Summary
与高通量电位A微型用于演示的三维（3D）介电电泳（DEP）的新颖材料。石墨烯纳米薄片纸，双面胶带交替堆叠;一个700微米的微井钻横切层。的聚苯乙烯小珠的DEP行为表现在微井。
Abstract
采用50μm厚的石墨烯纸和100μm的双面胶带的新型三维电极微型装置的设计和制作方法进行说明。该协议详细说明了程序，以构建一个通用的，可重复使用的，多个层，夹层介电电泳室。具体而言，为50微米×0.7 2cm×2cm的石墨烯纸和5层的双面胶带6层交替地叠在一起，然后夹紧到载玻片上。然后一个700微米直径的微孔中穿过叠层结构用计算机控制的微型钻孔机钻孔。邻近的石墨烯层之间的带层的绝缘性能有保证的电阻测试。银导电环氧树脂连接的石墨烯纸交替层形成的石墨烯纸和外部铜导线电极之间的稳定连接。成品器件，然后夹紧并密封到载玻片上。电场梯度在t蓝本他的多层器件。 6微米的聚苯乙烯珠介电行为进行了论证，在1毫米深的微孔，具有中等电导率从0.0001 S / m至1.3 S / m的，并应用于信号频率从100 Hz至10 MHz。负的介电电泳反应，观察在三个维度在大部分导电频率空间和交叉频率值与先前文献报道值相一致。该设备并没有阻止交流电电渗和电热流动，这发生在低频和高频区域，分别为。在此设备中使用的石墨烯纸是多才多艺，随后可能作为一个生物传感器后的介电电泳的刻画是完整的。
Introduction
石墨烯是以其高品质的电子特性和潜在的化学和生物传感器的应用1一种新型材料。石墨纳米片已用于催化剂载体2，3，4的生物传感器，超级电容器5，及复合电极，包括石墨烯/聚苯胺和硅纳米颗粒/石墨复合材料6-8。此手稿描述作为一个独特的三维（3D）的电极，分层微流体装置利用石墨烯纸。石墨烯纸电极层叠绝缘性的双面胶带，并钻出一个室，在该进行的聚苯乙烯珠三维AC介电电泳。
介电电泳（DEP）是指可极化粒子的运动下的非均匀电场。当颗粒都或多或少极化比周围介质，RESU正DEP（pDEP）或负的DEP（NDEP）发生，lting向着最强或最弱的电场运动分别。这种非线性的电动工具已被用于分离，分选，陷印，和识别粒子和生物细胞9-15中。经历的一个偏振粒子的介电电泳力是电场梯度，粒子半径和形状，粒子的介电性能，包括电导率和介电常数，以及介质电导率和介电常数的函数。在传统的两维（2D）DEP，粒子运动是在典型的微加工表面的电极之间形成的电场梯度的主平面;相比，在面内方向中的大多数设备在垂直方向上的运动可忽略不计。但是，利用的电场梯度为三维DEP此第三维允许更高的样品通量并增加了通用性，设计新的和改进的介电电泳分离，其中流动是特拉沃注册结构工程师的磁场梯度16，17。其他具体的设计包括三维绝缘体为基础的DEP 18，三维碳电极的DEP 13，19，和3D电镀DEP 10。就证明了研成三维结构，这种装置可以以连续流模式进行操作，以实现更高的吞吐量。在3D粒子的运动在我们的三维分层观测设备实现频率和介质电导率通过光学显微镜在不同焦距的高度的函数。
Fatoyinbo 等人首先报道了DEP在3D使用交替叠放30μm的铝箔和150微米的环氧树脂膜20层叠电极/绝缘结构。夜蛾等。然后设计类似于3D层叠电极与35μm铜胶带和118微米的聚酰亚胺胶粘剂21。这部作品借用了3D井设计22，23以及唯一地利用为50μm的石墨烯纸的方便作为导电层和100μm的双面胶带作为绝缘层，其中实现密封和足够的电屏蔽。石墨烯纸的多功能性是三维电极微型器件具有明显的优势，因为石墨烯纳米片必须兼任生物传感器，其中该组先前表明24的能力。
石墨烯纸/聚合物内取得的磁场梯度层叠三维微器件依赖于微井的尺寸，石墨烯纸层，和所施加的电场。关键尺寸包括垂直电极间距（导电和绝缘层厚度）和微孔的直径和高度（通过层层叠确定）。该电信号可以通过振幅和频率进行调谐。当前设备的结构是间歇操作，但是可以根据一个连续流动的装置。该设备厂这里描述rication技术适用于开发3D层叠电极与各种各样的石墨烯纳米薄片属性简单地通过交换所使用的石墨烯纸。利用石墨烯纸的优点是通用性的物理和化学性能，降低了费用，并且石墨烯纳米片可以同时作为生物传感器来检测范围广bioanalytes 24。高吞吐量的3D DEP系统的长期目标是，以迅速确定细胞类型25-27，或实现无标记，电介导的细胞病变细胞分选从健康细胞28的人口。本文演示材料的优化和设备的准备和操作，后跟说明和典型结果分析。
