Summary
黄色ブドウ球菌の生物発光操作された株を用いて、整形外科用インプラント感染のマウスモデルにおいて、光学およびμCTイメージングを組み合わせて、非侵襲的にかつ長手方向における細菌感染の動態、ならびに対応する炎症反応および解剖学的変化をモニターする能力を提供骨。
Abstract
マルチモダリティイメージングは、両方の前臨床および臨床研究で使用される一般的な技術的アプローチとして浮上している。 インビボ光学およびμCTイメージングにおいて組み合わせる高度な技術は、解剖学的文脈における生命現象の可視化を可能にする。これらの画像診断法は、骨に影響を与える条件を研究するのに特に有用である可能性がある。具体的には、整形外科用インプラントの感染症は、臨床整形外科手術における重要な問題である。これらの感染症は、細菌のバイオフィルムは、外国外科的に移植材料に形成するので、持続的な炎症、骨髄炎、最終的には、インプラントの緩みや故障をもたらすインプラントを、周囲の骨の最終的な骨溶解を引き起こす、治療が困難である。ここで、感染した整形外科用補綴インプラントのマウスモデルは、このような方法で、大腿骨の髄内管内にキルシュナー·ワイヤ用インプラントの外科的配置を関連するその使用したインプラントeの端膝関節にXtendedでは。このモデルでは、LysEGFPマウス、EGFP蛍光好中球を有するマウス株は、自然光を発する生物発光の黄色ブドウ球菌株と組み合わせて使用した。細菌は、前に手術部位を閉鎖したマウスの膝関節に接種した。 インビボ生物発光及び蛍光撮像は、それぞれ、細菌負荷及び好中球の炎症性応答を定量した。生物発光および蛍光の光信号の3D位置は解剖学的μCT画像と共に同時登録することができるように、また、μCTイメージングは同じマウスで行った。経時的な骨の変化を定量化するために、遠位大腿骨の外側の骨体積は、半自動化された輪郭ベースのセグメンテーションプロセスを使用して、特定の時点で測定した。 μCTイメージングを用いたインビボ生物発光/蛍光イメージングの組み合わせをf特に有用である、一緒になってまたは感染、炎症反応と時間をかけて骨に解剖学的変化を非侵襲的に監視する。
Introduction
光学的および解剖学的情報の組み合わせを伴うマルチモダリティ前臨床イメージング技術は、3D 1-4生物学的現象の可視化および監視を可能にします。 μCTイメージングは骨の解剖学的構造の絶妙な可視化を可能にするので、光学イメージングとの組み合わせてμCTイメージングを使用すると、骨の生物学5-7を伴うプロセスを調査するために特に有用かもしれないユニークな組み合わせを表しています。例は、整形外科手術手順8,9次の悲惨な合併症を表す整形外科用インプラント感染を研究するためにこれらの技術を使用することであろう。細菌バイオフィルムは細菌10,11へのアクセスからの感染をブロック抗生物質を検知することから免疫細胞を妨げる物理的障壁として機能することにより、細菌の生存を促進する移植された異物に形成する。関節組織（敗血症性関節炎）、ANの慢性持続感染d個の骨（骨髄炎）は、人工関節の緩み、最終的故障8,9につながる骨吸収を誘導する。この得られた人工関節周囲の骨溶解が増加罹患率と死亡率の12,13に関連付けられています。
私たちの以前の研究では、in vivoでの生物発光と蛍光イメージングは、マウス14〜19における整形外科人工関節感染モデルにおけるX線およびマイクロコンピュータ断層撮影（μCT）と一緒に使用した。このモデルは、インプラントの切断端が14-19マウスの大腿骨から膝関節に伸長するように（Kワイヤ）チタンキルシュナー·ワイヤを配置関係する。手術部位が14-19を閉じる前に、黄色ブドウ球菌 （生物発光株Xen29またはXen36）の接種は、その後。膝関節におけるインプラントの表面上にピペットで移したインビボ光学イメージングは、生物発光シグナルを検出および定量化するために使用されたNUに対応した感染した関節と骨組織14〜19中の細菌のmber。また、蛍光好中球20を有しLysEGFPマウスのin vivo蛍光イメージング、Kワイヤイ ンプラント14,19を含む感染した膝関節に移住した好中球の数を定量した。最後に、高分解能X線イメージングとμCT画像を含む解剖学的撮像モダリティは、私たちが任意に2,6術後週16の間、典型的には終わるだろう慢性感染症の全期間にわたって影響を受けた骨のそれぞれの2次元および3次元解剖学的画像化を可能にし、18。