Summary
Combinado imagiologia óptica e μCT num modelo de rato com infecção de implante ortopédico, utilizando uma estirpe bioluminescente engenharia de Staphylococcus aureus, desde a capacidade de forma não invasiva e longitudinalmente controlar a dinâmica da infecção bacteriana, assim como a resposta inflamatória correspondente e alterações anatómicas na osso.
Abstract
Imagens multimodalidade surgiu como uma abordagem tecnológica comum usado tanto em pesquisa pré-clínica e clínica. Técnicas avançadas que combinam em imageamento óptico e μCT vivo permitem a visualização dos fenômenos biológicos em um contexto anatômico. Essas modalidades de imagem pode ser especialmente útil para estudar as condições que o osso impacto. Em particular, as infecções de implantes ortopédicos são um problema importante em cirurgia ortopédica clínica. Estas infecções são difíceis de tratar, pois o biofilme se formar nas estrangeiras materiais implantados cirurgicamente, levando à inflamação persistente, osteomielite e eventual osteólise do osso ao redor do implante, o que acaba resultando em afrouxamento e falha do implante. Aqui, um modelo de ratinho de um implante ortopédico protético infectado foi usado, que envolveu a colocação cirúrgica de um implante de fios Kirschner em um canal intramedular do fémur de tal modo que a extremidade do implante extended na articulação do joelho. Neste modelo, ratinhos LysEGFP, uma estirpe de ratinho que tem neutrófilos EGFP-fluorescentes, foram empregados em conjunto com uma estirpe de Staphylococcus aureus bioluminescente, que, naturalmente, emite luz. As bactérias foram inoculadas nas articulações do joelho dos ratinhos antes de fechar o local cirúrgico. In vivo bioluminescente e imagiologia fluorescente foi utilizado para quantificar a carga bacteriana e resposta inflamatória de neutrófilos, respectivamente. Além disso, μCT imagiologia foi realizada no mesmo ratinhos de modo que a localização dos sinais ópticos fluorescentes bioluminescente e 3D pode ser co-registadas com as imagens μCT anatómicas. Para quantificar as alterações no osso ao longo do tempo, o volume do osso externo dos fémures distais foram medidos em pontos de tempo específicos, usando um processo de segmentação baseada contorno semi-automatizado. Tomados em conjunto, a combinação in vivo de bioluminescente / imagens fluorescentes com μCT de imagem pode ser especialmente útil fou a monitorização não invasiva da infecção, da resposta inflamatória e alterações anatómicas nos ossos ao longo do tempo.
Introduction
Multimodalidade técnicas de imagem pré-clínicos que envolvem a combinação de informações ópticas e anatômicas permitem a visualização e monitoramento de fenômenos biológicos em 1-4 3D. Desde μCT de imagem permite a visualização requintado de anatomia óssea, utilizando μCT imagem em conjunto com de imageamento óptico representa uma combinação única que pode ser especialmente útil para processos que envolvem biologia óssea 5-7 investigando. Um exemplo seria usar essas técnicas para estudar infecções de implantes ortopédicos, que representam uma complicação desastrosa após procedimentos cirúrgicos ortopédicos 8,9. Bactérias biofilmes formar sobre os objectos estranhos implantados que promovem a sobrevivência das bactérias, servindo como uma barreira física que impede que as células imunitárias de detecção da infecção e bloqueia o acesso aos antibióticos a partir de bactérias 10,11. A infecção crônica e persistente do tecido das articulações (artrite séptica) umad osso (osteomielite) induz a reabsorção óssea que conduz ao afrouxamento da prótese e eventual falha de 8,9. Este osteólise periprotético resultante é associada com aumento da morbidade e mortalidade 12,13.
Em nosso trabalho anterior, in vivo bioluminescente e imagem fluorescente foi usado junto com raios-X e tomografia computadorizada de micro (μCT) em um modelo ortopédico infecção de prótese articular em ratos 14-19. Este modelo envolveu a colocação de um fio de titânio Kirschner-(K-wire), de tal maneira que a extremidade de corte do implante estendido na articulação do joelho a partir dos fémures de ratinhos 14-19. Um inoculo de Staphylococcus aureus (estirpe bioluminescente Xen29 ou Xen36) foi então pipetada para a superfície do implante, na articulação do joelho, antes do local cirúrgico foi fechado 14-19. In vivo imagiologia óptica foi utilizado para detectar e quantificar os sinais bioluminescentes, que correspondeu number de bactérias no tecido articular e do osso infectado 14-19. Além disso, a fluorescência in vivo de imagens de ratinhos LysEGFP, que possuem neutrófilos fluorescentes 20, foi utilizada para quantificar o número de neutrófilos que migraram para as articulações do joelho infectadas contendo os implantes K fios 14,19. Por fim, as modalidades de imagem anatômicos, incluindo imagens de alta resolução de raios-X e μCT imagem, permitida respectivo 2D e 3D imagens anatômicas do osso afetado por toda a duração da infecção crônica, que nós arbitrariamente terminam normalmente entre 2 e 6 semanas de pós-operatório 16 , 18. Usando esse modelo, a eficácia da terapia antimicrobiana local e sistêmica, resposta imune protetora e alterações anatômicas patológicas nos ossos poderiam ser avaliados 14-18. Neste manuscrito, os protocolos detalhados para as modalidades de imagens ópticas e μCT neste modelo infecção de prótese articular ortopédica foram fornecidos como representatisistema para estudar os processos biológicos no contexto anatômico do osso ve. Estes incluem os procedimentos cirúrgicos para modelar uma infecção de prótese articular ortopédica em ratos, em 2D e 3D em procedimentos de imagem óptico in vivo (para detectar sinais bioluminescentes bacterianas e sinais de neutrófilos fluorescentes), aquisição μCT imagem e análise e co-registro de imagens ópticas 3D com o imagens μCT.
