشريحية. لقياس التغيرات في العظام مع مرور الوقت، تم قياس حجم العظام الخارجي للعظام الفخذ البعيدة في نقطة زمنية محددة باستخدام كفاف تستند عملية تقسيم شبه الآلي. أخذت معا، فإن الجمع بين إضاءة الحيوية في الجسم الحي / التصوير الفلورسنت مع μCT التصوير قد يكون مفيدا بشكل خاص وأو رصد موسع للعدوى، الاستجابة الالتهابية والتغيرات التشريحية في العظام مع مرور الوقت.
Introduction
Multimodality تقنيات التصوير قبل السريرية التي تنطوي على مزيج من المعلومات البصرية والتشريحية تسمح التصور ورصد الظواهر البيولوجية في 3D 1-4. منذ μCT التصوير يسمح التصور رائعة من تشريح العظام، وذلك باستخدام μCT التصوير بالتزامن مع التصوير الضوئي من يمثل مزيجا فريدا التي قد تكون مفيدة بشكل خاص للعمليات التي تنطوي البيولوجيا العظام 5-7 التحقيق. على سبيل المثال سيكون لاستخدام هذه التقنيات لدراسة التهابات زرع العظام، والتي تمثل إحدى المضاعفات الكارثية التالية العمليات الجراحية للعظام 8،9. البكتيريا تشكل الأغشية الحيوية على الأجسام الغريبة المزروعة التي تعزز بقاء البكتيريا عن طريق بمثابة حاجز مادي يمنع الخلايا المناعية من الاستشعار العدوى وكتل المضادات الحيوية البكتيريا من الوصول إلى 10،11. العدوى المزمنة والمستمرة للأنسجة المشتركة (التهاب المفاصل الصرف الصحي) لد العظام (التهاب العظم والنقي) يدفع ارتشاف العظم الذي يؤدي إلى تخفيف من بدلة و8،9 في نهاية المطاف الفشل. ويرتبط هذا الناتج عظام النهايات periprosthetic مع زيادة معدلات الاعتلال والوفيات 12،13.
في عمل مسبق لدينا، كانت تستخدم للإضاءة الحيوية في الجسم الحي والتصوير الفلورسنت مع الأشعة السينية والتصوير المقطعي-احتساب الدقيقة (μCT) في نموذج الاصطناعية عدوى مشتركة العظام في الفئران 14-19. شارك هذا النموذج وضع أسلاك التيتانيوم كيرشنر (K أسلاك) بطريقة أن نهاية قطع من زرع الموسعة في مفصل الركبة من عظام الفخذ من الفئران 14-19. ثم pipetted لقيحة من المكورات العنقودية الذهبية (سلالة إضاءة الحيوية Xen29 أو Xen36) على سطح الغرسة في مفصل الركبة قبل تم إغلاق موقع الجراحية 14-19. كانت تستخدم في الجسم الحي التصوير الضوئي للكشف وتحديد اشارات للإضاءة الحيوية التي تتوافق مع نوmber من البكتيريا في العظام المصابة المشتركة والأنسجة 14-19. بالإضافة إلى ذلك، في الجسم الحي مضان التصوير من الفئران LysEGFP، التي تمتلك العدلات الفلورسنت 20، تم استخدامها لتحديد أعداد العدلات أن هاجر إلى مفاصل الركبة المصابة التي تحتوي على يزرع K-سلك 14،19. أخيرا، طرائق التصوير التشريحية، بما في ذلك عالية الدقة التصوير بالأشعة السينية والتصوير μCT، يسمح 2D و 3D المعنية التصوير التشريحي العظام المتضررة خلال كامل مدة العدوى المزمنة، وهو ما سينهي تعسفا عادة ما بين 2 و 6 أسابيع بعد العملية الجراحية 16 18. باستخدام هذا النموذج، وفعالية العلاج المضادة للميكروبات المحلية والنظامية، استجابات مناعية واقية والتغيرات التشريحية المرضية في العظام يمكن تقييم 14-18. في هذه المخطوطة، وقدمت بروتوكولات مفصلة لطرائق التصوير البصرية وμCT في هذا النموذج الاصطناعية عدوى مشتركة العظام باعتباره representatiلقد نظام لدراسة العمليات البيولوجية في سياق التشريحية للعظام. وتشمل هذه العمليات الجراحية لنموذج عدوى مشتركة الاصطناعية العظام في الفئران، 2D و 3D في إجراءات التصوير الضوئي الجسم الحي (للكشف عن إشارات للإضاءة الحيوية البكتيرية وإشارات الفلورسنت العدلات)، μCT اكتساب التصوير والتحليل وشارك في تسجيل الصور 3D البصرية مع الصور μCT.
Protocol
بيان الأخلاق: تم التعامل مع جميع الحيوانات بما يتفق تماما مع الممارسة الحيوانية جيدة كما هو محدد في الأنظمة الاتحادية المنصوص عليها في قانون رعاية الحيوان (AWA)، ودليل عام 1996 بشأن رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وسياسة PHS عن الرفق بالحيوان الرعاية وتمت الموافقة على استخدام الحيوانات المختبرية وجميع أعمال الحيوانية رعاية الحيوان جونز هوبكنز واستخدام جنة (بروتوكول #: MO12M465).