このモデルを使用して、局所的および全身的抗菌療法、防御免疫応答および骨における病理学的解剖学的変化の有効性は、14〜18を評価することができる。本稿では、この整形外科人工関節感染モデルにおける光とμCTイメージングモダリティのための詳細なプロトコルはrepresentatiとして提供された骨の解剖学的文脈で生物学的プロセスを研究するためのシステムをVEの。これらは、μCT画像取得および分析した3D光学画像の同時登録を、マウスにおける整形外科人工関節感染をモデル化するための外科的処置を含む2Dおよび3D インビボ光学イメージング手順（細菌性生物発光シグナルおよび蛍光好中球の信号を検出するため） μCT画像。
Protocol
倫理声明：動物福祉法（AWA）、実験動物の管理と使用に関する1996ガイドおよび動物愛護のためにPHSポリシーに記載された連邦規則で定義されたすべての動物は、良好な動物慣行に厳密に従って処理されたお手入れと実験動物とすべての動物の作品の使用は、ジョンズホプキンス動物実験委員会（プロトコール番号：MO12M465）によって承認された。
ミッド対数生物発光細菌の接種の準備1。
- ストリーク生物発光S.トリプシン大豆寒天プレート上に球菌株 Xen29（またはXen36などの別bioluminscent株）（寒天[1.5％]でのトリプシン大豆ブロス）。
注：S.球菌 Xen29 21、遺伝子操作Sである。この細菌菌株で見つかった安定したネイティブプラスミドに統合されているのPhotorhabdusルミネセンス 、由来の改変ルクスオペロンが含まれている黄色ブドウ球菌株 。これらのエンジンエレド細菌は、構成的に生と代謝的に活性な細胞から発光する。 - 約16時間（O / N）を37℃でそれらをインキュベートすることにより、プレート上のコロニーを成長させる。
- 約16時間（O / N）液体TSB（240回転）しながら、単一の細菌CFUと文化を選択します。
- 中期対数増殖期の細菌（約2時間持続時間）を取得するために、O / N培養の50分の1に希釈して継代培養を行います。
- ペレット、再懸濁および洗浄細菌をPBS中で3倍。
- 600nmでの光学濃度の吸光度を測定することにより細菌接種材料（2μlのPBS中の1×10 3 CFU）を推定する。
- プレート上の細菌のO / N培養後接種材料中のCFUを確認します。
2マウス外科的処置
注：これらの実験では、12週齢の雄LysEGFPマウスを使用しています。これらのマウスは、m個で構成されて骨髄細胞（発現させる増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を有するostly好中球）20。手術中に、ハード·地表水の循環加熱パッドの上に無菌ドレープで各マウスを配置することによってベタジンと70％のアルコールで、外科的準備の後に、無菌状態を維持してください。ガウン、滅菌手袋、マスクを使用し、機器を滅菌する。
- イソフルラン2％吸入を使用して、マウスを麻酔。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。呼吸数、筋緊張、足指のピンチ、角膜反射や粘膜の色を観察することによって、麻酔の適切なレベルを評価する。右膝上の手術部位に穴、滅菌外科用ドレープでマウスをカバー。マウスを麻酔下ながら、体温を維持するための支援発熱対策を取得する必要があります。温水ジャケット付き毛布や硬質プラスチックを加熱ステーション（ProStation、パターソン、Scientific）を循環する水に循環するウォーム37℃の水が低体温症を防ぐために良い方法です。
- buprenorph注入INE（徐放性製剤）（2.5mgの/ kg）の手術の皮下直前。鎮痛の必要性に応じて持続放出ブプレノルフィンの追加の用量は3日間隔で投与してもよい。
- ベタジンと70％アルコールを用いた三交番スクラブを使って手術膝と準備を剃る。
- 右膝関節を覆う皮膚に正中切開を行います。伸筋機構は十分に定義することができるように、皮膚切開を拡張します。
- 内側膝蓋骨関節切開を行い、アドソンの鉗子で横方向に大腿四頭筋、膝蓋腱の伸筋機構がsublux。
