Abstract
Visse klasser av chemotherapies kan utøve akutte vaskulære endringer som kan utvikle seg til langsiktige rammebetingelser som kan disponere pasienten til en økt risiko for vaskulær sykelighet. Likevel, om enn monterings kliniske bevis, er det mangelen på tydelige undersøkelser av vaskulær toksisitet og derfor etiologien av en heterogen gruppe av vaskulære / kardiovaskulære forstyrrelser, gjenstår å bli belyst. Videre kan den mekanismen som kan ligge til grunn for vaskulær toksisitet helt forskjellig fra prinsippene ved kjemoterapi-indusert kardiotoksisitet, som er knyttet til direkte myocyte skade. Vi har etablert en real-time, in vivo molekylær avbildning plattform for å vurdere potensialet akutt vaskulær toksisitet av anti-kreft terapi.
Vi har satt opp en plattform av in vivo, høy oppløsning molekylær avbildning i mus, egnet for å visualisere blodkar innenfor trange organer og referanse blood skip innen de samme individene, mens hver enkelt tjene som sin egen kontroll. Blodåreveggene ble svekket etter doxorubicin administrasjon, som representerer en unik mekanisme av vaskulær toksisitet som kan være tidlig hendelse i skader på indre organer. Her, er metoden for fibered konfokal fluorescerende mikroskopi (FCFM) basert bildebehandling beskrevet, som gir en innovativ modus for å forstå fysiologiske fenomener på celle- og sub-cellulære nivåer i dyre fag.
Introduction
Kliniske bevis indikerer at flere klasser av chemotherapies lokke fram en rekke vaskulære sykdommer manifestert ved Raynauds fenomen, hypertensjon, myocardialinfarction, cerebrovaskulær angrep, og lever pulmonal occlusivedisease 1,2. "'Ufrivillig' antiangiogene narkotika" er et relativt nytt begrep, som beskriver konvensjonelle kjemoterapeutika som fungerer som mulige angiogenesehemmere, selv om de ikke opprinnelig utviklet for dette formålet 3-5, men laget for å fjerne kreftceller ved å pålegge så lite "collateral skade "til normale celler som mulig tre. Flere chemotherapies har vært antydet som vasculo-miljøgifter som er observert i kliniske studier med serum biomarkører. Blant disse er alkyleringsmidler (for eksempel cyklofosfamid), platinaforbindelser (for eksempel cisplatin) og antracykliner 1,2,5-7.
Akutte kardiovaskulære komplikasjoner kan oppstå som et result av vaskulær toksisitet forårsaket av kjemoterapi. De kan utvikle seg til kroniske tilstander som åreforkalkning og konto for økt risiko for sent vaskulær sykelighet. Men til tross for montering kliniske bevis, er det en mangelen av angitte studier med vekt på mekanismen av vaskulær toksisitet, og derfor er ytterligere belysning av den nøyaktige patogenesen de påfører berettiget.
En stor utfordring i å avsløre mekanismen av kjemoterapi-indusert vaskulær toksisitet stammer fra kompleksiteten i å undersøke vaskulær funksjon in vivo. Vi beskriver her en plattform med høy oppløsning in vivo molekylær avbildning i mus som gjør det mulig å fange opp blodgjennomstrømningen og skipenes egenskaper. Denne plattformen muliggjør deteksjon av direkte behandling induserte vaskulære virkninger: i sann tid, så vel som følger dem i løpet av en tidsperiode i løpet av de samme individer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Alle forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité. Dyr omsorg var i henhold til institusjonelle retningslinjer. ICR hunnmus (7-8 uker gammel, 25-30 g) ble plassert i luftkondisjonerte, lys kontrollert dyre fasilitetene på Sackler medisinske fakultet i Tel-Aviv University. På sikt, ble dyrene avlivet med bedøvelse overdose.
1. fibre Confocal Fluorescensmikroskopi (FCFM) Kalibrering
- Slå på strømmen.
- Koble onde (mini0 / 30).
- Kalibrere enheten i henhold til produsentens instruksjoner.
2. Mus Forberedelse til Imaging
- Bedøve av en subkutan injeksjon av både Ketaset (100 mg / kg) og Xyl-M2 (6 mg / kg). Bekreft riktig anesthetization ved manglende respons på tå-klemme.
- Innsnittet i huden under lysken for å kunne avdekke femoral arterielle fartøy. Hold snittet området fuktig med saltvann etter snittet.
