Abstract
化学疗法的某些类可能施加急性血管变化，可能进展成长期条件可能会使病人血管并发症的风险增加。然而，尽管所述安装临床证据，有血管毒性，因此，血管/心血管病症一组异质性的病因的明确研究的缺乏尚待阐明。此外，该可依据血管毒性的机制可以完全由化疗引起的心脏毒性，这是直接细胞损伤相关的原理不同。我们建立了实时， 体内分子成像平台以评价抗癌疗法的潜在急性血管毒性。
我们已经建立了体内 ，小鼠的高分辨率分子成像，一个平台适用于密闭机关和参照一个BLO内血管可视化而每个单独的同一个体内外径船只充当其自身的控制。阿霉素给药后的血管壁均受损，代表血管毒性的一个独特的机制，可能是在终末器官损伤的早期事件。在此，纤维状共聚焦荧光显微镜（FCFM）基于成像的方法进行说明，它提供了一个创新的方式来了解生理现象在细胞和亚细胞水平的动物受试者。
Introduction
临床证据表明，几类化疗引起的各种由雷诺现象，高血压，心肌梗死，脑血管攻击，肝静脉occlusivedisease 1,2体现血管病症。 “'意外'抗血管生成药物”是一个相当新的名词，它描述了传统的化疗药物是作为可能的血管生成抑制剂，虽然他们不是最初开发用于这一目的3-5，但设计的征收尽可能少的消除肿瘤细胞的“抵押品损害“正常细胞尽可能3。几种化疗已经暗示为血管 - 毒物在应用血清生物标记物的临床研究中观察到。在这些被烷化剂（如环磷酰胺），铂化合物（例如顺铂）和蒽环类1,2,5-7。
急性心脑血管并发症，可能会出现一个resul吨血管毒性化疗所致的。他们可能会进步到像动脉粥样硬化，占后期血管发病的危险性增加慢性疾病。然而，尽管安装的临床证据，有指定的研究强调血管毒性的机制的缺乏，因此，它们造成的确切发病机理的进一步澄清是必要的。
在揭示化疗引起的血管毒性机制的一个主要挑战来源于体内调查血管功能的复杂性。我们描述了本文中的高清晰度的体内分子成像的小鼠，使捕捉血流和血管'特性的一个平台。这个平台便于直接治疗性血管效应的检测：实时，以及跟随它们过了一段时间的同一个体中。
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Protocol
伦理学声明：所有实验均批准的机构动物护理和使用委员会。根据机构指引照顾动物了。 ICR雌性小鼠（7 - 8周龄，25 - 30克）被安置在了空调，光控动物特拉维夫大学医学系赛克勒设施。在术语，动物安乐死麻醉过量。
1. Fibred共聚焦荧光显微镜（FCFM）校准
- 打开该设备。
- 连接探针（mini0 / 30）。
- 根据制造商的说明校准装置。
2.准备小鼠成像
- 通过皮下注射既Ketaset（100毫克/千克）和XYL-M2（6毫克/千克）的麻醉。确定合适的麻醉通过反应迟钝到脚趾捏。
- 切开腹股沟皮肤下面以揭示了股动脉血管。请跟随切口切口部位湿润用生理盐水。
- 用袋（或手套）约30秒盛有温水（不烫手）加热尾巴。制备的静脉内（IV）的分流为FITC葡聚糖（造影剂）的施用与盐水或化疗剂，通过插入一针（30克，1/2英寸）至尾静脉，并附加一个1ml注射器将其。确保静脉注射生理盐水打开。
注：FITC葡聚糖的IV施用（高分子量; 100微升; 10毫克/毫升; 2000 kDa的）便于可视化股骨微血管由FCFM。阿霉素（100微升; 8毫克/公斤，阿霉素），或盐水也将在后面IV施用到预加热的尾静脉。 - 仰起将鼠标上的聚苯乙烯阶段。确保鼠标垫，用手术胶带保持位置。
注意：在此研究中使用的纤维质共聚焦显微镜包括两个单元：（1）微探针（mini0 / 30）。 （2）激光扫描单元（LSU-488; 488nm的波长下）。
- 执行所有时间圈分析使用LSU 488纳米波长的激光。
注：主单元探测器探测过滤（500 - 650纳米）发出荧光。所获取的图像被事后重建，并在12帧/秒的速率显示。 - 小心地断开从针的注射器，并附加包含FITC标记的葡聚糖的新注射器。管理（IV）100微升FITC右旋糖酐。
- 移的探针（mini0 / 30），视合适字段和固定它，以下调整z轴，以获得相应的图像。等待开始信号淡出直到一个明确的和聚焦的信号是VISIBLE。
- 记录基线血流短暂的稳定期（〜30秒）。然后连接到另一针注射器，要么含有阿霉素或生理盐水。四，管理100微升阿霉素或生理盐水。
- 监视注入FITC-葡聚糖的流量连续地进行20分钟。在FCFM相关软件，使用直径按钮的上标尺以测量血管和它们分类为小（<15微米）或大（> 15微米）。
- 安乐死麻醉过量的动物。
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Representative Results
体内连续成像在实时
此处所使用的成像装置是一个高清晰度，纤维状共焦显微镜，装备有探针，使脉管的可视化和其响应于各种刺激如化疗。这种方法是微创因为尽管它可以便于深血管或器官的成像，它需要一个小切口的探针。探头束组成的纤维，光学显微镜和专有精密连接器数万。的示意图示于图1。
股骨头微血管成像
在注射FITC葡聚糖小鼠FCFM;根据血管直径我们已经分类的股血液的血管网络（15微米的小<大的15微米>）。一种快速收缩 - 小型船只（2 5分钟）诱导阿霉素。一个完整的disappearan在FITC葡聚糖荧光的CE，8分钟后阿霉素治疗（ 图2A如箭头; 视频1）。在几个小鼠中，降低血液中的容器中的荧光信号，并提高它的周围观察到血管周围区域，阿霉素给药后的几秒钟（ 图2B克 ，箭头）信号。这些结果表明，增加高分子量葡聚糖的血管渗透性和泄漏从血管周围组织。无荧光信号明显下阿霉素在以前未用FITC葡聚糖小鼠注射给药。紫杉醇治疗的小鼠表现出类似的血管结构和流速，以那些在盐水注射的小鼠（未示出）观察到的，在整个测量周期。
