Introduction
İnsan enterik virüsler su kaynaklı hastalıkların 1-3 önemli etken vardır, ama konsantrasyon olmadan kendi algılama zorlaştırır, genellikle kontamine çevre sularında düşük sayılarda bulunurlar. Virüsleri konsantre için kullanılan prosedürler, genellikle filtre yıkama sıvısının bir hava filtresi, yıkama, ardından adım, ve ikinci bir konsantrasyon yer alır. Yaygın bir filtrasyon işlemi (son 4,5 'de gözden geçirilmiştir), elektropozitif filtreler gibi yüklü membran kullanılması ile ilgilidir. Bu filtreler, filtre alanı (pozitif yüklü) ve hedeflenen virüs parçacıkları arasındaki elektrostatik etkileşimleri kullanılarak su içinde süspansiyon haline getirilmiş virüs yakalama dayanır (negatif yüklü). Ticari olarak mevcuttur iki elektropozitif filtreler bu teknoloji güveniyor, cam / selüloz ve nano-alümina / cam elyaf filtreler. Cam / selüloz filtre maliyetleri cam / ce kullanımını sınırlamak kadar 10 kez nano-alümina / cam elyaf ki, vardırRutin virüs kontrolü için llulose filtreler. Son çalışmalar ucuz filtre alternatif kullanımını haklı, farklılıklar ortam su 6,7 den enterovirüslerin kurtarma bu iki filtre arasındaki nominal olarak sonucuna varmışlardır. Örneğin elektronegatif ve cam yün filtre gibi diğer filtre ayarları, ancak, her iki kaynak, su (elektronegatif filtreleri) tabi tutulmasını gerektirir ya da (cam yünü filtreleri), ticari olarak mevcut olmadığında, incelenmiştir. virüs konsantrasyonu prosedürlerinin geliştirilmesi çok sudan virüs verimini artırmak amacıyla, birinci konsantrasyon teknikleri (filtre) optimize odaklanmıştır. Ancak, hacimleri mililitrelik için tipik olarak 1 L yıkama sıvısı hacmini azaltır ikincil konsantrasyon işlemleri, ayrıca virüs geri kazanımlar 8 üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir.
Bağırsak virüslerinin ikincil konsantrasyonu tipik olarak sığır özü bazı türleri gibi bir pıhtılaştırıcı madde dayanır (organik floccuyon) veya yağsız süt flokülasyon 9-12 filtre yüzeyleri virüs parçacıkları kaldırmak için. Son zamanlarda, selit (ince parçacık) eklenmesi ile bağlanmış sığır eti ekstresi ile bir ikinci yoğunlaştırma işlemi adenovirüs, enterovirüs ve Norovirus 8,13,14 geri kazanılması için umut verici olduğu gösterilmiştir. Bu virüs parçacıklarının organik flokülasyon yöntem ile aynı prensiplere göre, Celite konsantrasyonu işleri tutunur ve süspansiyon çözeltisinin pH'ını değiştirilmesiyle partiküller (topak veya selit) salınır. Bu iki ikincil konsantrasyon teknikleri arasındaki karşılaştırmalar çivili adenovirüs (AdV) türleri 40 ve 41 8 kurtarma değerlendirilmiştir. Bu çalışma iki ikincil konsantrasyon teknikleri adenovirüslerin kurtarma istatistiksel olarak benzer olduğu sonucuna varıldı. Bununla birlikte, organik çökeltme yöntemi, bir 30 dakika gerektirir. pH 3.5 inkübasyon, selit tekniği pH 4.0 kısa bir inkübasyon (10 dakika) gerektirir ise. Organik flocculatiyonu, tertier konsantrasyon sırasında topaklanma maddeleri toplamak pahalı laboratuar ekipmanları (santrifüj) kullanımını gerektirir, farklı olarak selit tekniği süspansiyondan selit parçacıkları ayırmak için sadece temel laboratuar ekipmanı (vakum filtrasyon) kullanılır.