注：これは、プレーンビューに大腿骨の顆間ノッチをもたらします。 - 手動で23Gの針に続く25 Gの針を用いて髄内管をリーマ。
注：大腿骨への損傷を避けるために、安定なプラットフォームを使用することができる。これは、大腿骨の偶発骨折を最小化する技術が重要であるべきである。 - 医療グレードのチタンを挿入Kirsc手動髄内管に逆行する方向に、ピンホルダーを使用してそれを押し出すことを伴う圧入技術を用いることによりhnerワイヤ（直径0.8mm）。
注：ステンレススチールKワイヤ16と比較してチタンKワイヤとμCT画像に見られるより少ないアーティファクトがあったとして、チタンKワイヤを使用した。 - Kワイヤの切断端が膝関節腔に約1mmを拡張するようにピンカッターでキルシュナー·ワイヤの端をカット。
- マイクロピペット、ピペット生物発光Sの1×10 3 CFU2μlのを使用して、膝関節空間内のインプラントの先端に黄色ブドウ球菌 Xen29。
注：より多くのボリュームがより広い組織の混入の少ない離散画像化につながる。
注：コントロール非感染マウスでは、いずれの細菌なしに滅菌生理食塩水2μlを添加する。 - 鉗子を使用してバック正中線に大腿四頭筋、膝蓋複合体を削減し、吸収性を用いてその上皮下組織と皮膚を閉じる表皮下縫合糸。
注：それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。 - 実験の終了時に、ジョンズホプキンス動物実験委員会のガイドラインに基づいて二酸化炭素吸入を使用して、すべての動物を安楽死さ。二酸化炭素露光が終了し、頸椎脱臼後10分以内に回復しなかった動物を観察することによって死を確認する。
3次元光イメージング（in vivoでの生物発光と蛍光イメージング）
- LysEGFPマウス（ 例えば、2％の吸入イソフルラン）を麻酔し、イメージング室に腹側にそれらを配置します。
- 生体内イメージングシステムにおける IVISスペクトラム光学全動物を用いたin vivo生物発光イメージングを実行します。まず、発光を確認し、開放Fの選択を確認ILTER選択、視野（FOV）は、C - 13センチ、上下オート（自動露出設定）への露光時間をスクロールします。自動露出が自動的に飽和を回避しながら、信号強度を最適化するために、取得時間（シャッタースピード）、ビニング（デジタル画素ビニング）、および機器のFストップ（開口部）を調整します。その後、生物発光画像をキャプチャするために[取得]をクリックします。
注：in vivoでの生物発光イメージングのために、1との間の画像マウス- 5分。 - 蛍光灯の横にあるボックスをチェックすることで、生体内蛍光イメージングシーケンシャルを実行します。 465 nm励起フィルターおよび520nmの発光フィルターを選択してください。ダウンAutoに露光時間をスクロールして、FOV C（ステップ3.2.1）を選択します。そして、蛍光画像をキャプチャするために取得します。
注：0.5秒の間の生体内蛍光イメージング、画像マウスの場合。 - 最初の拡大による生活Imageソフトウェアを使用して、関心領域における総フラックスとしての生体内生物発光シグナル（光子/秒）（ROI）を定量化ツールパレットのROIツール]セクション。
- サークルアイコンとFOV内の被験動物の数に対応するROIの数を選択します。金利すなわち、収集された生物発光拡散パターンの領域を包含するようにROIのサイズを変更します。
- ツールパレットとROI計測ウィンドウ内のROI ToolsのメジャーのROIを選択して表示されます。総ラディアンス（光子/秒）の値は、生成されたROI内の生物発光ピクセルの合計を表している。
- クリップボードに情報を転送し、分析のために、その後のプログラムに貼り付けることができます、このウィンドウの右下に[すべて選択し、コピーのタブを選択してください。
- リビングイメージソフトウェアを使用して関心のある円形領域内の総放射効率（[の光子/秒] / [μW/ cm 2]で）（ROI）などの生体内蛍光シグナルを定量化する。
- リビングイメージソフトウェアのウィンドウ内では、ツールパレット内のROIツール]を展開します。選択するサークルアイコンとFOV内の被験動物の数に対応するROIの数。