图1. FCFM这里使用由两个单元的共焦显微镜：微探针（mini0 / 30）和所述激光扫描单元（LSU-488; 488nm的波长）。
FITC葡聚糖荧光信号图2.意象股微血管。船只二分法分为轻微（<15微米）或者重大（> 15微米）根据自己的才干。的FITC葡聚糖的股骨微血管（100微升; 10毫克/毫升）。注射小鼠之前，要么阿霉素或生理盐水IV施用期间成像（A）中的次要船只，由FCFM成像，开始阿霉素在给药后2分钟血管收缩敏锐（六，箭头），显示出荧光信号，直到其完全消失的连续变窄，与信号的n个过程中没有明显的恢复恢复分机八分钟实时成像的（g，箭头）的。（B）的外观，在一些快照，围绕化疗注射的小鼠（克箭头）注射后立即的血管壁的“朦胧”的面积，表示潜在葡聚糖-FITC泄漏。 请点击此处查看该图的放大版本。
视频1股微血管成像。一位代表拍下FITC葡聚糖荧光未成年人（直径<15微米）血管膜。卵巢癌和股骨微血管时间圈摄影：注射用100μl的FITC葡聚糖（10毫克/毫升）的小鼠进行成像，并从多柔比星的IV施用的时刻拍摄。 2 - 阿霉素注射后5分钟，轻微血管呈急剧收缩随后的荧光信号的彻底废除，后处理方法已经8分吨。 （AVI）， 请点击此处观看该视频。
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Discussion
评价化疗诱导的血管毒性是具有挑战性，因为在可视化血管的动态响应于实时一个刺激的难度。大量临床研究已经牵连的几个化疗造成直接损伤血管，但这种毒性的机制和特点仍有待澄清。我们建立了实时， 体内分子成像的平台如本文8-10描述评价化疗在含有纤维状共聚焦荧光显微镜的小鼠的潜在血管毒性。这种高解析度的分子的小鼠成像是适合用于可视化动脉血流和血管'架构。它使实时检测的治疗引起的并发症的相同的动物在一段延长的时间。我们评估了两个类化学疗法的：这是已知的阿霉素是有毒的内皮细胞在体外以及在组织■从阿霉素10-15，和紫杉醇作为对照化疗其中前者的证据对任何血管的效果是非常有限的处理的动物获得的。
FCFM的激光扫描共聚焦技术，有利于跟踪的实时荧光染色深部组织，并产生血管的时间推移视频图像在体内 9。在我们的研究FCFM下观察阿霉素的急性血管作用，作为原型vasculotoxic剂。这种效果，开始阿霉素用药后不久，是依赖于血管的大小：小船只的直径，更突出的伤害。的小直径的荧光信号（<15微米）血管逐渐减少作为引起阿霉素恒定血管收缩的结果。实时成像接下来的8分钟期间，没有检测到明显的恢复。大直径（> 15微米）的船只较少受损;诚信他们的墙被攻破，表现出不规则的表面。这些效果是独一无二的阿霉素和分别当紫杉醇是利用并不明显，这表明此方法描绘精心药物的具体效果。
修改和故障排除
在整个协议中，激光功率可以被基线录制过程中为了说明船只改变。但是，激光功率必须不能在实验过程中改变。此外，高的激光功率可能在时间漂白荧光剂。此外，一旦记录完成，所以能够改变电影的对比度和编辑其长度和速度。血管的测量随后可以作出，而发生变化，可以遵循。
技术和关键步骤的限制
该FCMF设备有一些限制。感兴趣区域（ROI）的区域时可能会改变成像时间。此外，成像区域可能干出;人们应该保持水润的区域。所述荧光剂可漂白和信号将丢失。应该注意的一个关键步骤是保持动物和很好的固定，以避免投资回报率的变化探头。
意义和未来的应用
既定的实验平台可作为一个立即测试为响应于化疗或备选地作为一个潜在的生物标记物来表征潜在血管毒性特征。基于对血管损伤的研究机构中，该方法也可用于评估潜在剂在将来有用指定，以减少血管毒性化疗诱导。需要减少潜在的长期血管并发症的癌症幸存者驱使我们去探索背后化疗引起的血管毒性的机制。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| general anesthesia | Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France | 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2 | |
| depilatory cream (Veet) | ReckittBenckiser, Bristol, UK | ||
| 30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe | |||
| FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μl volume |
| Doxorubicin | Teva, Israel | 8 mg/kg, Adriamycin | |
| paclitaxel | Taro, Israel | 1.2 mg/kg, Medexel | |
| saline |
References
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