Protocol
Declaração de Ética: Todos os animais foram manipulados em estrita conformidade com as boas práticas de animais, conforme definido nos regulamentos federais, conforme estabelecido na Lei de Bem-Estar Animal (AWA), o Guia 1996 para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e da Política PHS para a Humane Cuidados e Uso de Animais de Laboratório e todo o trabalho animal foi aprovada pelo Animal Care Johns Hopkins e do Comitê Use (Protocolo n: MO12M465).
1. Preparar o inóculo de Mid-logarítmicas bactérias bioluminescentes
- Streak bioluminescente S. aureus cepa Xen29 (ou outra estirpe bioluminscent como Xen36) em placas de agar de soja tríptica (caldo de soja tríptica em agar [1,5%]).
NOTA: S. aureus Xen29 21 é um S. geneticamente modificadas aureus estirpe que contém um operão lux modificada proveniente Photorhabdus luminescens, o qual está integrado num plasmídeo nativo estável encontrado nesta estirpe bacteriana. Estes motoresbactérias deradas constitutivamente emitem luz a partir de células vivas e metabolicamente ativas. - Crescer as colónias das placas incubando-os a 37 ° C durante aproximadamente 16 horas (S / N).
- Selecione UFC bacteriana única e cultura em agitação TSB líquido (240 rpm) por aproximadamente 16 horas (O / N).
- Realizar uma sub-cultura com 1/50 de diluição da cultura D / N para a obtenção de meados de bactérias em fase logarítmica de crescimento (duração de aproximadamente 2 horas).
- Pellet, ressuspender e lavar as bactérias 3x em PBS.
- Estimar a inóculos bacterianos (1 x 10 3 CFU em 2 mL de PBS) através da determinação da absorvância a densidade óptica a 600 nm.
- Verifique o CFU no inoculo após cultura das bactérias S / N em placas.
2. mouse Procedimentos Cirúrgicos
NOTA: Para estes experimento, use um período de doze semanas de idade do sexo masculino camundongos LysEGFP. Estes ratinhos possuem aumentada da proteína verde fluorescente (EGFP) expressando células mielóides (que consistem em mostly neutrófilos) 20. Manter condições estéreis durante a cirurgia, após a preparação cirúrgica com betadine e 70% de álcool, através da colocação de cada rato num campo estéril em cima de uma superfície dura da água que circula almofada de aquecimento. Use vestido, luvas estéreis, máscara e esterilizar os instrumentos.
- Anestesiar o mouse usando uma inalação 2% de isoflurano. Use vet pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia. Avaliar o nível adequado de anestesia, observando a freqüência respiratória, o tônus muscular, toe pitada, reflexo corneal e coloração das mucosas. Cobrir a ratinhos com uma cobertura cirúrgica esterilizada com um furo no local da cirurgia do joelho direito. O mouse deve obter medidas de aquecimento de apoio para manter a temperatura do corpo sob anestesia. Quente de 37 ° C a água que circula em uma camisa de água quente cobertor ou uma água de circulação duro estação de trabalho aquecido plástico (ProStation, Patterson, Scientific) são boas maneiras de evitar a hipotermia.
- Injetar buprenorphine (formulação de libertação prolongada) (2,5 mg / kg) por via subcutânea imediatamente antes da cirurgia. Doses adicionais de buprenorfina de libertação prolongada podem ser administradas em intervalos de 3 dias conforme necessário para analgesia.
- Raspar o joelho operatório e preparar usando três esfrega alternadas usando betadine e 70% de álcool.
- Realize uma incisão mediana na pele que recobre a articulação do joelho direito. Estender a incisão na pele para que o mecanismo extensor pode ser bem definida.
