Abstract
Certaines classes de chimiothérapies peuvent exercer changements vasculaires aiguës qui peuvent évoluer dans des conditions à long terme qui peuvent prédisposer le patient à un risque accru de morbidité vasculaire. Pourtant, bien que les preuves cliniques de montage, il ya un manque d'études claires de toxicité vasculaire et donc l'étiologie d'un groupe hétérogène de vasculaires / troubles cardiovasculaires reste à élucider. En outre, le mécanisme qui peut expliquer la toxicité vasculaire peut différer complètement les principes de la cardiotoxicité induite par la chimiothérapie, qui est liée à une lésion directe des myocytes. Nous avons établi un temps réel, in vivo plate-forme d'imagerie moléculaire pour évaluer la toxicité vasculaire aigu potentiel des thérapies anti-cancéreuses.
Nous avons mis en place une plate-forme d'in vivo, l'imagerie moléculaire à haute résolution chez la souris, adapté pour visualiser la vascularisation au sein des organes confinés et blo de référenceod navires dans les mêmes individus, alors que chaque individu servent de son propre contrôle. les parois des vaisseaux sanguins ont été altérées après l'administration de la doxorubicine, représentant un mécanisme unique de toxicité vasculaire qui peut être le cas au début de blessures des organes cibles. Ici, la méthode de microscopie confocale à fluorescence (FCFM) imagerie basée fibrée est décrite, qui fournit un mode innovant de comprendre les phénomènes physiologiques aux niveaux cellulaire et sub-cellulaire dans les matières animales.
Introduction
Les données cliniques indiquent que plusieurs classes de chimiothérapies provoquent une variété de pathologies vasculaires qui se manifestent par un phénomène de Raynaud, l'hypertension, myocardialinfarction, attaque vasculaire cérébrale et hépatique veino-occlusivedisease 1,2. «Médicaments anti-angiogéniques 'accidentelle'" est un terme relativement nouveau, qui décrit des agents chimiothérapeutiques classiques qui agissent comme inhibiteurs de l'angiogenèse possibles, même si elles pas à l'origine développé à cet effet 3-5 mais conçus pour éliminer les cellules tumorales en imposant aussi peu "garantie dommages "pour les cellules normales que possible trois. Plusieurs chimiothérapies ont été implicite que vasculo-toxiques comme observé dans les études cliniques utilisant des biomarqueurs sériques. Parmi ceux-ci sont des agents (tels que le cyclophosphamide), les composés du platine tels que le cisplatine () et anthracyclines 1,2,5-7 alkylation.
Complications cardiovasculaires aiguës peuvent se produire en result de la toxicité vasculaire induite par la chimiothérapie. Ils peuvent évoluer vers des affections chroniques comme l'athérosclérose et considération pour le risque accru de morbidité vasculaire tard. Pourtant, en dépit des preuves cliniques de montage, il ya un manque d'études désignés soulignant le mécanisme de toxicité vasculaire et par conséquent, de plus amples éclaircissements de la pathogénie exacte qu'ils infligent est justifiée.
Un défi majeur dans révélant le mécanisme de toxicité vasculaire induite par la chimiothérapie découle de la complexité de l'enquête la fonction vasculaire in vivo. Nous décrivons ici une plate-forme de haute résolution en imagerie moléculaire in vivo chez la souris qui permet de capturer le flux sanguin et des caractéristiques de navires. Cette plate-forme facilite la détection des effets directs induits par le traitement vasculaires: en temps réel, ainsi que de les suivre sur une période de temps dans les mêmes individus.
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Protocol
Déclaration éthique: Toutes les expériences ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle. les soins des animaux était selon les directives institutionnelles. Souris ICR femelle (7 - 8 semaines; 25-30 g) ont été logés dans la climatisation, l'éclairage contrôlé les animaleries de la Faculté de médecine Sackler de l'Université de Tel-Aviv. À terme, les animaux ont été euthanasiés à un surdosage anesthésie.
1. fibré confocale microscopie de fluorescence (FCFM) Calibration
- Allumer l'appareil.
- Connectez le microsonde (mini0 / 30).
- Calibrer l'appareil selon les instructions du fabricant.
2. Préparation souris for Imaging
- Anesthetize par une injection sous-cutanée de deux Ketaset (100 mg / kg) et XYL-M2 (6 mg / kg). Confirmez anesthésie appropriée par l'absence de réponse aux pieds-pincement.
- Inciser la peau en dessous de l'aine pour révéler les vaisseaux artériels fémoraux. Gardez le site d'incision humide avec une solution saline suivante incision.
- Chauffer la queue en utilisant un sac (ou un gant) rempli d'eau tiède (pas trop chaude au toucher) pendant environ 30 secondes. Préparer une administration intraveineuse (IV) de dérivation pour l'administration de FITC dextran (agent de contraste) et de sérum physiologique ou un agent chimiothérapeutique, en insérant une aiguille (30 G, 1/2 de pouce) dans la veine caudale et la fixation d'une seringue de 1 ml de ce . Vérifiez la veine est ouverte en injectant une solution saline.