1. البكتيريا للإضاءة الحيوية تحضير اللقاح من منتصف لوغاريتمي
- خط إضاءة الحيوية S. الذهبية سلالة Xen29 (أو سلالة bioluminscent آخر مثل Xen36) على لوحات أجار الصويا زيتية (مرق الصويا زيتية في أجار [1.5٪]).
ملاحظة: S. الذهبية Xen29 21 هو S. المعدلة وراثيا السلالة الذهبية التي تحتوي على الاوبرون لوكس تعديل المستمدة من Photorhabdus luminescens و التي تتكامل في البلازميد الأصلي مستقر وجدت في هذه السلالة البكتيرية. هذه المحركالبكتيريا الدو ينبعث ضوء جوهري من خلايا حية ونشطة عملية الأيض. - تنمو المستعمرات على لوحات التي تفرخ لهم عند 37 درجة مئوية لمدة حوالي 16 ساعة (O / N).
- تحديد CFU البكتيرية واحد والثقافة في هز TSB السائل (240 دورة في الدقيقة) لمدة حوالي 16 ساعة (O / N).
- إجراء ثقافة فرعية مع 1/50 التخفيف من O / N الثقافة للحصول على منتصف البكتيريا لوغاريتمي مرحلة النمو (مدة ما يقرب من 2 ساعة).
- بيليه، في resuspend ويغسل البكتيريا 3X في برنامج تلفزيوني.
- تقدير قائح البكتيري (1 × 10 3 كفو في 2 ميكرولتر PBS) من خلال تحديد الامتصاصية الكثافة البصرية في 600 نانومتر.
- التحقق من كفو في اللقاح بعد زراعة البكتيريا O / N على لوحات.
2. ماوس العمليات الجراحية
ملاحظة: للحصول على هذه التجربة، واستخدام الاثني عشر أسبوعا من العمر الفئران الذكور LysEGFP. هذه الفئران تمتلك تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) معربا عن خلايا الدم النخاعي (والتي تتكون من مostly العدلات) 20. الحفاظ على ظروف معقمة أثناء الجراحة وبعد الجراحة مع بيتادين الإعدادية و 70٪ كحول من خلال وضع كل الماوس على ثنى العقيمة على قمة المياه السطحية من الصعب تعميم سادة التدفئة. استخدام ثوب، قفازات معقمة، وقناع وتعقيم الأدوات.
- تخدير الماوس باستخدام استنشاق 2٪ من الأيزوفلورين. استخدام مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. تقييم مستوى مناسب من التخدير خلال مراقبة معدل التنفس والعضلات، قرصة أخمص قدميه، منعكسة القرنية ولون الأغشية المخاطية. تغطية الفئران مع ثنى الجراحية المعقمة مع وجود ثقب في موقع عملية جراحية في الركبة اليمنى. الماوس يجب الحصول على التدفئة تدابير داعمة للحفاظ على درجة حرارة الجسم بينما تحت التخدير. دافئ 37 ° C المياه المنتشرة في المياه تغلف بطانية دافئة أو تعميم الماء من الصعب محطة ساخنة البلاستيك (ProStation، باترسون والعلم) من الطرق الجيدة لمنع انخفاض حرارة الجسم.
- حقن buprenorphالمعهد الوطني للإحصاء (صياغة المطرد الافراج عن) (2.5 ملغ / كلغ) تحت الجلد فقط قبل الجراحة. يمكن أن تدار جرعات إضافية من المطرد الافراج عن البوبرينورفين على 3 فترات يوميا حسب الحاجة لتسكين الألم.
- يحلق الركبة المنطوق والإعدادية باستخدام ثلاثة الدعك بالتناوب باستخدام بيتادين و 70٪ كحول.
- إجراء شق خط الوسط في الجلد المغطي الصحيح مفصل الركبة. تمديد شق الجلد بحيث تكون آلية الباسطة يمكن تعريفها أيضا.
- إجراء بضع المفصل المحيط بالرضفة وسطي وsublux عضلات الفخذ الرضفي-آلية وتر الباسطة أفقيا مع ملقط أدسون.
ملاحظة: هذا يجلب الثلمة بين عظم الفخذ في طريقة العرض عادي. - ماعون من الورق يدويا القناة داخل النقي باستخدام إبرة 25 G تليها إبرة 23 G.
ملاحظة: لتجنب الأضرار التي لحقت الفخذ، منصة استقرار يمكن استخدامها. هذا ينبغي أن يكون مهما للتقنية للحد من وجود كسر عرضي من عظم الفخذ. - إدراج التيتانيوم Kirsc الطبية الصفhner الأسلاك (0.8 مم) باستخدام تقنية الصحافة مناسبا، مما يستلزم دفع يدويا باستخدام حامل دبوس، في اتجاه الوراء في القناة داخل النقي.
ملاحظة: استخدمت التيتانيوم K-الأسلاك كما كان هناك عدد أقل من القطع الأثرية نشاهد في الصور μCT مع التيتانيوم K-الأسلاك مقارنة مع الفولاذ المقاوم للصدأ K-16 أسلاك. - قطع نهاية كيرشنر سلك مع قطع دبوس حتى نهاية قطع من K-سلك تمتد حوالي 1 ملم في الفضاء مفصل الركبة.
- باستخدام micropipette، ماصة 2 ميكرولتر من 1 × 10 3 كفو للإضاءة الحيوية S. الذهبية Xen29 على غيض من زرع داخل فضاء مشترك الركبة.