- Realize uma artrotomia medial patelar e sublux o quadríceps-patelar mecanismo tendão extensor lateralmente com uma pinça de Adson.
NOTA: Este traz a fossa intercondilar do fêmur em vista. - Resma manualmente o canal intramedular com uma agulha 25 G, seguida por uma agulha de 23 G.
Nota: Para evitar danos ao fémur, uma plataforma de estabilização pode ser utilizada. Isto deverá ser importante para a técnica para minimizar a fractura acidental do fémur. - Insira um de titânio Kirsc de grau médicohner-fio (0,8 mm de diâmetro), usando uma técnica de encaixe por pressão, o que implica que empurra-lo manualmente utilizando um pino de suporte, numa direcção retrógrada no interior do canal intramedular.
NOTA: Titanium K-fios foram usados como havia menos artefatos visto nas imagens μCT com titânio fios de Kirschner, em comparação com o aço inoxidável fios K 16. - Cortar a extremidade do-fio de Kirschner com cortadores de pino de modo a que a extremidade cortada do K-fio estende-se cerca de 1 mm para dentro do espaço da articulação do joelho.
- Usando uma micropipeta, pipeta 2 mL de 1 x 10 3 UFC de S. bioluminescente aureus Xen29 na ponta do implante dentro do espaço da articulação do joelho.
NOTA: Mais de volume conduz à contaminação dos tecidos mais larga e menos de imagens discretas.
NOTA: No controle de camundongos não infectados, adicionar 2 mL de solução salina estéril, sem bactérias. - Reduzir o complexo quadríceps-patelar de volta para linha média com a pinça e fechar o tecido subcutâneo e pele sobrejacente usando absorvívelsuturas subcuticulares.
NOTA: Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que passou por uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. - Ao final dos experimentos, todos os animais sacrificados usando inalação de dióxido de carbono de acordo com o Animal Care and Use Committee diretrizes Johns Hopkins. Verifique morte, observando o animal não se recupera dentro de 10 minutos após o fim da exposição de dióxido de carbono e deslocamento cervical.
3. 2D imagens ópticas (In vivo Bioluminiscente e Fluorescent Imaging)
- Anestesiar LysEGFP ratinhos (por exemplo, 2% a inalação de isoflurano) e colocá-las com o lado ventral para cima dentro de uma câmara de imagem.
- Execute in vivo a imagem de bioluminescência usando o óptico animal inteiro IVIS Spectrum no sistema de imagem in vivo. Primeiro, verifique luminescentes e confirmar a escolha de um f abertoseleção ILTER, campo de visão (FOV) C - 13 centímetros, e role para baixo tempo de exposição para Automático (configuração de exposição automática). Exposição automática ajusta automaticamente o tempo de aquisição (velocidade do obturador), binning (binning de pixel digital), e f-stop (abertura) do instrumento para otimizar a intensidade do sinal, evitando a saturação. Em seguida, clique Adquirir para capturar a imagem de bioluminescência.
NOTA: Para in vivo bioluminescente de imagem, ratos de imagem entre 1-5 min. - Realize sequencial in vivo imagens fluorescentes, marcando a caixa ao lado fluorescente. Escolher o filtro de excitação de 465 nm e 520 nm, filtro de emissão. Role o tempo de exposição para baixo para Auto e selecione FOV C (Passo 3.2.1). Em seguida, clique Adquirir para capturar a imagem de fluorescência.
NOTA: Para in vivo imagens fluorescentes, ratos de imagem entre 0,5 seg. - Quantificar os sinais in vivo bioluminescentes como fluxo total (fótons / s) em uma região de interesse (ROI) usando Viver software Image by primeira expansão doSeção Ferramentas de ROI da paleta de ferramentas.
- Selecione o ícone do círculo eo número de ROIs que correspondem ao número de animais no âmbito do FOV. Redimensionar a ROI para abranger a região de interesse ou seja, o padrão de difusão recolhidos bioluminescente.
- Selecione ROIs Medida em Ferramentas de ROI na paleta de ferramentas ea janela de medição de ROI irá aparecer. Os valores totais de Radiance (fótons / s) representa a soma dos pixels bioluminescentes dentro do ROI gerado.
- Escolha o SELECT ALL e guias da cópia no canto inferior direito da janela irá transferir as informações para a área de transferência e permitir colar em programas subsequentes para análise.
- Quantificar os in vivo sinais fluorescentes como a eficiência radiante total ([fótons / s] / [mW / cm 2]) dentro de uma região circular de interesse (ROI) usando Viver software de imagem.
- Dentro da janela software a imagem viva, expanda Ferramentas de ROI na paleta de ferramentas. Selecioneo ícone de círculo e o número de ROIs que corresponde ao número de animais no âmbito do FOV.
- Redimensionar o ROI para abranger a região de interesse correspondente intimamente ao sinal bioluminescente da aquisição da imagem anterior.
