Summary
Dieser Artikel soll zeigen, wie Glutamin Dynamik in lebenden Zellen mit FRET überwachen. Genetisch kodierte Sensoren ermöglichen die Echtzeitüberwachung von biologischen Molekülen auf subzellulärer Auflösung. Experimentelles Design, technischen Details der experimentellen Einstellungen und Überlegungen für die post-experimentellen Analysen werden für genetisch kodierte Glutamin Sensoren diskutiert werden.
Abstract
Genetisch kodierte Sensoren ermöglichen die Echtzeitüberwachung von biologischen Molekülen auf subzellulärer Auflösung. Eine enorme Vielzahl solcher Sensoren für biologische Moleküle wurde in den letzten 15 Jahren zur Verfügung, von denen einige unverzichtbare Werkzeuge geworden, die routinemäßig in vielen Labors verwendet werden.
Eine der spannenden Anwendungen der genetisch codierten Sensoren ist die Verwendung dieser Sensoren bei der Untersuchung zellulärer Transportprozesse. Eigenschaften von Transportern wie Kinetik und Substratspezifität kann auf zellulärer Ebene untersucht werden, was Möglichkeiten für die Zelltyp-spezifische Analysen der Transportaktivitäten. In diesem Artikel werden wir zeigen, wie Transporter Dynamik kann mit genetisch kodierten Glutamin Sensor als Beispiel beobachtet werden. Experimentelles Design, technischen Details der experimentellen Einstellungen und Überlegungen für die Post-experimentelle Untersuchungen diskutiert werden.
Introduction
Aufgrund der bemerkenswerten Fortschritte in Technologien, die Untersuchung des Transkriptoms und des Proteoms auf zellulärer Ebene ermöglicht, ist es jetzt klar geworden, dass die Biochemie und die daraus resultierende Fluss von Metaboliten und Ionen sind hochZellTyp-spezifische. Beispielsweise in der Leber von Säugetieren, Glutamin sequentiellen Abbau und die Synthese gleichzeitig durch periportal Zellen und perivenösen Zellen jeweils durchgeführt, wobei Ammonium zur Harnstoffzyklus im ersten Zelltyp beim Verbrauchen von überschüssigem Ammoniak in der zweiten 1-3. In einigen Fällen wird eine signifikante biochemische Heterogenität auch in einem "Zelltyp" 4, 5 nachgewiesen. Zusätzlich zu einer solchen räumlichen Spezifität sind die Ebenen der zellulären Metaboliten und Ionen hoch dynamischen (z. B. Signalmoleküle, wie Ca 2 + und zyklische Nukleotide). Die räumlich-zeitliche Muster von Metaboliten und Ionen spielen oft eine entscheidende Rolle bei der Signalübertragung. MONITORING zellulären Dynamik von Metaboliten und Ionen, jedoch stellen einzigartige Herausforderung. In vielen Fällen ist die Änderung der Konzentrationen rasche und vorübergehende, durch den Fall von Signalmolekülen, wie Ca 2 +, die innerhalb von ~ 20 ms in dendritischen Dornen 6 beispielhaft abfällt. Zusätzlich Kompartimentierung biochemische Wege in und zwischen den Zellen macht es schwierig, die Dynamik von Metaboliten und Ionen-Extraktion und Quantifizierung mittels Säulenchromatographie / Massenspektrometrie-Techniken.
(8 in 7 prüft) Genetisch kodierte Sensoren für biologische Moleküle sind heute weitgehend durch die hohe Raum-Zeit-Auflösung, die der Experimentator zu kurzlebig und / oder compartmentalized Molekulardynamik untersucht werden können verwendet. Diese genetisch codierten Sensoren können grob in zwei Kategorien unterteilt werden; intensitätsbasierten Sensoren und ratiometic Sensoren. Intensitätsbasierten Sensoren bestehen typischerweise aus einer Bindungsdomäne und einer Grippeorescent Protein (FP), und der gelöste Stoff der Bindung an die Bindungsdomäne verändert die Fluoreszenzintensität. Ratiometic Sensoren, auf der anderen Seite, oft nutzen Förster Resonance Energy Transfer (FRET) zwischen zwei Rahmenprogramme, die als FRET-Paar funktionieren. Diese Sensoren bestehen aus einer Bindungsdomäne und zwei RP und der gelöste Bindung induziert die Änderung in der FRET-Effizienz zwischen den beiden Rahmenprogramme. Eine große Anzahl von Sensoren für biologisch wichtige Metaboliten und Ionen wurden in den letzten zehn Jahren 8, 9 entwickelt.