- 前の画像取得から生物発光シグナルと密接に対応する関心領域を包含するようにROIのサイズを変更します。
- ツールパレットとROI計測ウィンドウ内のROI ToolsのメジャーのROIを選択して表示されます。
注：総放射効率（[光子/秒] / [μW/ cm 2の ]）、ROI内の蛍光のピクセルの和を表している。 - このウィンドウの右下隅のすべてとコピーのタブがクリップボードに情報を転送し、分析のために、その後のプログラムに貼り付けることができますを選択します。
4。μCT画像取得
- イメージング室に麻酔をかけLysEGFPマウスを置きます。
注：この撮像チャンバーを可能にするためにIVISスペクトルイメージングシステムと量子FX インビボの μCT画像化システムの両方に適合するように設計され光とμCT画像の共同登録。 - CTソフトウェアを開き、ドロップダウンから、動的メニュープリセット60ミリメートルのFOVはstdを選択します。
- 機器にイメージングシャトル用の大口径カバーとアダプターアームを挿入します。
- 穴に腕を押し込み、その後アダプターアームにマウスイメージングシャトルを置き、ドアを閉めます。ライブモード（コントロールパネルの目のボタン）をオンにして、Xのキャプチャウィンドウに動物を中央にX軸とY軸コントロールを使用して、0°と90°のガントリ位置に被写体を配置します。そして、目のボタンをクリックして、ライブモードをオフにします。
- （次のライブモードボタン）は、CTスキャン]ボタンをクリックして、60ミリメートルの視野を持つダイナミックスキャン画像を取得します。後でアクセスできる場所にDICOM形式や店舗で取得した画像をエクスポートします。
注：おおよその用量は、1スキャン当たり26ミリグレイとなります。より良好な分解能が望まれる場合の30mm FOVを使用することができる。
5。3D光学式画像収集、形成およびμCT共同登録
- この挿入にマウスを含むイメージングシャトルを配置することによって、スペクトルにマウスイメージングシャトルインサートを置き、マウスが移動しないようにします。
- リビングイメージを使用して、ウィザードのセットアップを開始するために買収[コントロールパネル]の[イメージ作成ウィザードを選択します。開始するには、生物発光、その後DLITを選択し、この場合には、自動的に500に選択されますドロップダウンメニューやモデルに適した発光フィルターからレポーター」バクテリア "を選択 - 620ナノメートル。
- [次へ]を選択し、取得パラメータおよび最終ウィンドウ内のサブジェクト情報を指定します。具体的には、撮像対象は、マウスになり、自動設定の飽和を回避しながら自動露出は、信号品質を最大化するようにできるように選択され、視野がCに設定されます - 13センチメートル。
- 最終ウィンドウで[完了]を選択し、買収パネルのシーケンスウィンドウは次のようになります。utomatically DLITシーケンスが移入。イメージングウィザードの選択に従って各波長での発光選択したフィルタや最適な設定を選択します自動露出ごとに取得された一つの画像があるでしょう。生成された配列はまた、以下に詳述する表面形状ツールを使用して被検面の生成のために必要な構造化光画像を含む。
- DLITデータを取得する取得]シーケンスを選択します。
- 画像収集が完了した後、表面トポグラフィーを生成する。ツールパレットの下の表面形状]タブを展開して起動します。
- 次に、正確にIVIS機器のカメラやトップが直面している動物の側面を反映した方向を選択します。その後、表面の生成]をクリックします。動物が含まれているFOVの領域をトリミング。
- その後、動物の境界を定義するために紫のマスクを使用しています。
注：暗い毛皮や皮膚を持つ動物は、sから適切にマスクしないようにマスキングツールは、色のコントラストを使用しています田下。 - [完了]を選択して、表面が自動的に表示されます。私たちはもはやそれを必要としませんようにタブを閉じた後表面形状タブの下に結果を保存します。
- DLIT 3次元再構成]タブを展開してリビングイメージ22に実装され拡散光再構成アルゴリズムを使用して3Dの光源位置を再構築。
- DLIT配列について獲得された画像が示されている。