ملاحظة: عن حجم الأنسجة يؤدي إلى تلوث أوسع وأقل التصوير منفصلة.
ملاحظة: في الفئران غير المصابة السيطرة، إضافة 2 ميكرولتر من المياه المالحة عقيمة دون أي بكتيريا. - تقليل مجمع عضلات الفخذ الرضفي-إلى الخط المتوسط باستخدام ملقط وإغلاق الأنسجة تحت الجلد المغطي والجلد باستخدام امتصاصالغرز تحت البشرة.
ملاحظة: لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية. لا عودة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. - في نهاية التجارب، الموت الرحيم جميع الحيوانات استنشاق ثاني أكسيد الكربون باستخدام وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة جونز هوبكنز. التحقق من الموت من خلال مراقبة الحيوانات فشل لاسترداد في غضون 10 دقيقة بعد انتهاء التعرض ثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم.
3. 2D التصوير الضوئي (إضاءة الحيوية في الجسم الحي والتصوير نيون)
- LysEGFP تخدير الفئران (مثلا 2٪ استنشاق الأيزوفلورين) ووضعها مع الجانب البطني تصل إلى غرفة التصوير.
- أداء في الجسم الحي باستخدام التصوير Bioluminescent الحيوان كله IVIS الطيف الضوئي في نظام التصوير الجسم الحي. أولا، تحقق الفلورسنت وتأكيد خيار لو المفتوحةإلتر الاختيار، ومجال الرؤية (فوف) C - 13 سم، وانتقل زمن التعرض الى السيارات (الإعداد autoexposure). سوف Autoexposure ضبط اكتساب الوقت (سرعة مصراع)، binning (binning بكسل الرقمي)، وو توقف (فتحة) من أداة لتحسين كثافة إشارة مع تجنب التشبع تلقائيا. ثم انقر فوق اكتساب لالتقاط صورة للإضاءة الحيوية.
ملاحظة: بالنسبة للإضاءة الحيوية في الجسم الحي والتصوير، والفئران صورة بين 1 - 5 دقائق. - أداء متتابعة في الجسم الحي التصوير فلوري عن طريق التحقق من مربع بجوار نيون. اختيار 465 نانومتر تصفية الإثارة و 520 نانومتر تصفية الانبعاثات. انتقل زمن التعرض الى السيارات وحدد FOV C (الخطوة 3.2.1). ثم انقر فوق اكتساب لالتقاط صورة مضان.
ملاحظة: لفي الجسم الحي الفلورسنت التصوير والفئران صورة بين 0.5 ثانية. - قياس للإضاءة الحيوية في الجسم الحي إشارات وإجمالي تدفق (الفوتونات / ثانية) في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) باستخدام المعيشة البرمجيات صورة من خلال توسيع أولاقسم أدوات العائد على الاستثمار لوحة أداة.
- حدد أيقونة الدائرة وعدد رويس التي تتوافق مع عدد الحيوانات تخضع في فوف. تغيير حجم العائد على الاستثمار لتشمل المنطقة من أي مصلحة، ونمط انتشار للإضاءة الحيوية التي جمعها.
- سوف تختار رويس قياس العائد على الاستثمار في أدوات في لوحة أداة وقياس العائد على الاستثمار النافذة تظهر. إجمالي التألق (الفوتونات / ثانية) القيم تمثل مجموع بكسل للإضاءة الحيوية داخل العائد على الاستثمار الذي تم إنشاؤه.
- اختر SELECT ALL وسوف علامات التبويب نسخ في أسفل الزاوية اليمنى من هذه الانتقالات المعلومات إلى الحافظة والسماح اللصق في البرامج اللاحقة للتحليل.
- تحديد إشارات الفلورسنت في الجسم الحي كما الإجمالية كفاءة مشع ([الفوتونات / ثانية] / [μW / سم 2]) داخل منطقة دائرية ذات الاهتمام (ROI) باستخدام المعيشة البرمجيات صورة.
- ضمن إطار البرنامج صورة حية، قم بتوسيع أدوات العائد على الاستثمار في لوحة أداة. حددأيقونة الدائرة وعدد رويس والتي تتطابق مع عدد من الحيوانات تخضع في فوف.
- تغيير حجم العائد على الاستثمار لتشمل المنطقة من اهتمام الموافق ارتباطا وثيقا إشارة للإضاءة الحيوية من الحصول على الصور السابقة.
- سوف تختار رويس قياس العائد على الاستثمار في أدوات في لوحة أداة وقياس العائد على الاستثمار النافذة تظهر.
ملاحظة: مجموع الكفاءة مشع ([الفوتونات / ث] / [μW / سم 2]) يمثل مبالغ بكسل الفلورسنت داخل العائد على الاستثمار. - حدد كافة ونسخ علامات التبويب في أسفل الزاوية اليمنى من هذه النافذة ونقل المعلومات إلى الحافظة والسماح اللصق في البرامج اللاحقة للتحليل.
4. μCT الحصول على الصور
- وضع الفئران LysEGFP تخدير إلى غرفة التصوير.
ملاحظة: تم تصميم هذه الغرفة لتناسب التصوير في كل من نظام التصوير IVIS الطيف وFX الكم في الجسم الحي μCT نظام التصوير للسماحشارك تسجيل من الصور البصرية وμCT. - فتح برنامج CT وحدد القائمة مسبقا 60 ملم FOV الأمراض المنقولة جنسيا الديناميكي من القائمة المنسدلة.