Einer der aufregende Möglichkeit durch solche genetisch kodierte Sensoren angeboten wird, ist ihre Verwendung bei der hochauflösende Analyse von Membrantransportprozessen, die zuvor war nicht leicht, auf der zellulären Ebene zu erkennen. Genetisch kodierte Sensoren ermöglichen die Analyse von Transportmechanismen wie die Substratspezifität und die pH-Abhängigkeit 10, 11. Darüber hinaus wird in Kombination mit den genetischen resUELLEN wie die Bibliothek von RNAi-Konstrukten zur Modellorganismen, ist es nun möglich, genomweite Suche nach neuen Transportprozesse mit genetisch codierten Sensoren durchzuführen. In der Tat, die Verwendung von genetisch codierten Sensor führen zu der Entdeckung von bisher nicht charakterisierte Transporter in mehreren Fällen 12, 13.
Kürzlich wurde unserem Labor eine Reihe von FRET-Sensor für Glutamin entwickelt. Wir haben gezeigt, dass zelluläre Glutamin können unter Verwendung derartiger FRET-Glutamin Sensoren 10 visualisiert werden. Diese Sensoren bestehen aus einer FRET-Donor (mTFP1) in einen bakteriellen Glutamin Bindungsprotein glnH eingesetzt und ein FRET-Akzeptor (Venus) am C-Terminus von glnH (Abbildung 1). Effizienz dieser Sensoren FRET verringern bei Bindung an Glutamin, was zur Abnahme der Akzeptor / Donor-Intensitätsverhältnis. Feinregulierung von Glutamin Transportprozesse wichtig in biologischen Prozessen wie neurotransmission 14, 15 und die Aufrechterhaltung der Harnstoffzyklus in der Leber 1, 16, 17.
Hier zeigen wir die Methodik der Analyse von Verkehrsaktivitäten mit FRET-Sensoren für Glutamin, mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop Set-up. Das Ziel der Experimente hier dargestellt sind, um Transporttätigkeiten in einer einzigen Zelle zu detektieren und Substratspezifität eines transient exprimierten Transporter zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Probenvorbereitung
Hinweis: In vielen Fällen Perfusionsexperimenten abzuwaschen einen erheblichen Teil der Zellen, welche eine frustrierende Problem werden kann. Obwohl es nicht notwendig für alle Zelllinien, Deckbeschichtung Glasflächen mit Poly-L-Lysin (1,0 ml/25 hinzufügen cm 2 von 0,01% Lösung auf die Oberfläche, Inkubation> 5 min, zweimal waschen mit Zellkultur-Wasser und trocken in die Biosicherheitswerkbank) fördert die Zellhaftung. Beachten Sie außerdem, der Biosicherheitsstufe (BSL) der Zelllinie verwendet, und folgen Sie dem von der örtlichen Umwelt-und Sicherheitsbüro genehmigt Standardverfahren. In diesem Experiment wurden COS-7-Zellen aufgrund der niedrigen endogenen Glutamin Transportaktivität (siehe Abbildung 4).
- Samen COS7-Zellen bei ~ 70-80% Konfluenz in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) + 10% Kälberserum und kosmische 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, entweder auf sterile 25-mm-Glasdeckgläschen in 6-Well-Kultur platziertGericht oder 8-Well-Glasboden-Rutschen. Bei 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit für 24 Stunden.
- Tauschen das Wachstumsmedium DMEM + 10% Kälberserum kosmischen (keine Antibiotika), entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Wachsen O / N bei 37 ° C, 5% CO 2 bei 100% Feuchtigkeit.
- In jeweils 0,4 mg von Plasmid-DNA, die Glutamin-Sensor (pcDNA3.1, Trage FLIPQTV3.0 Sensor unter CMV-Promotor 10) und der mCherry-markierten ASCT2 10 bis 50 ml Serum-freien Medien (OPTI-MEM) kodiert und vorsichtig mischen.
- 1 ml Transfektionsreagenz auf 50 ml Serum-freien Medien. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
- Die beiden Lösungen mischen DNA (Schritt 1.3) und Transfektionsreagenz (Schritt 1.4) enthält und Inkubation für 20 min.
- Fügen Sie vorsichtig das Transfektionsreagenz auf der Oberseite der Zellen und vorsichtig durch Schwenken der Kammer. Inkubation für 24 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit.
- Nach 24 Stunden tauschen die mittel-bis DMEM + 10% Cosmic Kälberserum(CCS) + 100 Einheiten Penicillin / Streptomycin.
- Die Zellen werden abgebildet 48-72 Stunden nach der Transfektion.
