Abstract
当合成的表面被引入到主体时的异物反应。它的特征在于，吸附血液中的蛋白质，并随后附着的血小板活化，单核细胞/巨噬细胞的粘附性，和炎性细胞信号转导事件，导致后并发症。钱德勒循环设备是一个实验系统，让研究人员研究时，大量血液灌流与聚合物管道发生的分子和细胞的相互作用。为此，该装置已被用作离体模型允许的各种聚合物表面修饰的抗炎性质的评估。我们实验室已经表明，血液导管，通过光敏化学与重组CD47的共价修饰，可以赋予生物相容性的聚合物表面。附加CD47到聚合物表面可以促进聚合血液导管的疗效的有效手段。她EIN是该方法详述用于追加重组CD47对临床相关的聚合血液的导管和使用钱德勒回路作为体外实验模型研究与CD47的改性和控制导管血液相互作用的光活化的化学反应。
Introduction
许多临床程序，如体外循环，肾透析，需要使用聚合血导管，并经常与后并发症相关联。当与血液灌流，这些聚合物非法的异物反应（FBR），从而导致吸附血液中的蛋白和血小板，单核细胞/巨噬细胞的粘附，以及促炎细胞因子，所有这些都有助于后并发症和释放/或设备故障2,3。因此，策略来解决这一问题保持生物材料研究的重要和持续的区域。研究者已经试图通过改变血液接触的表面具有生物活性或生物惰性分子4-6来解决这个问题。研究在我们的实验室都集中在所附的重组CD47（recCD47）到聚合物的生物材料作为一种策略，以减轻FBR和提高这些材料的功效。 CD47是一种广泛表达transmembrANE蛋白与免疫逃逸时表达细胞7-10显示了一个著名的角色，授予“自我”的状态，在承诺时追加到聚合物表面11-13授予的生物相容性。信号调节蛋白α（SIRPα），同族受体CD47和免疫受体基于酪氨酸的抑制基序（ITIM）基家族的跨膜蛋白的成员，表达于骨髓来源14的细胞。我们以前表明，CD47，通过SIRPα介导的细胞信号传导，下调在体外 ， 离体 ，以聚氨酯（PU）和聚氯乙烯（PVC）的免疫反应，并且在体内模型11-13。
中央到我们的调查是一种相对较新的光活化化学，本文中所描述，其中的化学反应性硫醇基团通过管路与多官能聚合物（PDT-BZ反应共价地附于聚合管PH），2 -吡啶基二硫（PDT）组成，所述光反应性二苯甲酮（BzPh）和羧基改性聚烯丙基胺11-13。降低了共价附PDT组与三（2 -羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）11产生一个硫醇化表面，其可接着与治疗性结构部分的反应。这里和前面详述12,13，recCD47，进一步修饰与另外的C末端多聚赖氨酸尾12,13，与磺基琥珀酰亚胺基-4- [N -maleimidomethyl]环己烷-1 -羧酸乙酯反应（磺基-SMCC） 1小时，以产生硫醇反应性基团，从而允许管道和recCD47 11之间的硫化物键的形成。的CD47官能表面的抗炎能力进行了测试， 当然VIV O，使用钱德勒回路装置与人全血，它最初是于1958年描述为血栓凝固15的体外模型。该装置依靠闭管系统部分地填充有空气和旋转马达来循环血液通过导管15。此实验模型提供了机会，检查血液接触后修饰和未修饰的表面的效果，以及这些表面修饰后，血液中的细胞的生理学效果。
recCD47可以被附加到各种使用这种光活化化学聚合的表面，并且它的抗炎能力可以通过利用临床相关的体外模型模仿血液灌注过的聚合物表面11,12进行评估。改性recCD47临床级血液导管显示显著少血小板和炎性细胞附着比未改性的聚合物时，在该装置暴露于人血。这个修改过程中的一步一步的说明详述如下。
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Protocol
1，修改聚合物表面与recCD47
请注意：该协议是示意性地概括于图1图1A示出了产生的巯基反应性聚合物表面图1B示出了产生的巯基反应性recCD47。
- 第1天
- 制备PDT-BzPh在无菌水中的溶液（1毫克/毫升）和碳酸氢钾（KHCO 3）（0.7毫克/毫升）。搅拌过夜，4℃（ 避光 ）。
- 2天
- 切管聚合成40厘米长的块（足够长的时间，以适应周围旋转的轮子）。
- 泡管中hexacylpyridinium的90分钟在振荡器上或上钱德勒回路装置a的0.1％水溶液，在室温下进行。冲洗用无菌水3倍的管子后90分钟浸泡。
- 加入15％的水磷酸二氢钾酸化PDT-BzPh从第1天的液（KH 2 4）。加入50微升的KH 2 PO 4每毫升PDT-BzPh，形成混浊的胶束溶液。
- 浸泡在振荡器上或在装置中进行40分钟，在室温下将酸化的PDT-BzPh溶液的试管中。