- إدراج غطاء تجويف كبير والذراع محول للمكوك التصوير في الصك.
- وضع المكوك التصوير الماوس إلى الذراع محول ثم دفع الذراع في تجويف وإغلاق الباب. بدوره على الوضع ايف (زر عين على لوحة التحكم) ووضع الموضوع في 0 ° و 90 ° موقف العملاقة باستخدام المحور السيني والمحور Y ضوابط لتوسيط الحيوان في الإطار التقاط X. ثم إيقاف تشغيل الوضع ايف بالضغط على زر العين.
- الحصول على صورة المسح الضوئي الديناميكي مع 60 ملم FOV عن طريق النقر على زر المسح الضوئي CT (بجانب زر الوضع لايف). تصدير صورة المكتسبة في شكل DICOM وتخزينها في موقع يمكن الوصول إليها في وقت لاحق.
ملاحظة: سوف تكون الجرعة التقريبية 26 ملل جراى في المسح الضوئي. ويمكن استخدام 30 ملم FOV إذا كان المطلوب قرار أفضل.
5.3D اقتناء الصورة البصرية، وتشكيل μCT المشارك تسجيل
- وضع المكوك إدراج التصوير الماوس في الطيف عن طريق وضع المكوك التصوير التي تحتوي على الماوس في هذه إدراج وضمان الماوس لا يتحرك.
- استخدام الصورة الحية، حدد معالج التصوير في لوحة التحكم اقتناء لبدء الإعداد المعالج. للبدء، واختيار ضوء بارد، ثم DLIT، ثم حدد مراسل "البكتيريا" من القائمة المنسدلة والمرشحات الانبعاثات المناسبة للنموذج سيتم اختيار تلقائيا، في هذه الحالة، 500-620 نانومتر.
- حدد التالي، ثم تعيين المعلمات اقتناء وتخضع المعلومات في الإطار النهائي. على وجه التحديد، سوف يكون موضوع التصوير ماوس، سيتم اختيار إعدادات السيارات autoexposure السماح لتعظيم جودة الإشارة مع تجنب التشبع، وسيتم تعيين مجال الرؤية إلى C - 13CM.
- سوف أنهي حدد في الإطار النهائي ونافذة تسلسل الفريق اقتناء يكونutomatically بالسكان مع تسلسل DLIT. سوف يكون هناك صورة واحدة المكتسبة في اختيار مرشح الانبعاثات وautoexposure سوف يختار الإعدادات المثلى في كل الطول الموجي حسب التحديدات معالج التصوير. يتضمن تسلسل ولدت أيضا صورة ضوء المهيكلة اللازمة لتوليد سطح الموضوع من خلال أداة تضاريس سطح المفصلة أدناه.
- تحديد تسلسل اكتساب للحصول على البيانات DLIT.
- بعد الحصول على الصور كاملة، وتوليد تضاريس السطح. تبدأ من خلال توسيع علامة التبويب تضاريس سطح تحت لوحة أداة.
- بعد ذلك، حدد التوجه الذي يعكس بدقة جانب الحيوانات التي تواجه الكاميرا أو أعلى الصك IVIS. ثم انقر فوق إنشاء السطحية. المحاصيل في المنطقة لفوف الذي يحتوي على الحيوانات.
- ثم استخدم قناع الأرجواني لتحديد حدود الحيوان.
ملاحظة: أداة تستخدم اخفاء تباين الألوان لذلك سوف الحيوانات ذات الفراء أو جلد مظلم لا قناع مناسب من قالمئوية. - اختر إنهاء وستظهر على السطح تلقائيا. حفظ النتيجة تحت علامة التبويب تضاريس السطح ثم إغلاق علامة التبويب ونحن سوف لم تعد في حاجة إليها.
- إعادة بناء موقف 3D مصدر ضوئي باستخدام خوارزميات إعادة الإعمار البصرية منتشر تنفيذها في العيش صورة 22 من خلال توسيع علامة التبويب DLIT 3D الإعمار.
- وتظهر الصور حيازتها لتسلسل DLIT.
ملاحظة: البرنامج تلقائيا يتحقق من جودة البيانات المكتسبة وسوف إلغاء الصور التي تعتبر قاتمة جدا أو حيث تشبع موجودا. حدد ابدأ على القاع الجانب الأيمن. - إذا لزم الأمر، يمكن للمرء أن ضبط عتبة لكل صورة إضاءة الحيوية عن طريق النقر المزدوج وباستخدام شريط التمرير العتبة في أسفل الجانب الأيسر.
ملاحظة: هذا هو أساسا لتشمل أقل كثافة إشارة والحذر يجب أن يمارس عندما العتبة أعلى لأن ذلك قد ضبط شدة الشاملة للمصدر بناؤها النهائي.
- وتظهر الصور حيازتها لتسلسل DLIT.
- فتح متصفح DICOM بالنقر على أيقونة 3D في شريط الأدوات في أعلى البرنامج (الثالث من اليسار) والبحث عن الصورة الكم FX المكتسبة سابقا.
- تحميل هذه الصورة في صورة حية 3D عرض التبويب عن طريق النقر المزدوج على ملف للاستيراد.
ملاحظة: يجب أن يتم الكشف عن تلقائيا وإيمانية ويؤدي في الصورة μCT تسجيلها مع الصورة البصرية 3D.
- تحميل هذه الصورة في صورة حية 3D عرض التبويب عن طريق النقر المزدوج على ملف للاستيراد.