Filtreler ve ikincil yıkama teknikleri belirli kombinasyonları da virüs kurtarma etkileyebilir. Bir çalışma birincil (elektropozitif filtrelerin) belirli kombinasyonları ve ikincil konsantrasyon teknikleri (Celite veya organik flokülasyon) adenovirüs 13 kurtarma önemli bir etkiye sahip olduğu sonucuna varmıştır. Bu bulgular, bu teknikler kullanılarak zaman bu optimizasyon optimum verilen bir su matris hedef virüsü geri kazanmak için gerekli olduğunu düşündürmektedir. Optimizasyon sayısız değişkenler (filtre tipi / marka, pH elüsyon çözeltisi, selit / organik flokülasyon) değerlendirilecektir çünkü, zorlu bir süreç birçok araştırmacı aktif önlemek tüketen bir zaman.
Bu s içinHer virüs tipi eşsiz bir kapsid morfolojisi ve özel kapsid şarj görüntüler beri tudy, bir prosedür, Muhtemelen çivili insan adenovirüs 40 suşlar ve 41. kullanarak sudan virüs konsantrasyonu için en uygun koşulları belirlemek için geliştirilen, konsantrasyon protokolleri her virüs için optimize edilmesi gerekebilir Optimal viral kurtarma ulaşmak için hedef. 1) elektropozitif filtre ardından 2 diskler) ikincil konsantrasyon olarak celıte tekniği karşı kurulmuş bir organik flokülasyon yöntemi değerlendirmesini kullanarak musluk suyunda virüs kurtarma değerlendirilmesi, ve 3) değerlendirme: Bu çalışma AdV 40 ve 41 ile konsantrasyon için bir yaklaşım sağlar tertier konsantrasyonu için elüsyon tamponları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Züccaciye ve Filtre gövdeleri 1. Hazırlık
- Aksi belirtilmediği sürece, 15 dakika için 121 ° C'de tüm cam, filtre gövdesi ve çözümleri sterilize. Sterilite sağlamak için, tüm açıklıkları veya alüminyum folyo ya da sterilizasyon öncesinde bant güvenli kağıt ile ya maruz yüzeyleri kapsar.
- 1 L'lik bir yan kol Erlenmeyer şişesine filtre yuvası (47 mm çapında) takılarak filtreleme aparatı birleştirin. Gerekli filtreleri toplayın: 47 mm çap elektronegatif / elektropozitif disk filtreler.
- 1 L'lik 1.5% sığır eti ekstresi hazırlanması (topaklanması; topaklanma parçacıklarını üreten çözeltinin pH değeri 3,5, ya da olmayan flokülasyon altına düştüğünde, pH 3.5 agrega değildir) eti ekstresi, 15 g içinde çözülerek 0.05 M glisin ile, 1 L deiyonize su ve 3.75 g glisin ilave edilmesi.
Not: Non-pıhtılaştırıcı sığır ekstraktlar önce yüksek konsantrasyona kadar selit kullanılmasını gerektirmektedir. - Elüsyon katkı sodyum polyph ekle% 0.1 konsantrasyonda sığır ekstraktı osphate.
- 1 M hidroklorik asit solüsyonu ekleyin sığır eti ekstresi, istenilen pH pH solüsyonu karıştırma, damla damla. 121 ° C'de, 15-30 dakika süreyle otoklavlanmaktadır sığır özü.
- Ince, orta, ya da (non-flokülan sığır özü yalnızca kullanım için) büyük parçacık celite 0.1 g ölçün.
- Erlenmeyer yan kol şişeye ve vakum prizine uyumlu boru takarak vakum / emme hazırlayın.
Çözümler ve Virüs Stokta 2. Hazırlık
- 1 M HCl 1 L hazırlayın.
- 1 M NaOH ile 1 L hazırlayın.
- 1x PBS çözeltisi hazırlayın (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 1.47 mM K 2 PO 4 ve 4.3 mM NaH 2 PO 4).
- 1 M NaOH ile 9.0'a 1x PBS pH ayarlayın.
- Hazırlayın ve 9 ml PBS (pH stok virüsü 1 ml karıştırılarak 10 4 -10 5 en muhtemel sayı (EMS) ml -1 stok virüs sulandırmak7), daha önce tarif edildiği 8,13. 1 ml alikotlar içinde -80 ° C'de saklayın.
- Potansiyel kirleri çıkarmak için şırınga filtreleme (0.22 mikron gözenek boyutu) virüs stok sterilize edin.
- Klor Musluk Suyu
- Ölçü steril kullanılarak steril musluk suyu içinde 1 litre dereceli silindir ve manyetik bir karıştırma çubuğu ihtiva eden bir 2 L'lik bir kap içine dökün.