REMARQUE: Une administration intraveineuse de FITC dextran (poids moléculaire élevé; 100 ul; 10 mg / ml; 2,000 kDa) facilite la visualisation de la microvascularisation fémoral par FCFM. La doxorubicine (100 ul; 8 mg / kg, l'adriamycine) ou une solution saline sont également plus tard administrés IV dans la veine caudale préchauffé. - Placez la souris passivement sur une scène de polystyrène. Fixez la souris pour le patin et maintenir la position à l'aide de ruban adhésif chirurgical.
NOTE: Le microscope confocale fibrée utilisée dans cette étude se compose de deux unités: (1) la microsonde (mini0 / 30). (2) unité de balayage laser (LSU-488; longueur d'onde 488 nm).
- Effectuer tous les fuseaux-tours analyses utilisant la longueur d'onde laser nm 488 LSU.
NOTE: Le détecteur de l'unité principale détecte la filtré (500-650 nm) fluorescence émise. Les images acquises sont ensuite reconstruits et affichées à un rythme de 12 images / sec. - Débranchez soigneusement la seringue de l'aiguille et de joindre une nouvelle seringue contenant FITC dextran. Administrer (IV) 100 pi de FITC dextran.
- Mettre la microsonde (mini0 / 30) à un champ de vue approprié et il fixer, après l'ajustement de l'axe z, afin d'obtenir l'image correspondante. Attendez que le signal initial à se estomper jusqu'à ce qu'un signal clair et ciblé est visible.
- Enregistrer un flux sanguin de référence pour une période de stabilisation court (~ 30 sec). Puis connecter à l'aiguille une autre seringue, contenant soit doxorubicine ou une solution saline. IV administrer 100 pi doxorubicine ou une solution saline.
- Surveiller le flux injecté de FITC-dextrane en continu pendant 20 min. Sur le logiciel de FCFM-associé, utilisez le bouton de diamètre sur la règle supérieure afin de mesurer les vaisseaux sanguins et les classer comme faible (<15 um) ou grande (> 15 um).
- Euthanasier l'animal à un surdosage d'anesthésie.
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Representative Results
En imagerie continue vivo au temps réel
Appareil de formation d'image utilisée ici est une haute définition, microscope confocal fibrée, équipé d'une sonde qui permet la visualisation de la vascularisation et de sa réponse à divers stimuli comme la chimiothérapie. Cette méthode est peu invasive depuis bien qu'il puisse faciliter l'imagerie des vaisseaux ou organes profonds, il nécessite une petite incision de la sonde. Les faisceaux de sonde sont constitués de plusieurs dizaines de milliers de fibres, de l'optique de microscope et un connecteur de précision propriétaire. Une représentation schématique est représentée sur la Figure 1.
Imagerie de microvascularisation fémorale
Nous avons déterminé que le réseau de la vascularisation artérielle fémorale selon navires diamètre (faible <15 um; grand> 15 um) par FCFM chez les souris injectées avec du FITC-dextrane. Une vasoconstriction rapide (2-5 min) des petits vaisseaux a été induite par la doxorubicine. Un disappearan complèteCE de la fluorescence FITC-dextran, traitement de 8 min poste de doxorubicine (figure 2A par exemple, des flèches; Vidéo 1). Dans plusieurs souris, la réduction du signal fluorescent dans le vaisseau sanguin et augmenter le signal de entourant son a été observée dans la région périvasculaire, quelques secondes après l'administration de doxorubicine (figure 2B g, flèches). Ces résultats indiquent que augmentation de la perméabilité vasculaire et une fuite du dextrane de poids moléculaire élevé à partir du vaisseau sanguin aux tissus environnants. Aucun signal de fluorescence était évident après l'administration de la doxorubicine chez les souris qui ne ont pas été préalablement injectés au FITC-dextran. souris de paclitaxel-traités ont démontré similaire vaisseaux sanguins structure et le débit à celles observées chez les souris de solution saline injectée (non représenté), tout au long de la période de mesure.
La figure 1. Le FCFM Le microscope confocal utilisé ici est composé de deux unités: la microsonde (mini0 / 30) et l'unité de balayage laser (LSU-488; longueur d'onde 488 nm)..