2. Perfusion Experiment
Anmerkung: Für COS7-Zellen in diesem Experiment verwendet wurden Perfusionsmedien und Kammer bei RT gehalten und Umgebungs CO 2-Konzentration. Allerdings, wenn die Zellen verwendet werden, erfordern eine höhere Temperatur-und CO 2-Konzentrationssteuerung für das Überleben, erhitzt Mikroskoptisch und / oder eine Umgebungskammer verwendet werden.
- Bereiten Perfusionspuffer AF (Siehe Liste der Materialien). Bringen Hähne zu 50 ml Spritzen, schließen Sie die Hähne dann füllen sie mit den Perfusionslösungen. Öffnen Sie den Hahn für eine kurze Zeit, um den Kopfraum in den Hahn mit dem Puffer zu füllen.
- Schalten Sie den 8-Kanal-, Schwerkraft-Feed Perfusion System mit einer Perfusion Bleistift, und wählen Sie dann "Manual Mode" unter Funktion Option Wählen. Stellen Sie einen Abfallbehälter unter die Perfusion Bleistift.
- Manuellaktivieren Sie die Ports, indem Sie die entsprechenden Zahlen und füllen Sie die Schläuche mit 10-ml-Spritze, die Wasser, und schließen Sie dann den Hafen. Sobald die Anschlüsse mit Wasser gefüllt sind, stellen Sie die Spritzen mit Puffer AF auf dem Port 1-6 von Perfusions-System, und öffnen Sie dann die Hähne. Die Ports öffnen wieder, um das Wasser in der Rohrleitung mit den Puffern zu ersetzen. Die Strömungsgeschwindigkeit sollte etwa 0,8 ml / min.
- Drücken Sie einmal auf die Abbrechen-Perfusion-Controller, um wieder in das Menü "Select Function" zu gehen. Umschalten zur Option "Programm bearbeiten", geben Sie dann die Perfusion Protokoll in Tabelle 1 angegeben. Speichern Sie die Perfusion-Programm.
- Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator. Zweimal waschen mit der Perfusions-Puffer und dann die Zellen gesetzt auf der Bühne. Schließen Sie das System, um die Perfusion der Kammer. Wenn eine offene Kammer verwendet wird, der Aufbau einer weiteren Pumpe, die Perfusionslösung aus der Kammer entfernt.
- Öffnen Slidebook Software. Starten Sie eine neue Folie.
Hinweis: DerFolgende Vorgehensweise nur auf Slidebook Software, andere Software wie MetaFluor und Nis-Element kann auch für die Art der hier beschriebenen Abbildungs verwendet werden. Theoretisch Experimente durchgeführt mit jeder Software, die zeit natürlich Bildgebung ermöglicht werden, und die Bildsequenzen post-experimentell mit einer Software wie ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oder Fidschi analysiert werden (http:/ / fiji.sc / Fidschi). Allerdings ist Software, die Echtzeit-Überwachung von Akzeptor / Donor-Verhältnis ermöglicht sehr nützlich. - Befestigen Sie die Folie auf dem Fluoreszenzmikroskop Bühne. Finden Sie die Zellen co-exprimieren den Sensor und ASCT-mCherry unter Verwendung geeigneter Filtersätze (siehe Liste der Materialien) unter der Funktion "FOCUS". Passen Gewinn, indem Sie auf Registerkarte "Camera" und schieben Sie die Schieberegler unter "Gewinn". Auch, stellen Sie die Neutraldichtefilter Einstellung von neutral Dropdown-Menü Dichtefilter. Hinweis: Wenn die Filterwürfel enthält nicht ein Auge Filter, verwenden Sie nicht die Augen Stücke seit Short-Anregungslichtwellenlänge ist schädlich für die Augen. Verwenden Sie den Computer-Bildschirm, um die Zellen statt finden.
- Erwerben Sie Bilder von Zellen with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filter werden in der Materialliste angegeben). Klicken Sie auf "Bilder" und dann in den Erwerb Fenster legen Sie die Filter, die gehen, verwendet werden. Klicken Sie auf "TEST"-Taste, um die Belichtungszeit, indem Sie die gewünschte Belichtungszeit in das Feld neben den Filtereinstellungen anpassen. Anmerkung: Alle drei Kanäle müssen für die gleiche Länge freigelegt werden. Beim Einstellen der Bildparameter, die voraussichtliche Änderung FRET-Effizienz zu erhöhen und falten berücksichtigen: zum Beispiel, wenn die FRET-Effizienz wird erwartet, dass während des Experiments bis 2-fache zu gehen, sollten Abbildungsparameter eingestellt werdenso daß die Intensität der Donor-Akzeptor ab em im Ruhezustand sollten 50% des Maximalwertes, der vom Instrument aufgenommen werden kann <, so daß der Kanal nicht während des Experiments gesättigt. Signal aus den markierten Zellen sollten mindestens drei-mal höher als die in dem Hintergrundbereich ist.