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Protocol
1，制作出层叠电极/绝缘三维结构
- 为6的石墨烯层，5层胶带设备，切石墨烯纸用手术刀或类似刀片和直边尺到60.7厘米×1.5cm的矩形，并用剪刀切开双面压敏胶粘带为51.3厘米X〜5厘米条纹。
注：由于如图1a所示，这会产生一个3接地电极，3个交流信号电极装置。该7毫米导电层宽度足够窄，以适应到载玻片上，但足够宽，以便于钻孔。 2毫米的长度不容易在重复使用时破裂并有足够的空间来安装铜线。该设备深度由立铣刀深度的限制。 - 打好的石墨烯纸的第一层上干净的载玻片上。慢慢地覆盖石墨烯纸用的胶带1条的一端，使1〜2 mm的边界，以保证两个相邻的石墨烯纸的层间绝缘（ 图1b
- 放置的石墨烯纸在第二层上的带的顶端偏移到的石墨烯纸（ 图1a）的第一层。另外每个导电层后申请中等压力（按均匀拇指，〜100不大于0.7 平方厘米面积），以确保层间良好的密封。
- 重复步骤1.2和1.3的剩余层，留下的顶部和底部层的石墨烯纸。沿图1b所示，从设备的边缘留下一个小约1 mm的边界，以保证纸张的石墨烯层之间的密封绝缘除去过量的磁带上的虚线切割（ 图1b）。
注：双面胶带不利用作为顶层和底层，以避免收集碎屑作为该层叠结构是钻，装在载玻片上，并且填充有样品。 - 用万用表（电阻模式）执行快速绝缘测试。定位的正和负的探针在th的两个不同侧面E设备（A和B上图1c）;高抗（千至兆欧）表示层之间良好的绝缘性。从载玻片移除层状结构为微钻井作准备。
注：设备通常失败的绝缘测试时，在步骤1.2至1.4邻近的石墨烯纸层进行接触。丢弃此类设备。
2，钻微孔的复合结构
- 使用计算机控制的机械微型铣床和选择端铣刀具有700微米，直径切2.1毫米的长度。固定上使用适当的夹具的微研磨阶段的层状结构（ 图2a和b）。运行铣床的主轴在8600转，然后放下端铣刀慢慢进入并穿过所述叠层结构的中心。移动旋转端铣刀上下贯通的微孔以平滑的内壁。
- 选择微孔直径，这是由切割宽高比可用端铣刀直径/长度的限制。确保在微孔的内表面是通过微以及垂直和清洁尽可能最佳的电场梯度和光通道。
- 从微孔干净的碎片与压缩空气。如1.5中所述，执行另一个绝缘测试。
3，附加电气导致叠层结构
- 折两个3厘米长的32G铜线成直角在2厘米。混〜1.5 A部分和环氧导电银乙毫升。
注意：
- 手动应用混合银环氧树脂的顶部和所有的3个石墨烯纸层的前端，以保证层上的叠层结构（ 图1c）的A面之间的良好接触，然后将1厘米铜导线端部中的环氧基和任意两个之间层。轻声平方米ueeze层以去除多余的环氧树脂，并保证良好的电接触。重复的层叠结构的B侧。
- 将整个装置在炉架，干通宵70℃，1个大气压。
4，准备样品和媒体
- 制备电导率的频谱使用电导率仪，290毫甘露醇原液和等渗磷酸盐缓冲盐水（PBS）串行加法等渗介质。
注意：〜290毫渗透摩尔浓度/ L PBS电导率和体积浓度之间存在线性相关性（导通）在〜290毫渗透摩尔浓度/ L甘露醇溶液（不导通）。视频功能的0.01 S / m的导电介质。 - 混合聚苯乙烯珠与准备电导率介质或电子纯净水（〜5×10 -6 S / M），以1:50体积：体积比。这个协议是很容易适应生物的细胞。
5，安装和试验设备操作
- 夹紧装置ØNTO使用改性纸夹具或等效中等压力（ 图2d）的载玻片上。基脚应该是足够接近的微孔密封层叠结构在载玻片防止样品泄露。夹紧应该适合于显微镜载物台与压力优化，以a）阻止叠层结构的变形，以及b）保证微井流体不泄漏。变形改变了很好的几何形状和光通路减少实验的重复性。
- 使用微注射器或等效慢慢〜1微升的样品注入到微井和避免引入任何气泡。如有必要，重复注射并要当心不要与锋利的针损坏微孔壁上。稍过量填充微孔，并立即滑动玻璃盖在微孔去除多余的液体，防止蒸发，并确保可重复的量为每次实验。
注：钻石尖玻璃刀工程以及SCORe和裂纹玻璃盖大小。 - 确保完成层压微型的显微镜载物台，并连接函数发生器的电极导线的两个铜导线在设备上。在的AxioVision（蔡司软件），点击按钮开始摄像机录制的多维采集模式。开始CCD摄像机记录文件具有和不施加的电场的响应后，启动函数产生的信号在一个固定的时间段。