- Selecione ROIs Medida em Ferramentas de ROI na paleta de ferramentas ea janela de medição de ROI irá aparecer.
NOTA: eficiência total radiante (fótons [/ s] / [mW / cm 2]) representa a soma dos pixels fluorescentes dentro do ROI. - Selecione Todos e Copiar abas no canto inferior direito da janela irá transferir as informações para a área de transferência e permitir colar em programas subsequentes para análise.
4. μCT Image Acquisition
- Coloque os ratos LysEGFP anestesiados em uma câmara de imagem.
NOTA: Esta câmara de imagem é projetado para caber tanto no sistema de imagem IVIS Spectrum eo Quantum FX in vivo μCT sistema de imagem para permitirco-registro das imagens ópticas e μCT. - Abra o software CT e selecione o menu pré-definido 60 milímetros FOV std dinâmico na lista suspensa.
- Insira a tampa grande furo eo braço adaptador para o transporte de imagens no instrumento.
- Coloque o shuttle de imagem do rato no braço adaptador em seguida, empurre o braço para dentro do furo e feche a porta. Ligue Live Mode (o botão Olho no Painel de Controle) e posicionar o motivo no 0 ° e 90 ° posição pórtico usando o eixo X e controles do eixo Y para centrar o animal na janela de captura X. Em seguida, desligue o Modo ao vivo clicando no Botão dos olhos.
- Adquirir uma imagem de varredura dinâmica com o FOV 60 milímetros, clicando no botão CT Scan (próximo ao botão de modo Live). Exportar a imagem adquirida no formato DICOM e armazenar em um local que pode ser acessado mais tarde.
NOTA: A dose aproximada será de 26 mGy por varredura. Um FOV 30 milímetros pode ser usado se for desejado uma melhor resolução.
5.3D Optical Image aquisição, formação e μCT Co-registo
- Coloque o transporte de inserção de imagem do rato para a Spectrum, posicionando o transporte de imagens contendo o mouse para esta inserção e garantir o mouse não se move.
- Usando imagem viva, selecione Assistente de imagem no Painel de Controle de Aquisição para iniciar a configuração assistente. Para começar, escolha Bioluminescência, então DLIT, em seguida, selecione o repórter "Bactérias" no menu suspenso e os filtros de emissão adequados para o modelo será escolhido automaticamente, neste caso, 500-620 nm.
- Selecione Avançar e, em seguida designar os parâmetros de aquisição e informações de assunto na janela final. Especificamente, Imagem Assunto será Mouse, Auto As definições serão selecionados permitindo exposição automática para maximizar a qualidade do sinal, evitando a saturação, e campo de visão será definido como C - 13 centímetros.
- Selecione Concluir na última janela ea janela seqüência do Painel de Aquisição será umutomatically preenchida com a seqüência DLIT. Haverá uma imagem adquirida por filtro de emissão escolhido e auto-exposição vai escolher as configurações ideais para cada comprimento de onda de acordo com as seleções do Assistente Imaging. A sequência gerada também inclui uma imagem de luz estruturada necessário para a geração de superfície assunto através da ferramenta Superfície Topografia detalhado abaixo.
- Selecione Sequence adquirir para obter os dados DLIT.
- Após a aquisição de imagem está completa, gerar a topografia da superfície. Comece por expandir o guia Superfície Topografia sob a paleta de ferramentas.
- Em seguida, selecione a orientação que reflete com precisão o lado do animal de frente para a câmera ou o topo do instrumento IVIS. Em seguida, clique em Gerar Surface. Cortar a região do FOV que contém o animal.
- Em seguida, use a máscara roxa para definir os limites do animal.
NOTA: A ferramenta de máscara usa contraste de cor para que os animais com pele escura ou pele não vai mascarar de forma adequada a partir da stage. - Selecione Finish ea superfície aparecerá automaticamente. Salve o resultado na aba Superfície Topografia em seguida, fechar a aba que não vamos mais precisar dele.
- Reconstruir a posição fonte óptica 3D usando os algoritmos de reconstrução óptica difusa implementadas em Viver Imagem 22, expandindo a guia DLIT Reconstrução 3D.
- As imagens adquiridas para a sequência DLIT são mostrados.
NOTA: O software verifica automaticamente a qualidade dos dados adquiridos e desmarque imagens considerada muito fraca, ou quando a saturação está presente. Selecione Iniciar no lado inferior direito. - Se necessário, pode-se ajustar o limite para cada imagem bioluminescente clicando duas vezes e usar o slider de limiar no lado inferior esquerdo.
NOTA: esta é, principalmente, a inclusão do sinal de baixa intensidade e cautela deve ser praticado quando limiarizar maior, pois isso pode ajustar a intensidade geral da fonte reconstruído final.