- Sodyum tiyosülfat 0.7 g eklenir ve granüller eriyene kadar karıştırılır. 1 M HCI veya 1 M NaOH çözeltisi kullanılarak gerekirse 7-7.5'e musluk suyu pH ayarlayın.
- Çözülme virüs başak (1 ml) ve dechlorinated steril musluk suyu 1 L başak tüm hacim ekleyin. 10 dakika boyunca karıştırın.
- Katkılı bir örnekle aynı şekilde, her bir deney ve yöntem ile ilgili bir yöntem boş (adenovirüs olmadan kloru giderilmiş musluk suyu) hazırlayın.
Millipore Filtre Aparatı 3. Hazırlık
- Filtre konut üzerinde steril örtü çıkarın. SağlamakFiltre gövdesi üst kase ve alt filtre ekranı arasında uygun uyum filtrasyon sırasında örnek sızıntıyı önlemek için.
- 1 L'lik bir Erlenmeyer şişesi, steril kılıf çıkarılır. İyi bir yalıtım oluşturmak, filtre ünitesinin mantar Erlenmeyer şişesi üst açıklığı içinden rahatça sığar emin olun.
- Alt filtre ekranından filtre ünitesinin üst kase çıkarın ve steril forseps ile ekran üzerinde kare 47 mm elektropozitif filtre diski yerleştirin. Alt ekran filtresi konut kase takın ve saat yönünün tersine çevirerek yerine kilitleyin.
4. dokunun Su Filtrasyon (Birincil Konsantrasyon)
- Virüsün 100 ml steril dereceli silindir kullanarak musluk suyu çivili ölçün.
- Virüs, 100 mi 47 mm'lik kıvrımlı cam / selüloz filtresi veya bir nano alüminyum oksit / cam elyaf filtre diski ya da ihtiva eden filtre gövdesine musluk suyu çivili dökün.
- Su yavaş yavaş filtre geçmesine izin verin. O kalan artıklar kaldırmak için nazik vakum uygulayınFiltre yüzeyinden f musluk suyu.
- Tripsin tedavisi kullanıldığında, yüzey filtre edilir ve 5 dakika boyunca inkübasyona% 0.25 tripsin 5 ml ilave ediniz.
- Steril deiyonize su, 50 ml kullanılarak filtre yüzeyinden tripsin yıkayın.
Filtre 5. Virüs Elüsyon
- 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesi filtre gövdesini kaldırmak ve 250 mi yan kol şişede üzerine yerleştirin.
- Silindir mezun kullanarak sığır ekstraktı 100 ml ölçün. Yavaş yavaş filtre gövdesine sığır ekstraktı 100 ml dökün.
- Sığır özü küçük bir (250 mi) bir Erlenmeyer şişesi içinde sığır eti ekstresi yakalama, üzerine dökülen tipteki filtrenin izin verin. Filtreden kalan sığır özü ile çekmek için vakum uygulayın.
6. Celite İkincil Konsantrasyon
- Bir heyecan plaka yıkanarak virüs içeren transfer şişeler. Hafif girdap oluşturmak için karıştırma, karıştırma plaka üzerinde steril manyetik karıştırma çubuğu ve yer ekle.
- Selit 0.1 g eklemesığır özü, 100 ml toz ve selit dağılmasını sağlar. Sığır özü içine steril pH probu yerleştirin.
- PH değeri 4.0 ulaşmak için sığır özü akıllıca 1 M HCl damla ekleyin. Yavaş yavaş 10 dakika boyunca karıştırın izin verin.
- 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesi kullanarak (daha önce tarif edildiği gibi) filtre yuvası üzerine 47 mm ön filtresi yerleştirin.
- Ön filtre üzerinde 100 ml sığır özü / selit karışımı dökün. Sığır ekstraktı yoluyla dökmek için izin verin. Filtreden kalan sığır özü üzerinden çekin hafif vakum uygulayın.
- Filtre konut ağzının ucunda metal boru klibi yerleştirin. Metal boru klibe steril 15 ml polipropilen toplama tüpü takın. Geri Erlenmeyer şişesi içine filtre muhafazasını yerleştirin.
- Ön filtre üzerinde toplanan selit üzerinde 1x PBS tamponu 5 mi, pH 9.0 ekleyin.