メモ：ソフトウェアが自動的に取得されたデータの品質を検証し、暗すぎると判断さや彩度が存在する場合の画像の選択を解除します。下部右側の[開始]を選択します。 - 必要であれば、人はダブルクリックすることでそれぞれの生物発光画像に対してしきい値を調整し、下部の左側にしきい値スライダを使ってすることができます。
注：これはこれは、最終的な再構成されたソースの全体的な強度を調整することができるように、より高い閾値処理時に実施されなければならない低強度信号と注意を含めることは主である。
- DLIT配列について獲得された画像が示されている。
- （左から三番目）ソフトウェアの上部にあるツールバー内の3Dアイコンをクリックして、DICOMブラウザを開き、先に取得した量子FXイメージを検索します。
- インポート用のファイルをダブルクリックしてリビング画像3Dビュー]タブにこのイメージをロードします。
注：基準を自動的に検出し、3D光学画像に登録されμCT像になる必要があります。
- インポート用のファイルをダブルクリックしてリビング画像3Dビュー]タブにこのイメージをロードします。
- ツールパレットで、3D光学式ツールを拡大し、Surfaceタブで表示対象の表面のラベルチェックボックスの選択を解除して表面形状の可視化マップの選択を解除します。
- 手動で3DマルチModaliの[音量]タブの下にヒストグラムを用いてμCT画像内に表示されている骨格とKワイヤインプラントを可視化するためにルックアップテーブルを作成するツールパレットのTYツール]セクション。
- ヒストグラムは、3次元ボリュームデータとその色の不透明度におけるボクセル強度の分布を表す。組織または構造が表示されるまで、目的の特定の組織がヒストグラムであるかを判断するには、しきい値とレンダリングをスライダーツールを使用します。
- 次に、右側の点を生成し、ヒストグラムのその領域を分離するために、曲線を形成するためにヒストグラムをクリックします。これは、各構造に対して繰り返される - スケルトンKワイヤインプラントが続き、将来のためにルックアップテーブルとして保存することができる分析。
- そうヒストグラムの生成されたすべてのポイントはダブルクリックすることで所望のポップアップウィンドウから目的の色を選択する場合は、コンポーネントが色がコード化することができる。
6μCT画像の可視化と分析
- 量子FXソフトウェアを使用して、興味のある画像を選択し、ビューアを起動。回転ツールを選択し、visualiにイメージを再配向大腿骨の長手方向軸をZE。測定ツールを選択して、大腿骨の長さを測定します。
- 3Dレンダリングを生成するために、3Dビューアを起動します。インプラント感染に関連した骨の解剖学的構造の変化を示すために、しきい値を調整します。
- 3Dレンダリングは、遠位大腿骨内の関心領域の所望の断面部に制限されるようにクリッピング平面適用する。
- 分析11.0ソフトウェアパッケージを起動します。 3Dレンダリングを作成するために使用された* .VOXファイルをロードします。
- 画像の電卓ツールを起動します。 （大腿骨が含まれていない面を削除します）画像をトリミングするには、 '地域パッド」ツールを使用します。
- 斜断面ツールを起動します。大腿骨、大転子およびピンの端の中間点を見つけることが3点オプションを使用します。これらの点斜面を作り、新しいスライスを持つ画像を生成。
- インタレストツールの領域を起動します。横断スライスを表示します。 minとmaxの設定を調整します皮質骨を表示することだ。大腿骨の遠位25％に相当するスライス（5スライスのおおよその間隔で）いくつかのスライスに対して、対応するスライスの輪郭を作成します。これらの等高線の間を補間し、3次元関心領域を生成するために「伝播リージョンズツールを使用します。オブジェクトマップなどの関心のこの領域を保存します。
- 「サンプルオプション]ツールを起動します。先ほど作成したオブジェクトマップのチェックボックスを選択し、適切なオプションのためのラジオボタンを選択します。 「ボリューム」チェックボックスが選択されていることを確認するために、「環境設定のログ分析」ボタンをクリックします。実際の測定を行うために「サンプル画像」ボタンをクリックします。
- データ解析プログラムに体積測定をエクスポートします。式を使用して最初の画像化の時点に後の時点から、外側の骨量を正規化：Δ量（％）=（[音量（デイX） - ボリューム（2日目）] / [音量（2日目）は、]）×100 。