注：在这里，100 Hz至10 MHz的频率，具有15 V 峰峰值信号被应用和实验观察到在10倍的放大倍率在1〜200的载玻片表面之上，持续2秒，而不需要现场和〜5分钟与现场应用。图像进行数字化保存在每秒（fps）的1至5个帧进行进一步分析。 - 当实验完成后，删除该设备，拆除夹具。双方沉浸在肥皂水载玻片和设备，然后冲洗干净。约30时再利用设备s的一贯表现。
6，数据分析和图像处理
- 分析与优选的软件，如ImageJ的图像数据。从连续的图像在一个给定的时间步长之间的质点位移计算速度。
- 计算基于速度编译趋势及理论29比较实验介电泳力和磁场强度。
- 测量粒子的速度沿径向在微井几何与电场梯度的形状相一致。从微井边缘向中心，找出8同心等电轮廓（350，300，... 50，0微米），这导致在7个区域。
注：时间为粒子穿越50微米的距离来计算速度。当几何变化必要吧，等电轮廓进行了小幅调整。
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Representative Results
在6微米的聚苯乙烯珠的介电电泳实验是在0.38 立方毫米的圆柱形微孔进行。结果表明，一个三维层叠的石墨烯纸为基础的装置可以说明类似的介电电泳的签名作为三维金属箔层压装置20，21，传统的二维金属电极26，27，和二维绝缘体装置25。在下面的实验中，一个15 V 峰峰值 AC信号被施加并且频率从100赫兹到10 MHz 30改变。定性DEP结果在时间0现场应用（第一列）之前显示在图3和5分钟（第二列）中的电场之后。当没有电场存在，颗粒慢慢沉淀物通过重力装置底部（ 图3a和3b）。图3c和d示范典型pDEP结果1 kHz时，为由颗粒聚集朝向微井的边缘表示。 图3E和F示出了NDEP在10 MHz，通过集中在中心粒子的所指示的。
图4a示出了用于电导率之间0.0001 S / m和1.3的S /米以上的频率范围从100赫兹到10 MHz的实验DEP反应。负的DEP（NDEP）或正DEP（pDEP）是通常通过观察珠子走向的微井的中心或边缘的确定。然而，这是通过循环附近的微井，能同时发生与DEP行为在这两个区域中的导电频率空间如由图4a中公开的符号的边缘流动（20-50微米的直径）的复杂化。观察到低于〜10千赫在所有测试的电导率一种类型的再循环流动的，而其他类型，观察到高导电性和高的频率。该循环流量改变NDEP或pDEP珠MOT离子的程度不同。这些并发力示于图4a中的参数空间。
介电电泳速度表列使用中的微井同心计数器（ 图5a）的径向位置的函数。速度的趋势与位置显示在图5c。正如预期的那样，最高速度是接近微孔的边缘，其对应于该区域具有最高电场强度（ 图5b）的观察。颗粒的1分钟记录过程中垂直移动的焦平面的进出。然而，这种垂直速度幅度估计，因此，相比于测得的5〜100微米/秒同心速度是可忽略的。在平面内的速度范围从5微米/秒到36微米/秒，这对应于≈1.07×10 -16米4 /（V⋅秒）以上的电场密度区域的DEP的迁移率的S 5×10 4 V / m至3×10 5 V / m时。速度是与所申报的三维系统31，32，二维电极系统33一致，并且直流绝缘体厅系统34。
图1制作工艺的层压设备。一）交替堆叠6层的石墨烯纸和5层的双面胶带，以防止邻近的石墨烯层之间的连接b）按各层固定在一起并切断多余的双面胶带沿红色虚线。 三）钻一个微孔中通过微铣削中心， 如图2a和2b。四）坚持两个铜导致A面和B面搭配银色环氧树脂。 五）最后的制作设备。
图2 a）电脑控制的微型钻孔机。 二）夹层结构被固定在舞台上用夹子固定。压缩空气是用来吹断屑端铣刀。 三）微器件实验用显微镜，CCD摄像头，函数发生器和计算机进行数据采集。 四）微型设备的特写视图夹在载玻片放在显微镜阶段进行。交流电从函数发生器的电信号通过铜导线应用于该设备。
图3的三维内典型的介电电泳的响应层叠微型装置。甲15 V 峰峰值被施加了1.3×10的介质电导率-4 S / M。第一列显示了颗粒在实验开始与电场关闭，而第二列显示了反应5分钟后，AB）粒子的沉淀到微井底部; 坎德拉）在1千赫，颗粒附近聚集的微井边缘，表明pDEP。EF）在10兆赫，颗粒集中到微井中心，说明NDEP。