- PBS ön filtre ile damla izin verin. 15 ml toplama tüpüne artık PBS üzerinden çekin hafif vakum uygulayın.
7. Organik Flokülasyonu İkincil Konsantrasyon
- Bir heyecan plaka yıkanarak virüs içeren beher aktarın. Sığır ekstraktı 100 ml steril manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve hafif vorteks oluşturmak için karıştırın.
- Sığır özü içine steril pH probu yerleştirin.
- Sığır özü akıllıca 1 M HCI damla ekleyin ve 3.5 pH ayarlayın. 30 dakika boyunca karıştırın.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 2500 x g'de 250 ml'lik santrifüj konik tüplere eluat ve santrifüj dökün.
- Pelet bozmaya değil değil süpernatant alarak bakım kapalı dökün. 1x PBS, pH 9 5 ml pelletini.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 4.000 xg'de süspansiyon santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve pelet atın.
- 7-7,5 pH ayarlayın, filtre -80 ° C'de 0.22 mikron şırınga filtresi ve dondurma ile sterilize.
8. Viral Nükleik Asit Ekstraksiyon
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir ticari kit kullanılarak viral nükleik asitlerin ekstre edilmesi.
- 8,13 yayınlanan primerler ve problar, aynı zamanda reaksiyon karışımı ve termal döngü profili kullanın.
NOT: tahlil için algılama Tahmini sınırı reaksiyonu başına yaklaşık 5 qPCR birimdir. - Aşağıdaki gibi konsantrasyonlarda PCR büyütme katkı maddeleri ekleyin: 10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCI, 4.5 mM MgCI2, 10 mM dNTP, 10 uM primerleri ve 1 uM probu ve polimeraz 0.5 ul olacak şekilde 45 son hacim ul, 96 oyuklu bir PCR reaksiyonu, plaka içindeki deliklerin uygun sayıda ilave edilebilir.
- Bir 96-yuvalı, hızlı reaksiyon PCR plaka her biri uygun oyuğuna PCR amplifikasyon karışımı yüklenebilir 45 ul.
- DNA 5 ul PCR plaka ihtiva eden uygun oyuklara örnek ekstre ekleyin.
- , Isıya dayanıklı kapak contası ile plaka Kapak PCR plaka kuyuların dibine herhangi damlacıkları taşımak için plaka döndürün.
- Foll olarak ayarla PCR amplifikasyon döngüleriakımları: 15 saniye için 95 ° C 40 döngü, 1 dakika süreyle 60 ° C'de, ardından 10 dakika boyunca 95 ° C olarak ölçülmüştür.
10. Veri Analizleri
- 5-1: 1 kapsayan örneklerinin seri 5 kat seyreltmeleri üçlü ölçümleri analiz 625 seyreltme aralığı viral parçacıkların en olası sayı (EMS) belirlemek amacıyla, daha önce tarif edildiği gibi 8,13.
- 5-1: 1 kapsayan adenovirüs deney sivri seri 5 kat seyreltmeleri analiz 15.625 seyreltme aralığı viral parçacıkların en olası sayı (EMS) tespit etmek için.
- EPA EMS hesap (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html) kullanılarak, seyreltme tipi için hesap hesap ayarlayın (1: 5 ya da 1:10) dilüsyonlarda adedine ve sayısı seyrelme serisi içindeki örnekleri çoğaltırlar.
- Yapın bir birim hacim vb (örneğin, 1 mi, 100 ml, normalize ardından verileri 10 log transformasyonu
- Farklı deneysel değişkenlerin etkisini değerlendirmek (örneğin, farklı celite tipleri, pH aralıkları, farklı filtre türleri ve farklı ikincil konsantrasyon teknikleri) (örn, eşleştirilmiş t-testi, bir ya da iki parametrik ya da parametrik olmayan istatistiksel testler yapılarak AdV verimleri üzerindeki veri dağıtım ve deneysel tasarım bağlı) ANOVA yollu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celite seçimi
Celite Üç farklı öncesinde iyi performans varyant seçimi test edildi. Orta ölçekli parçacıklara cezası ile selitler yüksek adenovirüs geri kazanımlarını üretti. Daha büyük selitler kullanımı AdV40 ve 41 (aralık% 32% 100) (Şekil 1) her ikisi için de daha düşük kurtarma ile sonuçlanmıştır. Adenovirüs 40 Ortalama kazanımları 144% ± 52% (ince), 115% ± 28% (orta) ve% 82 ± 53% (büyük) partikül selitler ve AdV41, 132% ± 39% (ince),% 83 ± için % 25 (orta) ve% 11 (büyük) ±% 50. Tek yönlü ANOVA optimize celıte tekniği sırasıyla% 19 ve% 109 ± 16%, ±% 75 iyileşti organik flokülasyon yöntemi o kadar AdV40 (p = 0,7920) ve 41 (p = 0,1439) istatistiksel benzer seviyelerde kurtarıldı belirtilen . Şekil 1 ikincil konsantrasyon teknikleri arasında ve AdV türleri arasındaki farklılıkları göstermektedir.