- Varm halen ved å bruke en pose (eller en hanske) fylt med varmt vann (ikke for varm) for ca 30 sek. Tilbered en intravenøs (IV) shunt for administrering av FITC-dekstran (et kontrastmiddel), og av enten saltvann eller kjemoterapeutisk middel, ved å sette inn en kanyle (30 g, 1/2 tomme) i halevenen, og å feste en 1 ml sprøyte til det . Sikre venen er åpen ved å injisere saltvann.
MERK: En IV administrering av FITC-dekstran (med høy molekylvekt; 100 ul, 10 mg / ml; 2000 kDa) gjør det lettere å visualisere den femorale mikrovaskulaturen ved FCFM. Doksorubicin (100 ul; 8 mg / kg, Adriamycin) eller saltvann vil også senere administrert IV i den på forhånd oppvarmede halevenen. - Før musen supinely på en polystyren scenen. Fest musen til puten og opprettholde posisjonen ved hjelp av kirurgisk duct tape.
MERK: fibered konfokalmikroskop brukt i denne studien består av to enheter: (1) mikroprobe (mini0 / 30). (2) Laserskanning enheten (LSU-488, 488 nm bølgelengde).
- Utføre all time-laps analyser ved hjelp av LSU 488 nm bølgelengde laser.
MERK: Hovedenheten Detektoren registrerer filtrert (500-650 nm) slippes fluorescens. De oppkjøpte bilder er rekonstruert etterpå og vises med en hastighet på 12 bilder / sek. - Koble nøye sprøyten fra nålen og feste en ny sprøyte inneholder FITC dekstran. Administrere (IV) 100 ul av FITC-dekstran.
- Forskyve mikrosonde (mini0 / 30) til en passende synsfelt og fiksere den, etter justering til z-aksen, for å oppnå det tilsvarende bilde. Vent til den første signal å falme til en klar og fokusert signal er visibare.
- Spill inn en baseline blodstrøm for en kort stabiliseringsperiode (~ 30 sek). Deretter kobler til nålen annen sprøyte, som inneholder enten doksorubicin eller saltvann. IV administrere 100 mikroliter doxorubicin eller saltvann.
- Overvåke strømmen av injisert FITC-dekstran kontinuerlig i 20 min. På FCFM-tilknyttet programvare, bruk knappen diameter på den øvre linjalen for å måle blodårene og kategorisere dem som små (<15 mikrometer) eller store (> 15 mikrometer).
- Avlive dyret med anestesi overdose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo kontinuerlig bildebehandling til sanntid
Bilde apparat som brukes her er en high definition, fibered konfokal mikroskop, utstyrt med en sonde som muliggjør visualisering av blodkar og dens respons på ulike stimuli som cellegift. Denne metoden er minimalt invasiv, siden selv om det kan legge til rette for avbilding av dype kar eller organ, krever det et lite innsnitt for sonden. Sonde bunter består av titusenvis av fiber, mikroskop optikk og en proprietær presisjon kontakt. En skjematisk fremstilling er vist i figur 1.
Avbildning av femoral microvasculature
Vi har klassifisert nettverket av femoral blod vaskulatur ifølge fartøy diameter (liten <15 um, stort> 15 um) av FCFM i mus injisert med FITC-dekstran. En rask vasokonstriksjon (2 - 5 min) av små fartøy ble indusert av doxorubicin. En komplett disappearance av FITC- dekstran fluorescerende, 8 min post doxorubicin behandling (Figur 2A f.eks, piler, Video 1). I flere mus, reduksjon av det fluorescerende signal i blodkaret og øke signal på dens omgivelser ble observert i perivaskulær region, et par sekunder etter administrering doksorubicin (figur 2B g, piler). Disse resultatene indikerer at økningen i fartøyet permeabilitet og lekkasje av den høymolekylære dekstran fra blodkaret til de omgivende vev. Ingen fluorescens signal var tydelig etter administrasjon av doxorubicin i mus som ikke ble injisert tidligere med FITC- dekstran. Paclitaxel-behandlede mus viste lignende blod fartøy struktur og strømningsrate til de som ble observert i saltvann-injisert mus (ikke vist), gjennom hele måleperioden.
Figur 1. FCFM Den konfokal mikroskop som brukes her er sammensatt av to enheter: mikros (mini0 / 30) og laserskanning enhet (LSU-488, 488 nm bølgelengde)..