注：この式において、変数「X」は、興味のある時点を表す。得られた数は、経時的な遠位大腿骨の外側の骨量の大きさの変化を表す。 - 骨の上に3次元関心領域に可視化するために、「ボリュームレンダリング」ツールでCT画像をロードします。 3次元関心領域を含むオブジェクトマップをロードします。 'View''Objects」に移動し、「オリジナル」が「オン」に設定。 「プレビュー」ウィンドウを開きます。 「レンダリングタイプ」メニューを起動し、「オブジェクト合成」を選択します。
- 「しきい値」ボタンとツールをクリックし、骨とオブジェクト地図を表示するためのしきい値を調整します。すべての時点で同じ固定閾値範囲を使用してください。 「ローテーション」ボタンをクリックして、真の前外側のビューであると向きを設定。最終的なレンダリングを生成するために、「レンダリング」をクリックします。メイン 'ボリュームからレンダリングを保存「ウィンドウをレンダリングします。
Representative Results
生体内生物発光および蛍光イメージングでは、
本研究では、プロトコルは関節内に大腿骨に髄内管から延びチタンKワイヤイ ンプラントの外科的配置を伴うマウス14-19整形外科人工関節感染症のこの以前に発表されたモデルで、に記載されているスペース14-19。S.黄色ブドウ球菌生物発光株Xen29（2μlのPBS中の1×10 3 CFU）を前に、手術部位16を閉じることに膝関節内のエンドチタンインプラントの上に直接ピペッティングした。視覚化し、麻酔しLysEGFPマウスにおいて非侵襲的に細菌負荷及び好中球流入を定量化するために、in vivoでの動物全体の光学イメージングは、画像を順次実施したIVISスペクトラム光学動物全体インを使用して浸潤好中球からの細菌から生物発光信号やEGFP蛍光シグナル生体内3術後日数（ すなわち、2日目、14および28）上の画像システム。 Xen29感染マウスの生物発光シグナルは、実験（ 図1A、C）16の間、偽感染マウスのバックグラウンドシグナルを超えたまま。 私たちの以前の研究は、生体内生物発光信号が密接インプラント17,18ジョイント/骨組織と接着性から分離されたex vivoでのCFUの数を近似していることを実証した。また、EGFP蛍光シグナルは、初期の時点で偽感染マウスよりも高かったが、感染の経過（ 図2B、C）16の間にバックグラウンドレベルに近づいた。
3DμCT画像とin vivoでの光信号の同時登録
私は、手術後の膝関節の解剖学的コンテキストにおいて光信号（ すなわち、細菌の生物発光およびEGFP蛍光信号）を可視化するnは、3D、IVISスペクトルイメージングシステムを用いて生成された光学像は、同時登録された量子FXμCTイメージングシステムを用いて生成されたμCT画像であった。マウス撮像チャンバは、マウスが正確に同じ向きであったことを確実にするためにいずれかのマシンに挿入することができるため、この共登録は達成することができる。画像取得は、動物の身体的再配置を必要とせずに1機器に両方のモダリティを統合IVISスペクトラム-CT のin vivoイメージングシステムを用いて行われ、この正確さを確認するために、結果を比較した。 3DでμCT画像上に光学データをマップするために、拡散光トモグラフィ再構成アルゴリズム16を利用した 。結果として得られる3D再構成は（ ムービー1）が示されている。
また、μCTイメージングは中に発生した骨の質や寸法の必然的な変化の可視化および定量化を可能にした感染（ 図2）16。既報の通り、遠位大腿骨の外側の骨量は、実質的に時間をかけた（ 図2A）16 を増加させた。これらの変化を定量化するために、3Dボリュメトリック画像解析は、大腿骨のボニー面の先端25％で行った経時骨量の変化は、初期の骨量に対して正規化した。外側の骨量は、実質的に偽感染マウス（ 図2B）16と比較して、感染したマウスでは増加した。遠位大腿骨外側骨量の増加は、μCTイメージングと組織学的解析16を用いて観察した関節組織および骨の感染によって引き起こされる骨の損傷、と思われた。