_content "> Filtre tipi değerlendirmeVirüs-çivili, musluk suyu yüz mililitre hacimleri bir pilili cam / selüloz veya nano-alümina / cam fiber disk filtre kullanılarak konsantre edildi ve selitin veya organik flokülasyon yöntemi kullanılarak işlenmiştir. Filtreler filtrelerden AdV parçacıkları elüsyon için en etkili olacağını belirlemek için pH 7.5, 9.0, 9.5, 10, 11 ve 12, sığır özleri ile elüt edilmiştir. pH 10'da ve selit ile sığır özü ile birlikte, cam / selüloz filtresi, Şekiller 2 ve gösterilmiştir AdV40 (% 52 ±% 22) ve AdV41 (% 64 ±% 4) için (qPCR / EMS) tarafından yüksek kurtarma üretilen 3. AdV40 benzer izledi, her ne kadar biraz zayıf eğilim (P değeri aralığı: 0,025-0,042): Sığır özü pH 10, diğer tüm pH değerlerinde önemli ölçüde daha yüksek AdV41 (,0045-0,041 P değeri aralığı) iyileşti. Bir cam / selüloz filtre organik flocculatio birlikte değerlendirilmiştirN yöntemi. AdV40 için, önemli ölçüde daha yüksek toparlanmalar sığır özü pH'ı 10 (% 40 ± 10%) (P değeri aralığı: 0,010-0,027) kullanılarak elde edilmiştir, ve AdV41 için, hem pH 9.5 ve 10 diğer tüm sığır özü pH test (P değeri aralığı geride : 0,023-0,027) (Şekil 2 ve Şekil 3). Genel olarak, biftek ekstresi, pH 10 ile selit tekniği hem AdV soylarının geri kazanımı için doğrudan karşılaştırmalarda organik flokülasyon yöntem daha üstün olduğu bulunmuştur.
Sığır özü katkı Optimizasyonları
% 0.25 tripsin: 1) eklenmesi ve 2)% 0,1 sodyum polifosfat sığır eti ekstresi takviye: Optimize edilmiş yöntem (cam / selüloz filtre selit ikinci konsantrasyonu ile birleştirilmiş olan biftek ekstresi pH 10 kullanılarak) diğer iki tedavi ile karşılaştırılmıştır. tripsin ilave edilmesi (<sadece sırasıyla% 16 ±% 6 ve% 24 AdV40 14 ve% 41 ± girişler olarak AdV geri kazanımını arttırmak için görünmedi elde edildi strong> Şekil 4). % 0.1 sodyum polifosfat ile takviye edilmiş sığır özü önceki optimize edilmiş bir yöntemle karşılaştırıldığında AdV40 ve 41 en geri kazanımını verdi. AdV40 kurtarma% 13 artış ortaya çıktı, ve AdV41 kurtarma önceki yönteme göre% 7 artarak, ama ne istatistiksel olarak anlamlı idi (p değeri: 0.146). Sodyum polifosfat yüksek yüzdeleri% 1,% 3 ve% 5 (veriler gösterilmemiştir) kullanılması ikinci konsantrasyon sırasında 4.0'e bu çözeltilerin pH değerini ayarlamak için büyük hacimlerde aside gerektiren, etkisiz olduğu bulunmuştur.
Şekil 1: İkincil konsantrasyon tekniği (Celite Organik Topakla karşı) ve kullanılan Celite türüne göre AdV-40 ve AdV-41 Yüzde kurtarma. Hata çubukları, standart sapmayı temsil etmektedir (n = 3) 8.