- Zeichnen Sie eine Region von Interesse mit Regionen Werkzeug in der Software. Alternativ kann auch eine Software-Funktion, um Pixel oberhalb bestimmter Intensität wählen verwendet werden, und dann in Regionen umgewandelt. Um dies zu tun, klicken Sie auf Maske - Segment, dann bewegen Sie den Schieberegler, um die gewünschten Bereiche zu markieren.
- Wählen Sie "Zeitablauf" in der Capture-Typ Box, geben Sie dann das Intervall (10 sec in diesem Experiment) und Zeitpunkte für das Experiment.
- Zeichnen Sie eine Region in einem Gebiet ohne fluoreszierenden Zellen. Dieser Bereich ist für die Hintergrund Subtraktion verwendet. Rechtsklick auf die Region gezogen, und setzen Sie ihn dann als Hintergrund. Hinweis: Idealerweise sind Zellen, die keinet exprimieren die Sensoren als dem Hintergrundbereich verwendet werden, um sowohl die Autofluoreszenz und dem von der Kamera erfassten Fluoreszenz Hintergrund zu berücksichtigen. Wenn keine solchen Zellen sind in dem Sichtfeld zur Verfügung, zumindest ein Bereich ohne die Zellen zu verwenden, um für die Hintergrundfluoreszenz zu berücksichtigen.
- Wählen Sie das gewünschte Programm unter "Select Function - Ausführen von Programmen"-Option. Schalten Sie auf die gespeicherte Programm (siehe Schritt 2.3), und drücken Sie ENTER auf der Perfusions-Controller dann. Jetzt wird das Programm geladen ist, und schlagen Sie eine beliebige Taste wird die Durchblutung zu starten.
- Stellen Sie sicher, Perfusion und der Abbildungs Experiment zu starten in der gleichen Zeit, indem Sie auf "Start" im Aufnahmefenster in der gleichen Zeit wie das Drücken einer Taste auf der Perfusions-Controller.
Hinweis: Es wird empfohlen, den Zeitpunkt, wo die Lösungen ausgetauscht wurden (dies kann über "NOTES"-Funktion auf der Registerkarte Erwerb gefunden geführt werden) aufzeichnen. - Führen Sie den gleichen Perfusion Protokoll using Zellen einen Sensor, der erwartet wird, um entweder gesättigt oder ungebundenen unter der experimentellen Bedingung ausdrückt.
Anmerkung: Hier FLIPQTV3.0_1.5μ, die unter der experimentellen Bedingung gesättigt ist, wird als Kontrolle verwendet, Fig. 6 Solche Kontrollversuche sind notwendig, um zu bestätigen, dass die FRET-Effizienz Änderung ist auf die tatsächliche Änderung in dem Substrat nicht. aufgrund der Änderung anderer Parameter, wie zelluläre pH.
3. Post-Experiment Analyse
- Untersuchen Sie, wenn Probendrift während des Experiments aufgetreten. Zeichnen Regions Of Interest (ROI) ist auf der am Zeitpunkt 0 aufgenommene Bild, bewegen Sie den Schieberegler an der Oberseite der Imaging-Fenster und überprüfen, ob die Zellen fallen aus der ROIs in Bilder später im Experiment gemacht.
- Wenn ja, dann verwenden Sie die Tracking-Funktion für die Drift durch erste korrigieren, Erstellen von Masken um die Zellen durch Auswahl Mask - Segment, schieben Sie die Zeile, die den Cutoff auf hig gibthlight die Regionen mit Zellen. Verfolgen Sie die Regionen durch Klicken Mask - Particle Tracking - Grundpartikelverfolgung.
- Neu zeichnen die ROIs und Hintergrundbereich, wenn notwendig.
- Exportieren der Durchschnittsintensität der ROIs im Laufe des Experiments. Klicken Sie auf Statistiken - Export - Ratio / Timelapse-Daten.