- إلغاء تحديد خريطة تضاريس سطح التصور من خلال توسيع أدوات بصرية 3D في لوحة أداة وإلغاء تحديد خانة الاختيار عرض المسمى موضوع السطحية في علامة التبويب السطح.
- يدويا إنشاء جدول بحث لتصور الهيكل العظمي وزرع K-سلك التي هي واضحة في الصورة μCT باستخدام الرسم البياني تحت علامة التبويب حجم التداول في 3D متعدد Modaliتاي قسم أدوات من لوحة الأدوات.
- يمثل الرسم البياني توزيع كثافة فوكسل في البيانات الحجمي 3D والتعتيم ونها. لتحديد مكان الأنسجة معينة من الفائدة في الرسم البياني، استخدم أداة التمرير لعتبة التقديم حتى الأنسجة أو هيكل مرئيا.
- ثم انقر على الحق في الرسم البياني لتوليد نقاط وتشكيل منحنى لعزل هذه المنطقة من الرسم البياني. سوف تتكرر هذه لكل هيكل - هيكل عظمي تليها زرع K-الأسلاك ويمكن حفظها كصورة جدول بحث لمستقبل يحلل.
- يمكن أن يكون لون مكونات مشفرة إذا رغبت في ذلك عن طريق النقر المزدوج أي نقطة ولدت في الرسم البياني واختيار اللون المطلوب من النافذة المنبثقة.
6. μCT التصور صورة وتحليل
- باستخدام برنامج الكم FX، حدد الصورة من الفائدة وإطلاق عارض. حدد أداة تدوير وإعادة توجيه الصورة لvisualiزي المحور الطولي للعظم الفخذ. حدد أداة القياس وقياس طول عظم الفخذ.
- إطلاق عارض 3D لتوليد الاداءات 3D. ضبط عتبة لإظهار التغيرات في تشريح العظام المرتبطة عدوى الزرع.
- تطبيق لقطة الطائرات بحيث جعل 3D يقتصر على قسم مستعرضة المطلوب من مساحة الفائدة في عظم الفخذ البعيدة.
- إطلاق حزمة برامج تحليل 11.0. * تحميل ملف .VOX الذي تم استخدامه لإنشاء تقديم 3D.
- إطلاق أداة حاسبة صورة. استخدام الأداة "منطقة الوسادة" لاقتصاص صورة (إزالة الطائرات التي لا تشمل عظم الفخذ).
- إطلاق أداة أقسام مائلة. استخدام الخيار 3 نقاط لإيجاد نقاط في منتصف الفخذ، وزيادة المدور ونهاية دبوس. جعل هذه النقاط طائرة منحرف وتوليد صورة مع شرائح جديدة.
- إطلاق أداة منطقة الفائدة. عرض شرائح عمودي على المحور. ضبط دقيقة وتحديد الحد الأقصىق لعرض العظم القشري. خلق ملامح لشرائح المقابلة لعدة شرائح (مع فاصل زمني تقريبي من 5 شرائح) لشرائح المقابلة لالبعيدة 25٪ من عظم الفخذ. استخدام أداة "الأقاليم نشر" أن أقحم بين هذه المخططات وإنشاء المنطقة 3D المصالح. حفظ هذه المنطقة من اهتمام باعتبارها خريطة الكائن.
- إطلاق أداة "خيارات عينة. حدد خانة الاختيار لخريطة الكائن الذي تم إنشاؤه للتو وحدد أزرار الاختيار للخيارات المناسبة. انقر على زر "تكوين الإحصائيات دخول" للتأكد من أن يتم تحديد "حجم" مربع. انقر على زر "عينة صور لتصبح القياسات الفعلية.
- تصدير قياسات حجم في برنامج تحليل البيانات. تطبيع حجم العظم الخارجي من نقطة زمنية لاحقة إلى أول نقطة زمنية تصويرها باستخدام الصيغة: حجم Δ (٪) = ([حجم التداول (اليوم العاشر) - المجلد (يوم 2)] / [حجم التداول (يوم 2)]) × 100 .
ملاحظة: في هذه الصيغة، "X" متغير يمثل نقطة زمنية من الفائدة. فإن عدد الناتج يمثل التغير في حجم حجم العظم الخارجي من الفخذ البعيدة مع مرور الوقت. - لتصور المنطقة 3D الفائدة على رأس العظم، تحميل صورة CT في 'حجم التحميل "أداة. تحميل خريطة الكائن الذي يحتوي على منطقة 3D المصالح. اذهب إلى 'View''Objects' ومجموعة 'الأصل' لتكون 'على'. فتح الإطار "معاينة". إطلاق قائمة 'تجعل أنواع' وحدد 'التركيب كائن.
- انقر على زر 'عتبة' و أداة وضبط عتبات لإظهار خريطة العظام والكائن. استخدام نفس نطاق عتبة ثابتة لجميع نقاط الوقت. انقر على زر 'التناوب' وتعيين اتجاه لتكون وجهة نظر أمامي جانبي صحيح. انقر على "تجسيد" لتوليد التقديم النهائي. حفظ جعل من 'حجم الرئيسيتقديم "نافذة.