Figure 2. Images de signal de fluorescence FITC-dextran dans microvascularisation fémorale. Les navires ont été classés dichotomique à un mineur (<15 um) ou majeure (> 15 um) en fonction de leur calibre. Microvascularisation fémorale de FITC dextran (100 ul; 10 mg / ml). Injecté des souris a été imagé avant et pendant l'administration intraveineuse de doxorubicine ou de solution saline (A) Les navires mineures, imagées par FCFM, a commencé vasoconstricteur aiguë 2 min après l'administration de doxorubicine (f , flèche), présentant un rétrécissement continu du signal fluorescent jusqu'à sa disparition complète, sans récupération récupération apparente du signal au cours de la next huit minutes de l'imagerie en temps réel (g, flèche). (B) Apparence, dans certains clichés, d'une zone de "flou" autour des parois des vaisseaux sanguins de souris de chimiothérapie-injecté (g flèche) immédiatement après l'injection, indique un potentiel fuites Dextran-FITC. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Vidéo 1. fémorale imagerie microvasculaire. Un représentant photographié film mineur fluorescent FITC-dextran (<15 m de diamètre) des vaisseaux sanguins. Temps de microvaisseaux de l'ovaire et du fémur baigne photographie: souris injectées avec 100 ul de FITC-dextrane (10 mg / ml) ont été imagées et photographié à partir du moment de l'administration intraveineuse de doxorubicine. 2-5 min après l'injection de doxorubicine, les navires mineures montré vasoconstriction dramatique suivie par suppression complète du signal fluorescent, déjà après 8 min traitement. (AVI) Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
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Discussion
Évaluation de la toxicité vasculaire induite par la chimiothérapie est difficile en raison de la difficulté à visualiser la dynamique de la vascularisation en réponse à un stimuli en temps réel. De nombreuses études cliniques ont mis en cause que plusieurs chimiothérapies causent lésion vasculaire directe, mais le mécanisme et les caractéristiques de cette toxicité reste à élucider. Nous avons établi un temps réel, in vivo plate-forme d'imagerie moléculaire pour évaluer la toxicité potentielle de chimiothérapie vasculaire chez les souris, comprenant de microscopie à fluorescence confocale fibrée comme décrit ici 8-10. Cette imagerie moléculaire à haute résolution de la souris est adapté pour la visualisation de flux sanguin artériel et l'architecture de navires. Il permet de détecter en temps réel des complications induites par le traitement dans le même animal sur une longue période de temps. Nous avons évalué deux classes de chimiothérapies: la doxorubicine qui est connue pour être toxique pour les cellules endothéliales in vitro ainsi que dans les tissuss provenant d'animaux traités avec la doxorubicine 10-15, et le paclitaxel en tant que chimiothérapie de contrôle pour lequel l'ancien preuves pour tout effet vasculaire est très limitée.
La technologie de balayage laser confocal FCFM facilite le traçage des tissus profonds teints à fluorescence en temps réel et produit time-lapse images vidéo des vaisseaux sanguins in vivo neuf. Dans notre étude FCFM a été utilisé pour observer l'effet vasculaire aigu de la doxorubicine, comme agent prototype de vasculotoxique. Cet effet, qui a commencé peu après l'administration de la doxorubicine, dépendait de vaisseaux sanguins taille: plus le diamètre des vaisseaux, le plus important du dommage. Le signal de fluorescence de petit diamètre (<15 um) navires diminuée progressivement à la suite de la constriction des vaisseaux constante causée par la doxorubicine. Pas de reprise apparente a été détectée au cours de la prochaine 8 min de l'imagerie en temps réel. Grand diamètre (> 15 um) navires étaient moins endommagés; l'intégritéde leur paroi a été compromise, présentant une surface irrégulière. Ces effets étaient uniques à la doxorubicine et ne étaient pas évident quand paclitaxel a été utilisé, ce qui indique que cette méthodologie délimite soigneusement l'effet spécifique de la drogue.
Modifications et dépannage
Tout au long du protocole, la puissance du laser peut être modifiée au cours de l'enregistrement de référence pour illustrer les navires. Cependant, la puissance du laser ne doit pas être changé pendant l'expérience. En outre, une puissance de laser élevée peut blanchir l'agent de fluorescence au cours du temps. En outre, une fois l'enregistrement terminé, il est possible de modifier le contraste du film et pour modifier sa longueur et la vitesse. Les mesures des navires peuvent alors être effectuées et les changements qui se produisent peuvent être suivis.
Limites de la technique et des étapes critiques
Le dispositif FCMF a quelques limitations. La région d'intérêt (ROI) pourrait changer au coursle temps de formation d'image. En outre, la zone imagée pourrait sécher; il faut garder la zone hydratée. L'agent de fluorescence peut blanchir et le signal sera perdu. Une étape critique il faut prêter attention à garder l'animal et le puits de sonde fixe pour éviter les changements de la ROI.
applications de signification et futurs
La plate-forme expérimentale établie peut servir comme un test immédiat de réponse à la chimiothérapie ou encore comme un marqueur biologique potentiel pour caractériser le profil potentiel de toxicité vasculaire. Sur la base du mécanisme de l'atteinte vasculaire étudié, le procédé peut également être utile dans le futur pour l'évaluation des agents potentiels spécifié pour réduire la toxicité vasculaire induite par la chimiothérapie. La nécessité de réduire les complications potentielles vasculaires à long terme chez les survivants du cancer qui nous pousse à explorer le mécanisme derrière la toxicité vasculaire induite par la chimiothérapie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| general anesthesia | Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France | 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2 | |
| depilatory cream (Veet) | ReckittBenckiser, Bristol, UK | ||
| 30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe | |||
| FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μl volume |
| Doxorubicin | Teva, Israel | 8 mg/kg, Adriamycin | |
| paclitaxel | Taro, Israel | 1.2 mg/kg, Medexel | |
| saline |
References
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