- Wenn FRET-Effizienz und Quantifizierung der Substratkonzentration ist nicht notwendig, den Zeitverlauf des Grundstückes des Intensitätsverhältnisses (Donor-Akzeptor Ex em, / Donor Donor ex em) als Proxy für die Dynamik des Substrats. Um das cytosolische Konzentration zu bestimmen, die Berechnung der maximalen und minimalen Verhältnisänderung (dh an der Sättigungs und Abwesenheit des Substrats bezeichnet), &Dgr; r max - &Dgr; min, durch nicht-lineare Regression der Δratio (&Dgr; r) mit der folgenden Gleichung:
∂ r = [S] / (K d + [S]) x (&Dgr;
wobei [S] die Substratkonzentration im Cytosol. Verwendung der &Dgr; r max - &Dgr; r min-Werte erhalten, Sättigung (S) des Sensors bei einer bestimmten &Dgr; r wird wie folgt berechnet
S = (&Dgr; - &Dgr; min) / (&Dgr; r max - &Dgr; min)
S weiter in die Substratkonzentration [S] mittels der folgenden Gleichung umgewandelt werden:
S = [S] / (K d + [S])
Hinweis: die Intensität der Akzeptor-Akzeptor ex em Kanal sollte auch aufgetragen zu prüfen, ob die experimentelle Bedingung beeinflusst die Fluoreszenz des Akzeptor-direkt. - Wenn eine Basisliniendrift durch Fotobleichen beobachtet wird, führen Sie eine Basislinienkorrektur. Um dies zu tun, zeichnen die Intensitäten von Donor und Akzeptor mit der Zeit (Fig. 5A). Dann identifizieren die für th verwendet Zeitpunktene Grundlinie nach der Verzögerung im Perfusionssystem und der Transportaktivität des bestimmten Zelle (Fig. 5B).
- Berechnen Sie ein Polynom Armatur, die am besten beschreibt die Grundlinie. Dann normalisieren die rohe Intensität von jedem Zeitpunkt auf die Grundlinie (Abbildung 5C). Berechnen Sie die Intensitätsverhältnis (Donor-Akzeptor Ex em, / Donor Donor ex em) aus den normierten Donor-und Akzeptor-Intensitäten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typische Zeitverlaufsexperimente sind in Fig. 2 dargestellt. In diesen Experimenten FRET Glutamin Sensoren mit Affinitäten von 8 mm (FLIPQTV3.0_8m, 2A und 2B) und 100 &mgr; M (μ FlipQTV3.0_100 C und D) wurden mit coexprimiert eine Pflicht Aminosäure Tauscher ASCT2 18 in COS-7 Zellen 10. Zustrom von Glutamin als die Änderung in der Fluoreszenzintensitätsverhältnisse zwischen dem Spender (mTFP1) und dem Akzeptor (Venus) (2A und 2C) detektiert. Efflux von Glutamin in Gegenwart von einem weiteren Substrat (Ala) ist auch deutlich in diesen Experimenten demonstriert. Beide Sensoren wechselseitig verändern normalisierten Fluoreszenzintensitäten (dh steigt die Intensität der Donor-Akzeptor-Intensität geht, 2B und 2D) in der Gegenwart von Substrat, die darauf hindeuten, dass die beobachtete Veränderung Verhältnis tatsächlich durch to die Veränderung der FRET-Effizienz. Diese Experimente zeigen, dass die Glutamin-Konzentrationen in diesen Zellen schwanken sehr dynamisch unter der experimentellen Bedingung; aus dem Erfassungsbereich des Sensors 100 uM bis zum nahen Sättigungskonzentration für 8 mm-Sensor.
Substratspezifitäten der Transporter kann auch unter Verwendung von Sensoren, die in Fig. 3 gezeigt, untersucht werden. In diesen Experimenten wurden die Zellen mit Glutamin vorbelastet, und dann wurden verschiedene Aminosäuren der extrazellulären Perfusat zugegeben, um zu prüfen, ob diese Aminosäuren Glutamin Efflux induzieren. Wie erwartet, ASCT2 Substrate (Ala, Ser, Cys, Thr, D-Serin) induziert Glutamin Efflux (Fig. 3A), während nicht-Substrat Aminosäuren (Pro, His, Lys) nicht (Fig. 3B), mit übereinstimm 18 früheren Studien. In der Regel wird die Substratspezifität durch die Konkurrenz-Assays mit einem Radio-Isotop-markierten Substrat mit konkurrierenden Substrat gemischt gemessen, Was ziemlich mühsam ist und erfordert eine Population von Zellen, die gleichmäßig den Transporter äußern untersucht werden. Die optische Bildgebung hier beispielhaft bietet einen alternativen Ansatz.