Figur 2. Bilder av FITC- dekstran fluorescenssignal i lårbens microvasculature. Vessels ble dichotomously klassifisert til mindre (<15 mikrometer) eller større (> 15 mm) i henhold til deres kaliber. Femoral mikrovaskulaturen av FITC-dekstran (100 ul, 10 mg / ml). Injiserte mus ble avbildet før og under IV administrering av enten doksorubicin eller saltvann (A) De mindre fartøyer, fotografert ved FCFM, begynte vasoconstricting akutt 2 min etter doksorubicin administrering (f , pil), som viser en kontinuerlig innsnevring av det fluorescente signalet til dens fullstendige forsvinning, uten gjenvinning tilsynelatende bedring av signalet i løpet av next åtte minutter av real-time imaging (g, pil). (B) Utseende, i noen øyeblikksbilder, av en "tåkete" området rundt blodkar vegger av kjemoterapi-injisert mus (g pil) umiddelbart etter injeksjon, indikerer potensiell dekstran-FITC lekkasje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1. Femoral mikrovaskulaturen bildebehandling. En representant fotografert film av FITC- dekstran fluorescerende moll (<15 mikrometer i diameter) blodkar. Eggstokkreft og femoral microvasculature tid runder fotografering: mus injisert med 100 ul FITC- dekstran (10 mg / ml) ble fotografert og fotografert fra det øyeblikk av intravenøs administrering av doxorubicin. 2-5 min etter doxorubicin injeksjon, mindre fartøy viste dramatisk vasokonstriksjon etterfulgt av fullstendig avskaffelse av den fluorescerende signal, allerede åtte minutter etter behandlit. (AVI) Klikk her for å se denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evaluering av kjemoterapi-indusert vaskulær toksisitet er vanskelig på grunn av vanskeligheten med å visualisere dynamikken i vaskulaturen i respons på en stimulus i real-time. Utallige kliniske studier har implisert at flere kjemoterapier føre direkte vaskulær skade, men mekanismen og egenskaper av denne toksisitet er ennå ikke klarlagt. Vi har etablert et sanntids, in vivo avbildning molekyl plattform for å evaluere den potensielle toksisitet av vaskulær kjemoterapi hos mus bestående av fibered konfokal mikros fluorescerende som beskrevet heri 8-10. Dette høyoppløselige molekylær avbildning av mus som er egnet for visualisering av arteriell blodstrøm og skipenes arkitektur. Det muliggjør sporing i sanntid av behandlings-indusert komplikasjoner i det samme dyr over en forlenget periode. Vi evaluerte to klasser av chemotherapies: doxorubicin som er kjent for å være giftig for endotelceller in vitro så vel som i vevs oppnådd fra dyr behandlet med doksorubicin 10 til 15, og paclitaxel som en kontroll kjemoterapi for hvilke det tidligere bevis for noen vaskulære virkning er meget begrenset.
Laserskanning konfokal teknologi FCFM forenkler sporing fluorescens-farget dype vev på sanntid og produserer time-lapse videobilder av blodkar in vivo 9. I vår studie FCFM ble benyttet for å observere den akutte vaskulære effekt av doxorubicin, som en prototype vasculotoxic middel. Denne effekten, som begynte kort tid etter doxorubicin administrasjon, var avhengig av blodkar størrelse: jo mindre skipenes diameter, jo mer fremtredende skaden. Fluorescens-signalet for liten diameter (<15 um) fartøyer redusert gradvis som et resultat av konstant fartøy innsnevring forårsaket av doxorubicin. Ingen tilsynelatende bedring ble oppdaget i løpet av de neste 8 min av sanntids bildebehandling. Stor diameter (> 15 mikrometer) fartøyene var mindre skadet; integritetenav deres veggen ble kompromittert, viser en uregelmessig overflate. Disse effektene var unike for doksorubicin og var ikke tydelig når paclitaxel ble anvendt, som indikerer at denne metodikken avtegner omhyggelig den spesifikke virkning av medikamentet.
Modifikasjoner og feilsøking
Gjennom protokollen, kan lasereffekten endres under referanse opptaket for å illustrere fartøyene. Imidlertid må laser makt ikke endres under forsøket. I tillegg, kan en høy lasereffekt bleke fluorescens middel under gangen. I tillegg, når opptaket er ferdig, er det mulig å endre kontrasten i filmen og redigere sin lengde og hastighet. Målinger av fartøyene kan så lages og endringer som skjer, kan følges.