- As imagens adquiridas para a sequência DLIT são mostrados.
- Abra o navegador da DICOM, clicando no ícone 3D na barra de ferramentas na parte superior do software (terceiro a partir da esquerda) e procurar a imagem de Quantum FX adquirido anteriormente.
- Coloque esta imagem na imagem viva guia Exibir 3D clicando duas vezes sobre o arquivo para importação.
NOTA: O fiducial devem ser automaticamente detectados e que a imagem μCT sendo registrado com a imagem óptica em 3D.
- Coloque esta imagem na imagem viva guia Exibir 3D clicando duas vezes sobre o arquivo para importação.
- Desmarque a topografia da superfície mapa visualização expandindo Ferramentas ópticos 3D na paleta de ferramentas e desmarque a caixa de seleção exibição marcada Assunto Superfície na aba Surface.
- Criar manualmente uma tabela de pesquisa para visualizar o esqueleto eo implante K-fio que são visíveis na imagem μCT usando o histograma na guia Volume do 3D Multi-Modaliseção Ferramentas ty da paleta de ferramentas.
- O histograma representa a distribuição das intensidades voxel nos dados volumétricos 3D e sua opacidade cor. Para determinar se o tecido de interesse particular está no histograma, utilizar a ferramenta corrediça para limiar o processamento até que o tecido ou estrutura é visível.
- Em seguida, clique direito no histograma para gerar pontos e formar uma curva para isolar a área do histograma. Isto será repetido para cada estrutura - esqueleto seguido pelo implante K-fio e pode ser salvo como uma tabela de referência para futuras análises.
- Os componentes podem ser codificados por cores se assim o desejar, clicando duas vezes em qualquer ponto gerado no histograma e selecionando a cor desejada na janela pop up.
6. μCT Visualização e Análise de Imagens
- Usando o software Quantum FX, selecione a imagem de interesse e lançar Viewer. Selecione a ferramenta de rotação e reorientar a imagem de visualize o eixo longitudinal do fêmur. Selecione a ferramenta de medição e medir o comprimento do fêmur.
- Inicie o visualizador 3D para gerar desenhos em 3D. Ajuste o limite para mostrar as mudanças na anatomia do osso associadas com a infecção do implante.
- Aplicar planos de corte para que o 3D é limitado à seção transversal desejada da área de interesse no fêmur distal.
- Inicie o pacote de software Analisar 11.0. Carregue o arquivo * .VOX que foi usado para criar a renderização 3D.
- Inicie a ferramenta Image Calculator. Use a ferramenta 'Região Pad' para cortar a imagem (remover planos que não incluem o fêmur).
- Inicie a ferramenta cortes oblíquos. Usar a opção 3 pontos de encontrar pontos no meio do fémur, trocânter maior e a extremidade do pino. Faça esses pontos um plano oblíquo e gerar uma imagem com novas fatias.
- Lançamento da Região de ferramenta de juros. Mostrar os cortes transaxiais. Ajuste o min e max configuraçãos para mostrar o osso cortical. Criar contornos para as fatias correspondentes por várias fatias (com um intervalo aproximado de 5 fatias) para as fatias correspondentes a 25% do distai do fémur. Use a ferramenta "Propagar Regiões interpolar entre estes contornos e criar uma região de interesse 3D. Salve esta região de interesse como um mapa de objeto.
- Inicie a ferramenta 'Opções de exemplo'. Selecione a caixa de seleção para o objecto da carta que acabou de ser criada e selecione os botões de opções para as opções apropriadas. Clique no botão "Configurar Log Stats" para confirmar que a caixa de seleção "Volume" está selecionada. Clique no botão "Imagens de exemplo 'para fazer as medições reais.
- Exportar as medições de volume em um programa de análise de dados. Normalizar os volumes de osso exteriores dos pontos de tempo posteriores para o primeiro ponto de tempo fotografada usando a fórmula: Volume Δ (%) = ([volume (dia X) - Volume (dia 2)] / [volume (dia 2)]) x 100 .
NOTA: Nesta fórmula, o "X" variável representa o ponto de tempo de interesse. O número resultante representará a variação no tamanho do volume do osso externo do fémur distai ao longo do tempo. - Para visualizar a região do 3D de juros em cima do osso, carregar a imagem de CT na ferramenta 'Volume de renderização. Coloque o mapa objeto contendo a região 3D de interesse. Vá para 'View''Objects' e definir o 'Original' ser 'On'. Abra a janela "Preview". Inicie o menu «tornar Tipos" e selecione "de composição de objetos '.
- Clique no botão 'Limite' e ferramenta e ajustar os limiares para mostrar o mapa do osso e objeto. Use a mesma faixa de limiar fixado para todos os momentos. Clique no botão 'Rotação' e definir a orientação a ser uma verdadeira visão ântero-lateral. Clique em 'rende' para gerar a renderização final. Salve a prestação da principal 'VolumeRenderização 'janela.