生体内で図1の2D 生物発光と蛍光シグナル。S. 黄色ブドウ Xen29または細菌なし（非感染）は、Kワイヤの配置およびLysEGFPマウスをIVISスペクトルイメージングシステム16を使用して画像化した後膝関節に接種した。（A）平均インビボでの生物発光シグナルを全フラックス（光子/秒）によって測定される±SEM。（B）の平均in vivoでの EGFP蛍光シグナルを全放射効率（光子/秒）によって測定されるように黒白写真の上に重ねて、生体内生物発光と蛍光シグナルにおける SEM（C）代表±/（μW/ cm 2）をマウスのイメージ。 インビボでの生物発光イメージングに用いて細菌負荷の検出限界は1×10 2〜1×10 3 CFUの間である。 * P <0.05、†のP <0.01、‡P <偽感染マウス対0.001 Xen29感染マウス（スチューデントのt検定[両側]）。どうぞこれはXen29を使用して生成し、IVISルミナXRイメージングシステム16で画像化以前に公表されたデータが含まれている代表的な図であることに注意。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2 3DμCTイメージング。 黄色ブドウ球菌 Xen29または細菌なし（非感染）Kワイヤ配置とマウスを量子FX のin vivoμCTシステムを使用して画像化した後に膝関節に接種した。Xen29の（A）代表3DμCTレンダリング感染したマウス（上のパネル）および偽感染マウス（下のパネル）。初期TIに正規化され、外側の骨体積変化（大腿骨の遠位25％）の（B）の割合私のポイント（平均±SEM）。 * P <0.05、†のP <0.01、‡P <偽感染マウス対0.001 Xen29感染マウス（スチューデントのt検定[両側]）。これは生物発光菌株Sを使用して生成され、以前に公開されたデータが含まれる代表的な図であることに注意してください量子FX のin vivoμCTイメージングシステム16で画像化球菌 Xen29とは、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ムービー1 。μCT画像と組み合わせたXen29の生物発光信号およびEGFP-好中球の蛍光シグナルの代表的な3D解剖共同登録。画像は、縦軸に回転させる。
Discussion
そのようなμCTイメージングと組み合わせてインビボ光学イメージングに利用するイメージング技術としてマルチモダリティイメージングは、解剖学的文脈1-4 3Dビジュアライゼーション、定量および生物学的プロセスの長手方向の監視を可能にする新たな技術的アプローチを提供します。本研究におけるプロトコルは、非侵襲的に長さ方向にわたって骨に細菌負荷、好中球性炎症および解剖学的変化を監視するために、マウスにおける整形外科補綴インプラント感染モデルにμCTイメージングと組み合わせることができるかのin vivo生物発光と蛍光イメージングの詳細な情報を提供する時間。まとめると、光学的および構造的イメージングを組み合わせることによって得られた情報は、特に筋骨格系に影響を与える生物学的プロセスおよび病理学的状態を研究するために適してもよい主要な技術的進歩を表す。
One関心指摘されるべきであるる知見は、私たちがEGFP-好中球の蛍光シグナルは、14〜21日までにバックグラウンドレベルまで減少し、生物発光細菌の存在にもかかわらず、実験の期間中、バックグラウンドレベルのままであったことを観察することである。私たちは、非照射マウス19における好中球の信号の類似の動態を観察し、X線照射の影響を受けた好中球の生存可能性は低い。私たちの以前の研究ではSのモデルを含む黄色ブドウ球菌に感染した傷、好中球の浸潤は循環から強固な好中球動員、感染部位、彼らはローカルで好中球23を成熟を 生じる膿瘍にKIT +前駆細胞のホーミングで長期の好中球生存のフォーメーションを採用。これは、同様の処理が整形外科用インプラントSに好中球浸潤に寄与した可能性がある黄色ブドウ球菌感染モデル。それは不明であるが、好中球の信号は、整形外科において減少した理由aedic感染モデルは、この感染症は慢性感染への急性から進行し、これが今後の調査の対象であり、免疫応答は経時的に変化しているかもしれません。