Wenn keine FRET-Effizienz Änderungen bei der Zugabe des Substrats beobachtet wird, kann mehrere Ursachen in Betracht gezogen werden. Ein möglicher Grund ist die geringe Aufnahmekapazität für das Substrat getestet und / oder hohe Aktivitäten von Enzymen, die die Konzentration in den Zellen zu halten. Zum Beispiel war Glutamin Konzentrationsänderung minimal in COS7-Zellen, die nicht ASCT2 Transporter exprimieren, unter der Bedingung geprüft, obwohl diese Zelllinie ist deutlich in den Medien zu wachsen, in der Glutamin in der Hauptstickstoffquelle (Abbildung 4). Darüber hinaus, wenn die Affinität des Sensors ist entweder zu hoch oder zu niedrig, verglichen mit der intrazellulären Konzentration, die meisten der Sensor Proteine konstitutiv gebunden oder ungebunden bleiben sind; daher keine FRET-Effizienz Änderung wird d werdenetected.
Abbildung 1. Konfiguration eines FRET-Glutamin-Sensor. (A) Open (cyan) und geschlossen (gelb) Konformation glnH, Glutamin-Bindeprotein aus E. coli. Die Position, wo mTFP1 eingesetzt ist, in Magenta markiert. (B) schematische Darstellungen von FLIPQTV_3.0 Sensoren.
Abbildung 2. In-vivo-Messungen mit Glutamin-FLIPQ TV3.0_8m und 100μ Sensoren. (A) Die venus/mTFP1 Verhältnis von COS-7-Zellen co-exprimierenden FLIPQ TV3.0_8m-Sensor und ASCT2-mCherry. mCherry-Tag wurde verwendet, um die Zellen den Transport zum Ausdruck zu identifizierener, ohne die mTFP1 oder venus Emissions Kanäle. Die Zellen wurden mit HEPES-gepufferter Hanks-Puffer (pH-Wert 7,35) perfundiert. Zeitpunkten, wenn der extrazellulären Glutamin-(rot) und Alanin (blau) wurde der Perfusion Medien aufgenommen werden als Kästchen über dem Diagramm angezeigt. Gezogene und gestrichelte Linien stellen zwei einzelne Zellen im gleichen Experiment gemessen. (B) Die Intensitäten der Donor (mTFP1) und Akzeptor (Venus) Kanäle in der in (A) gezeigten Experiment. Die Werte wurden für die Photobleichung und normiert auf die Basislinie korrigiert. (C) und (D) ein ähnliches Experiment wie in (A) und (B), mit COS7-Zellen, die den FLIPQ TV3.0_100μ-Sensor. (Abbildung 10 modifiziert).
3. Beseitigung zellulärer Glutamin turch die ASCT2 Transporter in Gegenwart von externen Aminosäuren, visualisiert unter Verwendung FLIPQ TV3.0_8m-Sensor. (A), zytosolische Glutamin wird durch die Zugabe von extrazellulärem Ala, Ser, Cys, Thr, Ser und D-exportiert. Zeitpunkten, wenn der extrazellulären Glutamin (rote Felder) oder andere Aminosäuren (blaue Kästchen) wurden der Perfusion Medien aufgenommen werden als Kästchen über dem Diagramm angezeigt. (B) Zugabe von Pro, Lys, His (Black Boxes) nicht zytosolischen Glutaminkonzentration ändern , während die Zugabe von Ala (blaue Kästchen) fördert den Export von Glutamin. Gezogene und gestrichelte Linien stellen zwei einzelne Zellen im gleichen Experiment gemessen. Alle Aminosäuren wurden bei 5 mM externen Konzentrationen zugegeben. (Bild wurde ursprünglich in 10 veröffentlicht).
Abbildung 4. Venus/mTFP1 Das Verhältnis von COS-7-Zellen expressing FLIPQ TV3.0_8m-Sensor (A) und 100μ Sensor (B). Die Zellen wurden mit HEPES-gepufferter Hanks-Puffer perfundiert. Zeitpunkte, wenn extrazelluläre Glutamin (5 mM) wurde zu dem Perfusionsmedium zugegeben werden als rote Felder über dem Diagramm angegeben. Gezogene und gestrichelte Linien stellen zwei einzelne Zellen im gleichen Experiment gemessen.
5. Korrektur für Photobleichung. (A) Roh-Intensitäten von zwei Zellen in 2A und 2C dargestellt. (B) Datenpunkte, die für die Berechnung der Basislinien ausgewählt. Polynom Anpassung von Kurven sind in der Abbildung dargestellt. (C) Intensitäten der Kanäle in A gezeigt, normalisiert gegen die Grundlinie in B. berechnet Die in dieser Figur verwendet Dataset ist identical dem in Fig. 2A und 2C gezeigt.