- 冲洗，用稀乙酸（1:1,000）的管一次。
- 暴露管紫外线照射60分钟的总时间。旋转管¼转每15分钟照射的整个表面区域。
- 泡管中的20毫克/毫升碳酸氢钾20分钟，在摇动器上或在设备中的溶液（KHCO 3）在室温下进行。
- 冲洗在4℃下在无菌水中，用无菌水3x和存储管中。
- 3天
- 溶于5毫克磺基-SMCC在200微升二甲基甲酰胺（DMF）（ 注意：请在通风橱 ）。
- 加入制备步骤1到recCD47聚赖氨酸溶液0.1毫克/毫升的磺基-SMCC溶液50微升，并搅拌在滚装60分钟OM温度。
- 在60分钟的轰动，德加无菌贝科的磷酸盐缓冲液（DPBS），备用。
- 净化磺基-SMCC反应recCD47使用每个制造商的指令7K分子量截止旋转脱盐柱。收集最后的流通（优质硫醇反应recCD47）并稀释至所需的涂布用DPBS该管的内部的容积。
- 冲洗2天管无菌，脱气DPBS 3倍。
- 反应管的改性表面用20毫克/毫升，三（2 - 羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）在脱气的DPBS为小于2分钟的溶液中。冲洗用无菌脱气DPBS 4倍的管子。
- 加入磺基-SMCC反应recCD47在管子和孵育过夜，在4℃在摇床上或装置。
recCD47对表面改性2，免疫定量
- 修改冲洗管从第3天机智量化ħDPBS 3倍。不使用存储区管量化在DPBS中在4℃下。
- 使用4毫米的活检穿孔，使管式两份样品，并将活检拳在96孔板的孔中。
- 制备阴性对照包括不与检测抗体处理的未修饰的管样品。制备抗体的控制由与检测抗体处理未修饰的管样品的。制备与检测抗体处理的改性管材的测试样品。
- 块样品用0.4％牛血清白蛋白（BSA）的DPBS中，在室温下60分钟，在振荡器上。
- 后粘连，吸BSA和冲洗用Tris缓冲盐水加1％吐温20（TBST）的3倍，在振荡器上，每次10分钟。
- 按照制造商的建议免疫准备稀释抗体的稀释工作在0.4％BSA的。在0.4％的BSA 100的稀释：人CD47抗体B6H12-FITC 1。
- 加入200μl抗体稀释至适当的水井。 IncubaTE阴性对照，只有0.4％的BSA。在室温下孵育为在振荡器上60分钟（ 避光 ）。
- 冲洗用TBST 3次，每次在振荡器上10分钟。吸出最后的TBST漂洗，加入200微升的DPBS到管样品孔。
- 收集最终流过，这是高质量的巯基反应性的重组CD47并稀释至所需的涂布用DPBS管子的内部体积。
- 用酶标仪用FITC激发（485纳米）和发射（538 nm）的设置阅读FITC标记的信号强度。
- 计算recCD47结合到聚合物表面的基于标准值，占自发荧光和非特异性抗体对照样品结合。
3，钱德勒循环设备协议
寻求机构审查委员会（IRB）批准的采血协议和知情同意手续之前收集人类血样的开始。获取信息Rmed指从人的献血者同意。
注：图描绘装置示于图2。
- 填写水浴，用蒸馏水，直到大约直径轮子的一半被淹没。添加足够的漂白剂的水浴中，使10％的漂白剂溶液。置水浴至37℃，并让温度达到平衡。
- 收集金属的适配器（在图1B中示出），未修饰的油管和改性油管，以及装配周围装置的车轮， 如图1C所示 。确保管道舒服地适应周围的轮代替金属适配器。
- 获得使用IRB批准协议30毫升血液样本，在预充2毫升柠檬酸或其他抗凝血剂的小瓶中，并颠倒混匀，以防止凝血，一旦样本已收集。
- 加入约10毫升血液使用的金属阀与注射器的每个管中，留下一些空气在管内。固定在阀帽而rotate 3小时。
- 沥血为用10％漂白粉溶液处理废烧杯（或所要求的体制政策）。
- 轻轻冲洗管内用DPBS去除血液的所有痕迹。收集流过的废物烧杯。处置血液按照体制政策。
- 消毒的装置和任何血液接触，用10％漂白剂溶液或根据机构政策表面。
- 处理样品的荧光显微镜或扫描电子显微镜，如下所述。
4，荧光显微镜，细胞计数
- 准备了4％多聚甲醛（PFA）解决方案（ 注意：请在通风橱 ）。
- 在4％的煤灰液管孵育过夜，4℃。
- 隔夜培养后，除去4％的煤灰和冲洗膜轻轻地用DPBS。
- 切管段，以暴露腔表面进行染色。
- 染色管的几滴安装媒体与4'，6 -二脒-2 -苯基吲哚（DAPI）进行30分钟，在室温下的部分（ 避光 ）。染色后，用水冲洗管轻轻地用DPBS降低背景DAPI信号。
- 图片用荧光显微镜配备了DAPI过滤器和数码相机计数细胞在9盲目选择来看下放大200倍的场数。
- 每个视场记录细胞进行计数，并执行适当的统计分析，以确定结果的统计意义。
5，扫描电子显微镜
- 准备2％戊二醛溶液（ 注意：请在通风橱 ）。
- 孵育管的2％戊二醛溶液中过夜，4℃。