Representative Results
Em bioluminescente vivo e imagens fluorescentes
No presente estudo, o protocolo é descrito por este modelo já publicado de uma infecção conjunta ortopédico protético em ratinhos 14-19, o qual envolve a colocação cirúrgica de um implante de titânio K-fio que se estende a partir de um canal intramedular do fémur na junta espaço 14-19. S. aureus estirpe bioluminescente Xen29 (1 x 10 3 CFU em 2 mL de PBS) foram pipetados directamente no topo do implante de titânio final na articulação do joelho, antes de fechar o local cirúrgico 16. Para visualizar e quantificar a carga bacteriana e influxo de neutrófilos de forma não invasiva em ratinhos anestesiados LysEGFP, conjunto óptico de imagem in vivo dos animais foi realizada sequencialmente os sinais de imagem a partir de bioluminescentes as bactérias e os sinais fluorescentes a EGFP de neutrófilos que se infiltram através da óptica animal inteiro IVIS Espectro em vivosistema de imagens em três dias de pós-operatório (dias 2, 14 e 28). Os sinais bioluminescentes de camundongos Xen29 infectados permaneceu acima sinais de camundongos infectados por simulação para o período de duração do experimento (Figura 1A, C) 16 fundo. Nosso trabalho anterior demonstrou que os in vivo bioluminescentes sinais aproximada de perto os números do ex vivo UFC isoladas do / tecido ósseo articular e aderente aos implantes 17,18. Além disso, os sinais fluorescentes EGFP foram maiores do que os ratos sham-infectadas em pontos de tempo iniciais, mas aproximou-se dos níveis de fundo, durante o curso da infecção (Figura 2B, C) 16.
Co-registration 3D in vivo de sinais ópticos com imagens μCT
Para visualizar os sinais ópticos (sinais ou seja, bioluminescentes bacteriana e EGFP fluorescentes) no contexto anatômica das articulações do joelho pós-cirúrgicos in 3D, as imagens ópticas geradas usando o sistema de imagem IVIS Spectrum foram co-registradas com imagens μCT gerados usando o sistema de imagem Quantum FX μCT. Esta co-registo pode ser realizado porque a câmara de imagem rato pode ser inserido em qualquer máquina para garantir que os ratinhos estavam na mesma orientação exacta. Para verificar essa precisão, os resultados foram comparados com uma aquisição de imagem realizados utilizando o CT Spectrum-in sistema de imagem IVIS vivo que integra ambas as modalidades em um único instrumento sem a necessidade de deslocamento físico do animal. Para mapear os dados ópticos para as imagens em 3D μCT, utilizamos um algoritmo de reconstrução tomografia óptica difusa 16. A reconstrução 3D resultante é mostrado (Filme 1).
Além disso, μCT imagens permitiu a visualização e quantificação das alterações consequentes na qualidade e dimensões do osso que ocorreu durantea infecção (Figura 2) 16. Como relatado anteriormente, o volume do osso externo do fémur distai aumentado substancialmente ao longo do tempo (Figura 2A) 16. Para quantificar estas alterações, a análise de imagem volumétrica 3D foi realizada na distal 25% da superfície ósseo do fémur e as variações no volume de osso ao longo do tempo foram normalizados para o volume do osso inicial. O volume do osso externo substancialmente aumentado em ratinhos infectados em comparação com os ratinhos infectados de forma simulada (Figura 2B) 16. O aumento no volume de osso do fémur distai exterior era provavelmente devido a danos no osso causada pela infecção do tecido das articulações e ossos, que foram observadas utilizando imagiologia μCT e análise histológica 16.