Representative Results
إضاءة الحيوية في الجسم الحي والتصوير الفلورسنت
في هذه الدراسة، يوصف بروتوكول لهذا النموذج نشرت سابقا على وجود عدوى مشتركة الاصطناعية العظام في الفئران 14-19، الذي ينطوي على التنسيب الجراحية من التيتانيوم K-سلك الزرع الذي يمتد من القناة داخل النقي في عظم الفخذ في المفصل مساحة 14-19. S. كان pipetted الذهبية سلالة إضاءة الحيوية Xen29 (1 × 10 3 كفو في 2 ميكرولتر PBS) مباشرة على رأس زرع التيتانيوم نهاية في مفصل الركبة قبل إغلاق موقع الجراحية 16. لتصور وقياس العبء والعدلات البكتيرية تدفق noninvasively في الفئران LysEGFP تخدير، أجريت في الجسم الحي كله التصوير الضوئي الحيوان إلى بالتسلسل صورة إشارات إضاءة الحيوية من البكتيريا والإشارات EGFP الفلورسنت من العدلات التسلل باستخدام الحيوان كله IVIS الطيف الضوئي في فيفونظام التصوير ثلاثة أيام بعد الجراحة (أي، أيام 2 و 14 و 28). ظلت إشارات إضاءة الحيوية من الفئران المصابة Xen29 فوق إشارات خلفية الفئران المصابة صورية لمدة التجربة (الشكل 1A، C) 16. أظهرت عملنا السابق أن للإضاءة الحيوية في الجسم الحي إشارات يقترب عن كثب أعداد فيفو السابقين كفو معزولة عن المفصل / النسيج العظمي وتمسكا يزرع 17،18. وبالإضافة إلى ذلك، كانت إشارات EGFP الفلورسنت أعلى من الفئران المصابة صورية في نقاط زمنية مبكرة ولكن اقتربت مستويات الخلفية أثناء الإصابة (الشكل 2B، C) 16.
3D شارك تسجيل الإشارات الضوئية في الجسم الحي مع الصور μCT
لتصور الإشارات الضوئية (أي إضاءة الحيوية البكتيرية وEGFP إشارات الفلورسنت) في سياق التشريحي للمفاصل الركبة بعد الجراحة طن 3D، وكانت الصور البصرية إنشاؤها باستخدام نظام التصوير IVIS الطيف شارك في تسجيلها مع الصور μCT إنشاؤها باستخدام نظام التصوير الكم FX μCT. يمكن إنجاز هذا المشارك التسجيل لغرفة التصوير الماوس يمكن إدراجها في أي جهاز للتأكد من أن الفئران كانت في نفس الاتجاه المحدد. للتحقق من دقة هذا، وتمت مقارنة النتائج مع الحصول على الصور أجريت باستخدام IVIS الطيف-CT في الجسم الحي نظام التصوير يدمج كلا طرائق في صك واحد دون الحاجة إلى الانتقال المادي للحيوان. لتعيين البيانات البصرية على الصور μCT في 3D، ونحن الاستفادة من منتشر التصوير المقطعي البصري خوارزمية إعادة الإعمار 16. يظهر إعادة الإعمار 3D الناتجة (فيلم 1).
بالإضافة إلى ذلك، μCT التصوير يسمح التصور النوعي والكمي للتغيرات اللاحقة في نوعية وأبعاد العظام التي وقعت خلالالعدوى (الشكل 2) 16. كما ذكرت سابقا، زاد حجم العظم الخارجي من الفخذ البعيدة بشكل كبير على مر الزمن (الشكل 2A) 16. لتحديد هذه التغييرات، تم إجراء التحليل الحجمي 3D الصورة على القاصي 25٪ من سطح بوني من عظم الفخذ وكانت التغييرات في حجم العظام مع مرور الوقت إلى تطبيع حجم العظام الأولي. ارتفع حجم العظم الخارجي إلى حد كبير في الفئران المصابة مقارنة مع الفئران المصابة صورية (الشكل 2B) 16. وكانت الزيادة في حجم العظام عظم الفخذ الخارجي البعيدة الأرجح بسبب تلف العظام الناجمة عن إصابة الأنسجة المشتركة والعظام، والتي لوحظت باستخدام μCT التصوير والتحليل نسيجية 16.