Abbildung 6. In-vivo-Messungen mit Glutamin FLIPQ TV3.0_1.5m-Sensor. (A) Die venus/mTFP1 Verhältnis von COS-7-Zellen co-exprimierenden FLIPQ TV3.0_1.5m-Sensor und ASCT2-mCherry. mCherry-Tag wurde verwendet, um die Zellen den Transporter zum Ausdruck, ohne die mTFP1 oder venus Emissionskanäle zu identifizieren. Die Zellen wurden mit HEPES-gepufferter Hanks-Puffer (pH-Wert 7,35) perfundiert. Zeitpunkten, wenn der extrazellulären Glutamin-(rot) und Alanin (blau) wurde der Perfusion Medien aufgenommen werden als Kästchen über dem Diagramm angezeigt. Solide und gestrichelten Linien stellen zwei einzelne Zellen im gleichen Experiment gemessen. (B) Die Intensitäten der Spender (mTFP1) und Akzeptor (Venus)-Kanälein der in (A) gezeigten Experiment. Die Werte wurden für die Photobleichung und normiert auf die Basislinie korrigiert.
| Zeit (min) | Lösung A | Lösung B | Lösung C | Lösung D | Lösung E | Lösung F | |||||||
| 0 | Ventil | ||||||||||||
| 2 | Ventil aus | Ventil | |||||||||||
| 4 | Ventil | Ventil aus | |||||||||||
| 6 | Ventil aus | Ventil | |||||||||||
| 8 | Ventil | Ventil aus | 10 | Ventil aus | Ventil | ||||||||
| 12 | Ventil | Ventil aus | |||||||||||
| 14 | Ventil aus | Ventil | |||||||||||
| 16 | Ventil | Ventil aus | |||||||||||
| 18 | Ventil aus | Ventil | |||||||||||
| 20 | Ventil | Ventil aus | |||||||||||
| 22 | Ventil aus | Ventil | |||||||||||
| 24 | Ventil | Ventil aus | 26 | Ventil aus | Ventil | ||||||||
| 28 | Ventil | Ventil aus | |||||||||||
| 30 | Ventil aus | Ventil | |||||||||||
| 32 | Ventil | Ventil aus | |||||||||||
| 34 | Ventil aus |
. Tabelle 1 Beispiel der in diesem Experiment verwendeten Lösung A Perfusion Protokoll:.. 9,7 g HANK Salz (H1387), 0,35 g NaHCO 3, 5,96 g HEPES auf 1 l pH-Wert mit NaOH auf 7,35 eingestellt Lösung B: Lösung A + 0,04 mM Gln Lösung C:.. Lösung A + 0,2 mM Gln SolutIonen-D:. Lösung A + 1 mM Gln Lösung E:. Lösung A + 5 mM Gln Lösung F: Lösung A + 5 mM Ala
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der Erfolg der Imaging-Experimenten hängt von ein paar kritische Faktoren. Einer dieser Faktoren ist die Affinität von Sensoren verwendet wird, wie oben diskutiert. Absolute Konzentration des Substrats in dem subzellulären Kompartiment von Interesse ist jedoch oft unbekannt. Deshalb empfehlen wir versuchen mehrere Sensoren mit versetzten Affinitäten, die, die unter der gewünschten Versuchsbedingung am besten funktioniert. Zum Beispiel, in unserem Fall mit 1.5μ transfizierten COS7-Zellen mit Glutamin Sensoren, 100μ, 2 m und 8 m (Fig. 3 und Daten nicht gezeigt).
Ein weiterer wichtiger Faktor ist das Expressionsniveau des Sensors Proteinen. Die Höhe der Ausdruck für den Nachweis erforderlichen variiert zwischen, Experimente, zum Beispiel, wenn ein Ereignis von kurzer Dauer (zB einzelnes Aktionspotential) muss beobachtet eine höhere Expressionsniveau könnte erforderlich 19 zu werden. Daher wird in den meisten Fällen muss das erforderliche Niveau sein empirically bestimmt. Wenn das Ziel besteht in sehr geringer Konzentration in der Zelle kann Störung der körpereigenen Prozesse durch Erschöpfung Ziel 20 ein Problem zu werden. Ein unabhängiger Test solche Möglichkeit zu prüfen, falls vorhanden, ist daher wünschenswert. In den in diesem Artikel gezeigt Experimenten wurde die Proteinexpression von CMV-Promotor angetrieben ausreichend erwiesen. In Situationen, wo Promotoren mit viel schwächer Aktivitäten verwendet werden müssen, könnten Anpassungen der Signalintensitäten erhöhen notwendig geworden. Beispielsweise Kompromiss zwischen Signalintensität und Fotobleichen während der Belichtung müssen erreicht werden. Zusätzlich zu längeren Belichtungszeit können Faktoren wie z. B. die Helligkeit der Fluorophore, maximale Intensitätsänderung des Sensors, Binning und den Empfindlichkeiten der CCD-Kamera verändert werden, um die Signalintensität zu erhöhen.