图4 a）实验DEP的6.08微米的聚苯乙烯珠作为导电性的在PBS中的一个函数（0.0001-1.3 S / M）和频率（100赫兹至10 MHz）行为调整甘露醇溶液。小环流观察并发接近微孔的边缘为低频率（<1 kHz）和所有测试的介质的电导率，以及在高频率和高电导率介质的DEP行为。空心符号
代表NDEP没有再循环。下面〜100赫兹，电解气泡观察，并通过Δ，b表示）预测0.0001 S / m至1.3 S / m的分频点。 请点击此处查看该图的放大版本。
聚苯乙烯珠经历NDEP在15 V 峰峰值 ，1MHz的现场图5。一）影像。同心圆跟踪粒子的运动，因为它们穿过微孔。 二）COMSOL仿真电场梯度（V / m的簇珠的微孔。 三）介电泳速度的横截面为径向位置中的一个函数2）微孔。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
这个手稿详细介绍用于制造新型的6石墨烯层和5层带微型协议。此外，设备的操作是通过6.08微米的聚苯乙烯珠观测到的DEP行为以及一个独特的，几何有关粒子速度分析方法说明。这种多用途的方法构造非线性电动设备比电极与流体层的微细加工技术成本更低，同时产生同样可靠的结果。
此外，这种新颖的三维石墨烯纸微型产生了同意这两个理论预测行为的实验介电泳结果和以前报道的实验结果35。从100 Hz的信号频率高达10 MHz和介质的电导率为1×10-4 S / m至1.3 S / m的，实验验证交叉频率，低于该pDEP观察及以上的NDEP观察到的存在。正如预期的那样，NDEP观察到在最电导率-频率空间中的， 如图4a中所示。理论预测，6.08微米的均匀的聚苯乙烯颗粒（ερ= 2.55，σρ= 1.3×10 -3 S / M 36）有一个交叉频率时，σ 米<σρ= 1.3×10 -3 S / M。在其余的参数空间为1×10 -4至约1.3×10 -3 S / m时，≈1千赫量级的交叉频率（F CO观察到S / m的，例如，F CO是1千赫的3.9×10 -4 S / m的介质，而以前在1.0报道的实验结果×10 -3 S / m的被F CO = 5千赫35，和基于模型的预测值是168千赫37-39，这三个结果是在给定的交叉频率的敏感度在中共同改变粗糙的协议考虑nductivity在特定的区域40，以及其它配合电荷诱发因素和设备的变化。 如图4b所示 ，由于介质电导率的变化略微从1×10 4 S / m至1.3×10 -3 S / m时，相应的交叉频率降低2个数量级以上。使用168千赫的交叉频率在模型中，参数与上面指定固定的，可以解出粒子的导电性，发现它是1.00×10 -3 S / M相比，1.3×10 -3 S的真正价值/米（23％的差异）。
两种循环的观测电导率频空间流进行观察，归因于低频和高频区域，分别交电渗和电热流量。对于低频（<10千赫）在所有被测介质的电导率，局部颗粒循环速度增加频率与由于介质电导率的微小变化减少。无论是导电性频率条件和循环轧辊（20-50微米）的大小同意前面的AC电渗流研究41-43。对于较高频率（> 100千赫）在相对高的介质电导率（> 0.01 S / M），NDEP开始由再循环被制服。再循环粒子速度增加为介质电导率增加，频率增加。再次，无论是传导性频率条件和环流的大小同意先前的调查结果44-47。
在三维DEP，颗粒也遇到介电电泳力在微井多个垂直位置推邻近的石墨烯纸层之间的颗粒。在光学显微镜下观察这部分受到影响，因为光散射集中的DEP颗粒上面和利息的平面的下方。由于重力沉降随着时间的推移，铁道部ë粒子进行观察底部DEP聚焦平面附近比在最上面的DEP的聚焦平面（数据未示出）48。
设备制造是非常灵活;提供的协议可以很容易地适应与更多层或其他材料的设备。作为替代绝缘层材料，聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜可旋涂到一个可控的相当均匀的厚度。硅橡胶具有良好的电气特点和表面化学性质，但处理这类薄脆弱的薄膜是麻烦。双面胶带具有更均匀的厚度，较容易处理具有更好的层与层之间的密封，从而得到最佳的功能器件更高的成功率。对XG科学石墨烯纸（叶B-072）运作良好作为电极材料和制造定制提供多样化的电气和机械特性。更高的纳米薄片浓度减少了纸张的电阻24和POLYM埃里克支持防止水吸附而纤维素支撑允许水分子扩散（数据未显示）。