الرقم 1. 2D في الجسم الحي إضاءة الحيوية وإشارات الفلورسنت. S. تم تلقيح الذهبية Xen29 أو أي بكتيريا (غير المصابة) في مفصل الركبة بعد أن تم تصويرها K-سلك التنسيب والفئران LysEGFP باستخدام نظام التصوير IVIS الطيف 16. (A) يعني في الجسم الحي إشارات للإضاءة الحيوية التي تقاس التدفق الإجمالي (الفوتونات / ثانية) ± SEM. (B) يعني في الجسم الحي EGFP إشارات الفلورسنت التي تقاس كفاءة الكلي مشع (الفوتونات / ثانية) / (μW / سم 2) ± SEM. (C) الممثل للإضاءة الحيوية في الجسم الحي وإشارات الفلورسنت مضافين في الصعود إلى التصوير الفوتوغرافي بالأبيض والأسود صورة من الفئران. الحد من الكشف عن عبء البكتيرية باستخدام التصوير إضاءة الحيوية في الجسم الحي ما بين 1 × 10 2 و 1 × 10 3 كفو. * P <0.05، † P <0.01، ‡ ع <0.001 الفئران المصابة Xen29 مقابل الفئران المصابة صورية (الطالب اختبار t [اثنين الذيل]). الرجاءملاحظة هذا هو شخصية ممثل يتضمن البيانات المنشورة سابقا إنشاؤها باستخدام Xen29 وتصويرها مع نظام التصوير IVIS XR لومينا 16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 2. 3D μCT التصوير. S. المذهبة Xen29 أو أي بكتيريا (غير المصابة) تم تلقيح في مفصل الركبة بعد التنسيب K-الأسلاك وتم تصوير الفئران باستخدام FX الكم في الجسم الحي نظام μCT. (A) الاداءات 3D الممثل μCT من Xen29 الفئران -infected (لوحات العليا) والفئران المصابة صورية (لوحات أقل). (B) نسبة الخارجي تغيير حجم العظام (البعيدة 25٪ من عظام الفخذ) تطبيع لمنظمة الشفافية الدولية الأوليةلي أن أشير (يعني ± SEM). * P <0.05، † P <0.01، ‡ ع <0.001 الفئران المصابة Xen29 مقابل الفئران المصابة صورية (الطالب اختبار t [اثنين الذيل]). يرجى ملاحظة هذا هو شخصية ممثل يتضمن البيانات المنشورة سابقا إنشاؤها باستخدام سلالة إضاءة الحيوية S. الذهبية Xen29 وتصويرها مع الكم FX في الجسم الحي μCT نظام التصوير 16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1 . الممثل 3D التشريحية تسجيل المشارك لإشارات إضاءة الحيوية Xen29 وإشارات الفلورسنت EGFP العدلات في تركيبة مع الصور μCT. يتم تناوب الصور على المحور الرأسي.
Discussion
التصوير Multimodality مثل تقنيات التصوير التي تستخدم في التصوير الضوئي الجسم الحي بالتزامن مع μCT التصوير يوفر النهج التكنولوجي الجديد الذي يسمح التصور 3D، الكمي والرصد الطولي للعمليات البيولوجية في سياق التشريحية 1-4. توفر البروتوكولات في هذه الدراسة معلومات مفصلة عن كيفية إضاءة الحيوية في الجسم الحي والتصوير الفلورسنت يمكن الجمع بين μCT التصوير في زرع الأطراف الاصطناعية نموذج عدوى العظام في الفئران لمراقبة العبء البكتيري، والتهاب العدلات والتغيرات التشريحية في العظام noninvasively وأكثر طوليا الوقت. أخذت معا، فإن المعلومات التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين التصوير الضوئي والهيكلي يمثل التقدم التكنولوجي الكبرى، والتي قد تكون خاصة مناسبة تماما لدراسة العمليات البيولوجية والحالات المرضية التي تؤثر على الجهاز الحركي.
مصلحة واحدةجي الحقائق التي ينبغي الإشارة إلى أن لاحظنا أن الإشارات الفلورسنت-EGFP العدلات انخفضت إلى مستويات الخلفية من 14-21 يوما وظلت عند مستويات الخلفية طوال مدة التجربة رغم وجود البكتيريا للإضاءة الحيوية. فمن غير المرجح أن الإشعاع الأشعة السينية أثر بقاء العدلات كما لاحظنا حركية مماثلة من الإشارات العدلات في الفئران غير المشع 19. في عملنا السابق التي تنطوي على نموذج S. جروح المصابين الذهبية، تشارك العدلات تسلل مجموعة من تجنيد العدلات قوية من التداول والبقاء لفترات طويلة العدلات في موقع الإصابة وصاروخ موجه من KIT + السلف الخلايا إلى الخراج، حيث أنها تعطي محليا ارتفاعا حتى تنضج العدلات 23. فمن المرجح أن عمليات مماثلة ساهمت في العدلات تسلل في زرع العظام S. الذهبية نموذج العدوى. على الرغم من أنه من غير المعروف لماذا انخفضت إشارات العدلات في orthopنموذج عدوى aedic، فإنه يمكن أن تكون الاستجابة المناعية التي تغيرت بمرور الوقت مع تقدم هذا المرض من حاد إلى عدوى مزمنة، وهذا هو موضوع التحقيق في المستقبل.
هناك قيود مع هذا نموذج الفأر من العظام العدوى مشترك الاصطناعية والتصوير في الجسم الحي multimodality التي ينبغي أن يلاحظ. أولا، هذا نموذج الفأر هو التبسيط للإجراءات والمواد الفعلية المستخدمة في جراحة العظام في الإنسان 24. مع ذلك، هذا النموذج لا ألخص العدوى المزمنة وما تبعها من التهاب في العظام والأنسجة المشتركة التي ينظر اليها في التهابات زرع العظام البشرية 8،9. وبالإضافة إلى ذلك، للحصول على الصور μCT، استخدمت بجرعات منخفضة نسبيا من الإشعاع الأشعة السينية لتقليل أي آثار سلبية على صحة الحيوانات أثناء العدوى. لقرار أفضل من العظام، جرعات من الإشعاع الأشعة السينية يمكن استخدامها في التصوير μCT على الموت الرحيم وnimals. ومع ذلك، فإن هذا القضاء على القدرة على noninvasively طوليا ورصد التغيرات العظام خلال فترة التجارب.