Begrensninger av teknikk og kritiske trinn
Den FCMF enheten har få begrensninger. Regionen av interesse (ROI) kan endres i løpetbilde tid. I tillegg kan det avbildes området tørke ut; man bør holde området hydrert. Fluorescens middel kan bleke og signalet går tapt. Ett kritisk punkt man bør ta hensyn til er å holde dyret og sonden godt fast for å unngå endringer av ROI.
Betydning og fremtidige applikasjoner
Den etablerte forsøksplattform kan tjene som en test for øyeblikkelig respons på kjemoterapi eller alternativt som en potensiell biologisk markør for å karakterisere den potensielle vaskulær toksisitetsprofil. Basert på studert mekanismen for vaskulær svekkelse, kan fremgangsmåten også være nyttig i fremtiden for å evaluere potensielle midler som er angitt for å redusere vaskulær toksisitet indusert av kjemoterapi. Behovet for å redusere de potensielle langsiktige vaskulære komplikasjoner i kreft overlevende driver oss til å utforske mekanismen bak cellegiftindusert vaskulær toksisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| general anesthesia | Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France | 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2 | |
| depilatory cream (Veet) | ReckittBenckiser, Bristol, UK | ||
| 30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe | |||
| FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μl volume |
| Doxorubicin | Teva, Israel | 8 mg/kg, Adriamycin | |
| paclitaxel | Taro, Israel | 1.2 mg/kg, Medexel | |
| saline |
References
- Chow, A. Y., et al. Anthracyclines cause endothelial injury in pediatric cancer patients: a pilot study. J Clin Oncol. 24 (6), 925-928 (2006).
- Nuver, J., et al. Acute chemotherapy-induced cardiovascular changes in patients with testicular cancer. J Clin Oncol. 23 (36), 9130-9137 (2005).
- Vos, F. Y., et al. Endothelial cell effects of cytotoxics: balance between desired and unwanted effects. Cancer Treat Rev. 30 (6), 495-513 (2004).
- Kerbel, R. S., et al. 'Accidental' anti-angiogenic drugs. anti-oncogene directed signal transduction inhibitors and conventional chemotherapeutic agents as examples.Eur. J Cancer. 36 (10), 1248-1257 (2000).
- Soultati, A., et al. Endothelial vascular toxicity from chemotherapeutic agents: preclinical evidence and clinical implications. Cancer Treat Rev. 38 (5), 473-483 (2012).
- Tempelhoff, G. F., et al. Blood coagulation during adjuvant epirubicin/cyclophosphamide chemotherapy in patients with primary operable breast cancer. J Clin Oncol. 14 (9), 2560-2568 (1996).
- Ben Aharon, I., et al. Doxorubicin-induced vascular toxicity--targeting potential pathways may reduce procoagulant activity. PLoS One. 8 (9), e7515 (2013).
- Laemmel, E., et al. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Al-Gubory, K. H., Houdebine, L. M. In vivo imaging of green fluorescent protein-expressing cells in transgenic animals using fibred confocal fluorescence microscopy. Eur J Cell Biol. 85 (8), 837-845 (2006).
- Bar-Joseph, H., et al. In vivo bioimaging as a novel strategy to detect doxorubicin-induced damage to gonadal blood vessels. PLoS One. 6 (9), e23492 (2011).
- Kaushal, V., Kaushal, G. P., Mehta, P. Differential toxicity of anthracyclines on cultured endothelial cells. Endothelium. 11 (5-6), 253-258 (2004).
- Kim, E. J., et al. Doxorubicin-induced platelet cytotoxicity: a new contributory factor for doxorubicin-mediated thrombocytopenia. J Thromb Haemost. 7 (7), 1172-1183 (2009).
- Walsh, J., Wheeler, H. R., Geczy, C. L. Modulation of tissue factor on human monocytes by cisplatin and adriamycin. Br J Haematol. 81 (4), 480-488 (1992).
- Kotamraju, S., et al. Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species. J Biol Chem. 275 (43), 33585-33592 (2000).
- Vasquez-Vivar, J., et al. Endothelial nitric oxide synthase-dependent superoxide generation from adriamycin. Biochemistry. 36 (38), 11293-11297 (1997).