注目すべきである整形外科人工関節感染およびin vivoでのマルチモダリティイメージングのこのマウスモデルでは制限があります。まず、このマウスモデルは、ヒト24に整形外科手術で使用される実際の手順および材料の過度の単純化である。それにもかかわらず、このモデルは、慢性感染を再現し、人間の整形外科用インプラント感染8,9に見られる骨および関節組織の炎症が続くん。また、μCT画像を得るために、X線照射の比較的低用量は、感染の経過の間、動物の健康への悪影響を最小限にするために使用された。 μCTイメージングに使用することができる骨の良好な分解能、X線放射のより高用量のために安楽死にnimals。しかしながら、これは、非侵襲的かつ縦方向に実験の期間にわたって骨の変化を監視する能力を排除する。
結論として、解剖学的μCTイメージングを用いたインビボ動物全体光学イメージングの組み合わせを含むマルチモダリティイメージングは、感染症や炎症反応についてのより総合的な情報が可能になった。また、これらの技術は、骨および関節組織における感染および炎症の影響の評価を可能にした。今後の課題は、私たちが14〜18を調査し始めているように抗菌療法、免疫応答、疾患の病因と骨中の反応性の変化の有効性を評価するためにマルチモダリティイメージングを利用することができます。また、マルチモダリティイメージングは、以前に動物モデルにおいて大腿感染症、心内膜炎、肺感染し、記載のように感染の存在を診断するためのプローブおよびトレーサーを評価することができイオンや生体材料の感染25-28。最後に、マルチモダリティイメージングの使用は、感染症を超えて拡大し、そのような骨格癌、転移性疾患、骨折や関節炎5-7のような筋骨格系に影響を与える他の条件を調査するために整形外科、リウマチ学および腫瘍学などの学問分野、全体で使用することができる。
Disclosures
JAM、BNT、EL、NZ、KPFはXen29生物発光S.を提供し 、イメージング機器を製造してパーキンエルマーの従業員が支払われる黄色ブドウ球菌株は、このビデオ、記事の出版費用を支払った。残りの著者は、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、H＆H·リー外科レジデント研究奨学プログラム（JAN）にすることにより、AO財団スタートアップ（LSM）の助成金S-12-03Mと（LSM）は国立衛生研究所の助成金R01-AI078910をサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
| Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
| Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
| LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
| Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
| Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
| Wire Cutter - Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
| Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
| Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
| Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
| Quantum FX in vivo µCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | µCT in vivo imaging system | |
| IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and µCT in vivo imaging system | |
| Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |
References
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