في الختام، التصوير multimodality تنطوي على مزيج من الجسم الحي كله في التصوير الضوئي الحيوان مع التصوير التشريحي μCT أتاح المزيد من المعلومات الشاملة عن العدوى والاستجابة الالتهابية. بالإضافة إلى ذلك، فقد سمحت هذه التقنيات تقييم الآثار المترتبة على العدوى والالتهاب في العظام والأنسجة المشتركة. العمل المستقبلي يمكن الاستفادة من التصوير multimodality لتقييم فعالية العلاجات المضادة للميكروبات، الاستجابات المناعية، التسبب في المرض والتغيرات المتفاعلة في العظام كما بدأنا التحقيق 14-18. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التصوير multimodality تقييم تحقيقات واستشفاف لتشخيص وجود عدوى كما هو موضح سابقا في النماذج الحيوانية عدوى الفخذ، التهاب الشغاف، تصيب الرئةالأيونات والتهابات بيولوجية 25-28. وأخيرا، فإن استخدام التصوير multimodality يمكن توسيع راء الأمراض المعدية وتستخدم في مختلف التخصصات، بما في ذلك العظام والروماتيزم وأمراض السرطان، للتحقيق في الظروف الأخرى التي تؤثر على الجهاز الحركي، مثل السرطان العظمي، المرض المنتشر والكسور والتهاب المفاصل 5-7 .
Disclosures
JAM، BNT، EL، وتدفع NZ، KPF موظفي PERKINELMER، التي تصنع أدوات التصوير، وقدمت Xen29 إضاءة الحيوية S. السلالة الذهبية، وتدفع لتغطية تكاليف نشر هذا المقال الفيديو. باقي المؤلفين ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل برنامج H & H لي أبحاث علماء المقيم الجراحي (إلى JAN)، وبدء في إنشاء مؤسسة AO منحة S-12-03M (لLSM)، والمعاهد الوطنية للصحة منح R01-AI078910 (لLSM) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
| Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
| Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
| LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
| Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
| Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
| Wire Cutter - Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
| Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
| Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
| Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
| Quantum FX in vivo µCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | µCT in vivo imaging system | |
| IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and µCT in vivo imaging system | |
| Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |
References
- Dothager, R. S., et al. Advances in bioluminescence imaging of live animal models. Curr Opin Biotechnol. 20, 45-53 (2009).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging progress and applications. Trends Biotechnol. 29, 624-633 (2011).
- Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging current applications and future directions. J Nucl Med. 49, 1-4 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- Reumann, M. K., Weiser, M. C., Mayer-Kuckuk, P. Musculoskeletal molecular imaging a comprehensive overview. Trends Biotechnol. 28, 93-101 (2010).
- Snoeks, T. J., Khmelinskii, A., Lelieveldt, B. P., Kaijzel, E. L., Lowik, C. W. Optical advances in skeletal imaging applied to bone metastases. Bone. 48, 106-114 (2011).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Del Pozo, J. L., Patel, R. Clinical practice. Infection associated with prosthetic joints. N Engl J Med. 361, 787-794 (2009).
- Parvizi, J., Adeli, B., Zmistowski, B., Restrepo, C., Greenwald, A. S. Management of periprosthetic joint infection the current knowledge AAOS exhibit selection. J Bone Joint Surg Am. 94, e104 (2012).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Speziale, P., Montanaro, L., Costerton, J. W. Biofilm formation in Staphylococcus implant infections. A review of molecular mechanisms and implications for biofilm-resistant materials. Biomaterials. 33, 5967-5982 (2012).
- Zimmerli, W., Moser, C. Pathogenesis and treatment concepts of orthopaedic biofilm infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 158-168 (2012).
- Cram, P., et al. Total knee arthroplasty volume utilization and outcomes among Medicare beneficiaries 1991-2010. JAMA. 308, 1227-1236 (2012).
- Wolf, B. R., Lu, X., Li, Y., Callaghan, J. J., Cram, P. Adverse outcomes in hip arthroplasty long-term trends. J Bone Joint Surg Am. 94, (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5, (2010).
- Bernthal, N. M., et al. Protective role of IL-1beta against post-arthroplasty Staphylococcus aureus infection. J Orthop Res. 29, DOI. 1621-1626 (2011).
- Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and µCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS ONE. 7, e47397 (2012).
- Niska, J. A., et al. Daptomycin and tigecycline have broader effective dose ranges than vancomycin as prophylaxis against a Staphylococcus aureus surgical implant infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 56, 2590-2597 (2012).
- Niska, J. A., et al. Vancomycin-Rifampin Combination Therapy has Enhanced Efficacy Against an Experimental Staphylococcus aureus Prosthetic Joint Infection. Antimicrob Agents Chemother. 57, 5080-5086 (2013).
- Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. J Orthop Res. 30, 335-340 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Direct continuous method for monitoring biofilm infection in a mouse model. Infect Immun. 71, 882-890 (2003).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007 (2007).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117, 3343-3352 (2011).
- Deirmengian, C. A., Lonner, J. H. What's new in adult reconstructive knee surgery. J Bone Joint Surg Am. 94, 182-188 (2012).
- Ning, X., et al. Maltodextrin-based imaging probes detect bacteria in vivo with high sensitivity and specificity. Nat Mater. 10, 602-607 (2011).
- Panizzi, P., et al. In vivo detection of Staphylococcus aureus endocarditis by targeting pathogen-specific prothrombin activation. Nat Med. 17, 1142-1146 (2011).
- van Oosten, M., et al. Realtime in vivo imaging of invasive and biomaterial associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nat Commun. 4, 2584 (2013).
- Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous beta lactamase reporter enzyme fluorescence in live mice. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 12239-12244 (2010).