Wenn keine Übersetzungsänderung wird unter der experimentellen Bedingung beobachtet, obwohl die beiden obigen Kriterien wahrscheinlicherfüllt werden, ist es möglich, dass die zelluläre Homöostase für den Metaboliten oder Ionen ist stark genug, um die Transportaktivität zu maskieren (siehe Ergebnisteil). In solchen Fällen können Zelllinien mit verschiedenen biochemischen Aktivitäten als Hintergrund für die Transportaktivitäten 10, 21 zu erfassen erforderlich.
Während diese Sensoren erlauben es, Dynamik Konzentration des Substrats bei viel höheren Auflösung als Raum-Zeit-Extraktion-basierten Methoden zu überwachen, Bestimmung der absoluten Konzentration erfordert weitere experimentelle Schritte und Überlegungen. Üblicherweise wird die Substratkonzentration auf der Annahme, dass der Sensor Affinität, üblicherweise durch Titration gereinigte Protein Sensor berechnet wird, unverändert bleibt, wenn in der Zelle exprimiert wird, berechnet. Die Konzentration wird unter Verwendung des folgenden Einzel Bindungsisothermen berechnet,
[S] = K x d (r - r min) / (r </ Em> max - r)
[S] die Substratkonzentration, K d die Dissoziationskonstante in vitro bestimmt, r der in einem gegebenen Zeitpunkt beobachtet Akzeptor / Donor-Verhältnis, R min ist das Akzeptor / Donor-Verhältnis, wenn die Sensoren in der Apo-Form, und R max der Akzeptor / Donor-Verhältnis, wenn alle Sensoren an das Substrat gebunden. R min und R max durch Parameter, wie die Konzentration von Sensoren Abbildungseinstellungen verwendet und der Zusammensetzung der zellulären Milleu, und daher müssen in situ gemessen werden beeinflusst . Um festzustellen, r min und r max-Werte, experimentelle Bedingungen, die notwendige Änderung der intrazellulären Substratkonzentration wird ermöglicht. Beispielsweise durch selektive Ionophore (zB Ionomycin für Ca 2 +) 22 oder eine Perforierung Reagens wie Digitonin 23 kann verwendet werden, um die intrazelluläre Substratkonzentration mit der externen Konzentration ins Gleichgewicht werden.
Eine der Einschränkungen in der Art der Experimente in diesem Protokoll gezeigt ist die geringe Durch; Die Analyse wird bei der Analyse eines Metaboliten in einem relativ kleinen (<10) Anzahl der Zellen begrenzt. Technologische Fortschritte werden gemacht, aber solche Beschränkungen zu überwinden. Beispielsweise mit dem Fortschritt in der automatischen Hoch Content-Screening ist es nun möglich, genetisch kodierte Sensoren in Kombinationen mit kleinen Molekülen oder RNAi-Bibliothek; Zellen exprimieren einen Biosensor kann in einem Hochdurchsatzformat (z. B. 96 - oder 384-Well) gezüchtet werden, dann können die einzelnen Vertiefungen entweder mit siRNA oder Chemikalien behandelt und abgebildet werden. Solche Experimente eine Identifizierung von siRNA-Konstrukte oder Chemikalien, die die biologische Prozess, der durch den Biosensor 24 25 beobachtet werden kann, zu unterbrechen. Eine weitere spannende letzten Voraus Inclusiondes die Entwicklung eines zeitaufgelösten mikrofluidischen Durchflusszytometer, das Hochdurchsatz-Nachweis von FRET-Effizienz Änderung auf zellulärer Ebene 26 ermöglicht. Diese technischen Fortschritte werden Entdeckungen neuer Wirkstoffkandidaten und neue Komponenten in biologischen Prozessen zu unterstützen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Es gibt nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH 1R21NS064412, NSF Zuschuss 1052048 und Jeffress Memorial Trust Stipendium J-908 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate. |
| Excitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Band width 450-460 nm |
| Excitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | Band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Band width 475-505 nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | Band width 520-550 nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | Long pass, 470 nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| Perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work. |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| Perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic calf serum | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P4707 | |
| 25 mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | In case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used. |
| Solution A (Hank's buffer) | 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH | ||
| Solution B | Solution A + 0.04 mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2 mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1 mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5 mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5 mM Ala |
References
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D.
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P.
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