Figura 1 2D in vivo bioluminescente e sinais fluorescentes. S. aureus Xen29 ou nenhuma bactéria (não infectados) foram inoculados na articulação do joelho, após a colocação do fio e K-LysEGFP ratinhos foram visualizados utilizando o sistema de imagiologia IVIS Espectro 16. (a) média in vivo sinais bioluminescentes tal como medido pelo fluxo total (fotões / sec) ± sem. (B) A média in vivo EGFP sinais fluorescentes como medido pela eficiência de radiação (fotões / sec) total / (mW / cm 2) ± SEM. (C) Representação em bioluminescente vivo e sinais fluorescentes revestida sobre uma fotografia a preto e branco imagem dos ratinhos. O limite de detecção da carga bacteriana in vivo utilizando imagiologia bioluminescente é entre 1 x 10 2 e 1 x 10 3 CFU. * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0,001 ratos Xen29 infectados contra ratos infectados com sham (teste t de Student [bicaudal]). Por favor,note que este é uma figura representativa, que inclui dados publicados anteriormente gerados usando Xen29 e fotografada com o sistema de imagem IVIS Lumina XR 16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 imagem 3D μCT. S. aureus Xen29 ou nenhuma bactéria (não infectados) foram inoculados na articulação do joelho após a colocação do K-wire e camundongos foram fotografados usando o FX Quantum in vivo sistema μCT. (A) renderings 3D Representante μCT de Xen29 camundongos infectado pelo (painéis superiores) e camundongos infectados com sham (painéis inferiores). (B) Porcentagem de variação do volume do osso externo (distal 25% dos fêmures) normalizados para o ti inicialapontar-me (média ± SEM). * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0,001 ratos Xen29 infectados contra ratos infectados com sham (teste t de Student [bicaudal]). Por favor note que este é uma figura representativa, que inclui dados publicados anteriormente gerados utilizando a estirpe bioluminescente S. aureus Xen29 e fotografada com o FX in vivo sistema Quantum μCT imagem 16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1 . Representante 3D anatômico co-registo dos sinais bioluminescentes Xen29 e os sinais fluorescentes EGFP-neutrófilos, em combinação com as imagens μCT. As imagens são giradas sobre o eixo vertical.
Discussion
Imagens multimodalidade como técnicas de imagem que utilizam em imageamento óptico vivo em conjunto com μCT imagem fornece uma nova abordagem tecnológica que permite a visualização em 3D, quantificação e monitorização longitudinal de processos biológicos em um contexto anatômico 1-4. Os protocolos no presente estudo fornecem informação detalhada de como in vivo bioluminescente e imagiologia fluorescente pode ser combinado com μCT imagiologia num modelo de infecção ortopédico protético implante em ratos para monitorizar a carga bacteriana, uma inflamação neutrofílica e alterações anatómicas no osso de forma não invasiva e longitudinalmente ao longo tempo. Tomadas em conjunto, as informações obtidas através da combinação de imagens ópticas e estruturais representa um grande avanço tecnológico, o que pode ser particularmente adequado para estudar os processos biológicos e as condições patológicas que afetam o sistema músculo-esquelético.
Um interesseconstatação ing que deve ser ressaltado é que observamos que os sinais fluorescentes EGFP-neutrófilos diminuiu para níveis de fundo por 14-21 dias e manteve-se em níveis de fundo para a duração do experimento, apesar da presença de bactérias bioluminescentes. É pouco provável que a irradiação com raios-X impactado sobrevivência de neutrófilos como observamos cinética semelhante de sinais de neutrófilos nos ratinhos não irradiado 19. No nosso trabalho anterior envolvendo um modelo de S. aureus feridas infectadas, a infiltração de neutrófilos envolveu uma combinação de recrutamento de neutrófilos robusta a partir da circulação, a sobrevivência prolongada de neutrófilos no local da infecção e o homing de células progenitoras KIT + para o abcesso, onde localmente dar origem a amadurecer neutrófilos 23. É provável que processos semelhantes contribuiu para a infiltração de neutrófilos no implante ortopédico S. modelo aureus. Embora seja desconhecido porque os sinais de neutrófilos diminuída em revmodelo de infecção aedic, pode ser que a resposta imune mudado ao longo do tempo que esta infecção progrediu de uma aguda de infecção crônica e este é um assunto de investigação futura.
Há limitações com este modelo do rato de infecção de prótese articular ortopédica e in vivo de imagens multimodalidade que deve ser observado. Em primeiro lugar, este modelo de rato é uma simplificação dos procedimentos reais e materiais utilizados em cirurgia ortopédica em humanos 24. No entanto, este modelo faz recapitular a infecção crônica e inflamação que se seguiu no osso e tecido comum que é visto em infecções de implantes ortopédicos humanos 8,9. Além disso, para se obter as imagens μCT, relativamente baixas doses de irradiação com raios X foram utilizadas para minimizar os efeitos adversos sobre a saúde dos animais durante o curso da infecção. Para uma melhor resolução do osso, as doses mais elevadas de radiação de raios-X pode ser usado para imagiologia de μCT sacrificados umanimals. No entanto, isso iria eliminar a capacidade de forma não invasiva e longitudinalmente monitorar as alterações ósseas ao longo da duração das experiências.
Em conclusão, a imagiologia multimodal que envolve a combinação de toda in vivo imageamento óptico animal com imagens μCT anatômica permitiu obter informações mais completas sobre a infecção e resposta inflamatória. Além disso, estas técnicas têm permitido a avaliação das consequências da infecção e inflamação no tecido ósseo e articulações. O trabalho futuro poderia tirar proveito de imagens multimodalidade para avaliar a eficácia de terapias antimicrobianas, respostas imunes, patogênese da doença e as mudanças reativas no osso como nós começamos a investigar 14-18. Além disso, a imagem latente multimodalidade poderia avaliar sondas e marcada para diagnosticar a presença de uma infecção, como anteriormente descrito, em modelos animais de infecção coxa, endocardite, Infect pulmonaríons e infecções de biomateriais 25-28. Por fim, o uso da imagem de multimodalidade poderia ser expandido para além das doenças infecciosas e utilizado em todas as disciplinas, incluindo ortopedia, reumatologia e oncologia, para investigar outras doenças que afetem o sistema músculo-esquelético, como o cancro do esqueleto, doença metastática, fraturas e artrite 5-7 .