并发症与设备功能可以包括增加电阻率在井面，断电器连接，电解气泡，在样品装载泡沫的介绍，歪斜以及几何形状。在过程步骤1.5绝缘试验应在每个实验来评估设备的完整性之前使用。在使用XG石墨烯纸的表面暴露在微孔磨去后〜30的实验。不一致的DEP的结果很容易通过不稳定的全球流动通过微井或没有响应于所施加的电势确认。如果没有轻拿轻放A面和B面（ 图1c）石墨烯器件的层可能会中断。在这种情况下，需要更换设备。在频率等于或低于100赫兹，在三维的石墨烯电极催化电解水以产生O 2和H 2的气泡。钍是频率阈值是2个数量级比该组的前面的结果与传统微加工2D电极49，它扩展了操作空间，其中的颗粒或生物细胞可以询问更低。从样品注射器气泡应避免由于电场的形状和光学干扰。最后，完全垂直微钻井是一致的光学照明和观察的DEP行为的关键。微井倾斜变得更难以管理，作为层压层的数量增加。大多数和共聚焦显微镜光有工作在1毫米以下的距离，这样的DEP行为不能在厚度上面这个很容易观察到。然而，增加第三维将是有利的大规模处理的DEP。
一个直接的石墨烯复合纸/胶带结构已被证明是一个间歇式3D DEP微型设备。在未来的应用，粒子或CELL悬挂可以通过设备不断流动以获得更高的吞吐量DEP排序50。这需要大量的分离和鉴定稀有细胞分选特定的生物医学应用包括检测循环肿瘤细胞51和败血症52。此外，吸水石墨烯纸可同时用作用于颗粒/细胞浓缩器的电极和扩散介质。最后，石墨烯纸已被证明是一种可行的生物传感器24。这里描述的装置可用于同时DEP浓度和生物检测在石墨烯的表面上。因此，不同的石墨烯纸的类型可能是在采用电学和/或生物传感器的高通量微流体系统中有用的电极。
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Disclosures
作者没有冲突披露。
Acknowledgments
感谢XG科学的慷慨捐赠的石墨烯纸。由于三弗里德里希博士慷慨地让我们用微钻设备。特别感谢扩展到Tayloria亚当斯为叙述的视频。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Beads | Spherotech, Inc. | PP-60-10 | 6.08 μm diameter |
| Graphene paper | XG Sciences, Inc. | XG Leaf B-072 | |
| Double sided tape | 3M | N/A | 136 office tape |
| Silver conductive epoxy | MG chemicals | 8331-14G | Part A & B included |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 091M0020V | |
| Phosphate buffer saline | OmniPur | 0381C490 | |
| Microscope (CCD Camera) | Zeiss | Axiovert 200M | |
| Function/waveform generator | Agilent | 33250A | |
| Syringe | Hamilton | 84505 | |
| Paper Clamp | ADAMS | 3300-50-3848 | |
| Oven | Fisher Scientific | 280A | |
| Multimeter | OMEGA | HHM25 | |
| Micro-milling machine | AEROTECH | ABL1500 stages/A3200 Npaq controller | |
| End mill | ULTRATOOL | 708473 | |
| AxioVision | Zeiss | Version 4.8 |
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