Şekil 2: İkincil konsantrasyon teknikleri iki tür (Celite ve organik floc) ve sığır özü değişen pH seviyelerinde filtre iki tür (Cam / Selüloz ve Nano-alümina / Cam) kullanarak AdV-40 Yüzde kurtarma. Hata çubukları, standart sapmayı (n = 3) 13 temsil etmektedir.
Şekil 3: İkincil konsantrasyon teknikleri iki tür (Celite ve organik floc) ve sığır özü değişen pH seviyelerinde filtre iki tür (Cam / Selüloz ve Nano-alümina / Cam) kullanarak AdV-41 Yüzde kurtarma. Hata çubukları, standart sapmayı (n = 3) 13 temsil etmektedir.
Şekil 4: AdV 40 ve AdV 41 kurtarma yıkama katkı etkisi ikincil bir konsantrasyon tekniği ve Cam / Selüloz olarak Selit kullanılarak konsantre. Hata çubukları, standart sapmayı (n = 3) 13 temsil etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektropozitif filtreler su virüsleri konsantre yararlıdır; Ancak bu filtreler sırayla onların etkinliğini değiştirebilir kendi yapısı ve kompozisyon farklı olabilir. Bu sorunun Bileşikler, kapsid yapıları ve ücretleri konsantrasyon teknikleri optimum kurtarma 15 sağlamak için uyarlanabilir gerektiren virüs suşları arasında değişmektedir. (Örneğin, elektropozitif filtreler, dana özü elüsyon), hedef virüs daha etkili konsantrasyon 16,17 elde edilebilir, mevcut konsantrasyon teknikleri basit değişiklikler ile.
Bugüne kadar Araştırmalar genellikle birincil konsantrasyonu (filtreler) adımları değiştirerek virüs kurtarma odaklanmıştır, ancak biraz dikkat, aynı zamanda virüs kurtarma 18 etkileyebilecek sonraki konsantrasyon prosedürleri verilmiştir. Farklı ikincil konsantrasyon teknikleri, virüs kurtarma 6,13,19,20 etkileyebildiğini ortaya konmuştur. Celidaha hızlı ve daha basit bir örnek işleme prosedürleri kullanarak te konsantrasyonu, matris çeşitli diğer ikincil zenginleştirme yöntemleri 8,14 bu virüsün benzer düzeyde geri gösterilmiştir.
Nedeniyle dış kapsid yapıları değişen, bazı virüsler fiziksel elüsyon protokolleri filtrelemek için farklı katkı değerlendirmesini gerektiren, filtre matrisinin 21 içinde hapsolabilecek. Örneğin, yüzey aktif madde ilavesi, sodyum polifosfat primer konsantrasyonu 6,13,22-24 sırasında hem bakteriyel ve viral iyileşmesi için. Öte yandan, tripsin eklenmesini takiben gözlenen düşük geri kazanım proteazlar dış viral kapsit'in protein liflerinin yarılması yardımcı olmadıklarını göstermektedir. Ayrıca, nadir değildir 7,25,26 ise, bizim toparlanmalar bazı% 100 aşan olduğu dikkat çekicidir. Daha önce 7,25,26 gösterildiği gibi, bu durum, laboratuar topaklanma vi hazırlanan muhtemeldirRus sivri olarak kullanılır.
konsantrasyon yaklaşımı sunulan küçük hacimli (100 ml virüs su çivili) geliştirmek ve kolaylığından dolayı ve hızlı numune işleme süresi ile birlikte kaynaklarının düşük tüketimi, virüs konsantrasyonu yöntemlerini optimize etmek için pratik bir yol olabilir. Su, küçük hacimli kullanılarak, numune içinde, PCR inhibitörlerinin konsantrasyonu da minimize edilir, ancak her bir kaynak su deney öncesinde PCR inhibitörlerinin varlığı açısından değerlendirilebilir önerilir. Filtreler ve ikincil konsantrasyon teknikleri hem çok sayıda seçenek mevcut olduğundan, küçük hacimli konsantrasyon teknikleri birçok değişkenden hızlı değerlendirmeler için izin verir. Bu teknikler verilen su matrisler başına hedef virüs konsantrasyonu için en uygun hangi şartlar belirlenmesinde yardımcı olmak için büyük ölçekli filtrasyon deney öncesinde dağıtılan olabilir umulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