Disclosures
JAM, BNT, EL, NZ, KPF são funcionários da PerkinElmer, que fabrica os instrumentos de imagem pago, desde que o Xen29 bioluminescente S. aureus tensão, e paga os custos de publicação deste vídeo-artigo. Os demais autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um programa H & H Lee Surgical Residente Research Scholars (de janeiro), uma Fundação AO Start-Up concessão S-12-03M (a LSM) e um dos Institutos Nacionais de Saúde concessão R01-AI078910 (a LSM) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
| Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
| Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
| LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
| Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
| Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
| Wire Cutter - Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
| Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
| Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
| Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
| Quantum FX in vivo µCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | µCT in vivo imaging system | |
| IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and µCT in vivo imaging system | |
| Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |
References
- Dothager, R. S., et al. Advances in bioluminescence imaging of live animal models. Curr Opin Biotechnol. 20, 45-53 (2009).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging progress and applications. Trends Biotechnol. 29, 624-633 (2011).
- Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging current applications and future directions. J Nucl Med. 49, 1-4 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- Reumann, M. K., Weiser, M. C., Mayer-Kuckuk, P. Musculoskeletal molecular imaging a comprehensive overview. Trends Biotechnol. 28, 93-101 (2010).
- Snoeks, T. J., Khmelinskii, A., Lelieveldt, B. P., Kaijzel, E. L., Lowik, C. W. Optical advances in skeletal imaging applied to bone metastases. Bone. 48, 106-114 (2011).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Del Pozo, J. L., Patel, R. Clinical practice. Infection associated with prosthetic joints. N Engl J Med. 361, 787-794 (2009).
- Parvizi, J., Adeli, B., Zmistowski, B., Restrepo, C., Greenwald, A. S. Management of periprosthetic joint infection the current knowledge AAOS exhibit selection. J Bone Joint Surg Am. 94, e104 (2012).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Speziale, P., Montanaro, L., Costerton, J. W. Biofilm formation in Staphylococcus implant infections. A review of molecular mechanisms and implications for biofilm-resistant materials. Biomaterials. 33, 5967-5982 (2012).
- Zimmerli, W., Moser, C. Pathogenesis and treatment concepts of orthopaedic biofilm infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 158-168 (2012).
- Cram, P., et al. Total knee arthroplasty volume utilization and outcomes among Medicare beneficiaries 1991-2010. JAMA. 308, 1227-1236 (2012).
- Wolf, B. R., Lu, X., Li, Y., Callaghan, J. J., Cram, P. Adverse outcomes in hip arthroplasty long-term trends. J Bone Joint Surg Am. 94, (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5, (2010).
- Bernthal, N. M., et al. Protective role of IL-1beta against post-arthroplasty Staphylococcus aureus infection. J Orthop Res. 29, DOI. 1621-1626 (2011).
- Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and µCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS ONE. 7, e47397 (2012).
- Niska, J. A., et al. Daptomycin and tigecycline have broader effective dose ranges than vancomycin as prophylaxis against a Staphylococcus aureus surgical implant infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 56, 2590-2597 (2012).
- Niska, J. A., et al. Vancomycin-Rifampin Combination Therapy has Enhanced Efficacy Against an Experimental Staphylococcus aureus Prosthetic Joint Infection. Antimicrob Agents Chemother. 57, 5080-5086 (2013).
- Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. J Orthop Res. 30, 335-340 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Direct continuous method for monitoring biofilm infection in a mouse model. Infect Immun. 71, 882-890 (2003).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007 (2007).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117, 3343-3352 (2011).
- Deirmengian, C. A., Lonner, J. H. What's new in adult reconstructive knee surgery. J Bone Joint Surg Am. 94, 182-188 (2012).
- Ning, X., et al. Maltodextrin-based imaging probes detect bacteria in vivo with high sensitivity and specificity. Nat Mater. 10, 602-607 (2011).
- Panizzi, P., et al. In vivo detection of Staphylococcus aureus endocarditis by targeting pathogen-specific prothrombin activation. Nat Med. 17, 1142-1146 (2011).
- van Oosten, M., et al. Realtime in vivo imaging of invasive and biomaterial associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nat Commun. 4, 2584 (2013).
- Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous beta lactamase reporter enzyme fluorescence in live mice. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 12239-12244 (2010).