- 隔夜培养后，轻轻冲洗管3X用DPBS。
- 准备四氧化锇的1％溶液（ 注意：重度吸入性危害！使用通风柜）。
- 在四氧化锇在室温下的1％溶液15分钟孵育管。
- 轻轻冲洗管子3X用DPBS。
- 制备了一系列的乙醇浓度（25％，50％，75％，95％和100％乙醇）。
- 脱水管保温在系列乙醇浓度。孵育在25％，50％，75％，和95％乙醇各20分钟。孵育在100％乙醇中30分钟。
- 临界点干燥与CO 2的管45分钟以除去所有的水分。
- 安装管段上试桩用银浆或石墨。
- 外套管段与金 - 钯12.5纳米。
- 检查在扫描型电子显微镜。
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Representative Results
通过使用PDT-BzPh和TCEP，连同硫醇反应recCD47使用SMCC聚赖氨酸产生硫醇反应性聚合物表面允许recCD47到聚合物表面的附着。改性方法是示意性地概括于图1中 。这个修改过程的方便之处在于它可应用于许多不同的蛋白质和许多不同的聚合物表面，假设蛋白能够以足够的化学反应性基团，例如含胺的赖氨酸和修改该聚合物具有足够可用的烃。
先前已证明，recCD47可以附加到使用该协议11-13聚合物表面。 如图3A所示 ，显著FITC染色为recCD47可见，使用FITC偶联的抗体，以CD47的胞外Ig结构域，其特异性定位于膜如由DIC成像（ 图3B）。这些结果表明，recCD47可以共价连接到聚氨基甲酸乙酯薄膜。测量所述荧光单元和与标准曲线进行比较来确定的表面结合的recCD47浓度。我们已经表明，recCD47可以附加到聚合物表面在水平超过500毫微克/厘米2,11-13。这些结果证实，此巯基聚合物改性的协议可以用于附加的聚赖氨酸修饰的重组蛋白对聚合物表面。
CD47已经被证明是一个标记“自我”预防炎性细胞附着和免疫系统激活7-13。 在体内条件下尽可能地模仿在离体环境，人全血可以通过在钱德勒回路的装置未改性和改性聚合物管材被灌注（ 如图2所示）。细胞附着在油管可以通过DAPI染色（评估
图1示意表面改性。 A）通过培养该聚合物表面与光活化交联剂PDT-BzPh和随后的还原用TCEP。 乙）生成硫醇化聚合物的表面</强> SMCC被用来产生硫醇反应recCD47，然后将其与硫醇合成的表面，得到recCD47官能化的表面进行反应。
图2，图的钱德勒循环装置。 A）该装置由一个水浴加热至37℃，固定在连接到旋转电机的金属柱旋转的车轮。此设置允许在旋转电动机来转动车轮，从而浸没管子的部分到37℃的水浴和血液灌注过管路。 乙）金属接头，用于连接管路的形成环的端部围绕旋转轮之一。血液通过金属阀口加入到管和封端的阀帽。C）一旦组装好，管材和金属阀应该适合紧贴芳ound转轮，如下所示与空管。
图上的聚氨酯薄膜3量化recCD47的 。抗体是针对CD47的外Ig结构域被用来量化recCD47结合到聚氨酯膜的量。下放大200倍与显示FITC检测recCD47的附加 到聚氨酯（A）适当的过滤器设置拍摄荧光显微镜图像。 （B）中的DIC图像表明，FITC标记的信号是特定的聚氨酯膜。
图4细胞粘附于未修饰的和recCD47改性的聚氨酯 。人全血被收集并灌注了未修饰或recCD47改性聚氨酯膜为3小时。以下的3小时灌注，薄膜，用DPBS冲洗，并且粘附的细胞在4℃下用4％PFA中过夜和DAPI染色30分钟，在室温下进行。使用下放大200倍和适当的过滤器设置在荧光显微镜DAPI染色细胞计数。 （ 一）9随机选择的视场计数的每个修改。 （B）的数据代表的视图9字段，表示为平均值±标准误差（p值= 0.004）。
recCD47图5，扫描电镜分析修改和控制面以下的体外分析 。人全血被收集并灌注了未修饰或recCD47改性的PVC管3小时。代表图像显示显著细胞附着到unmodifi编辑表面，同时recCD47改性表面只显示一个偶然的连接池。
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Discussion
光活化化学（总结于图1），使得几乎任何聚合物表面具有足够的烃，以方便PDT-BzPh附着和随后的UV照射，以修改光激活的PDT-BzPh。官能聚合物与表面活性巯基可以为后续的连接各种兴趣测试的分子组成。在我们特定的研究中，我们选择了重组CD47 11-13。 ，我们使用所涉及的蛋白质的胺基团与双官能交联剂SMCC 11-13的反应的特定结合化学。这提供硫醇反应recCD47用于与巯基化的聚合物表面随后的反应。最终产品是一种单硫醚键共价结合的recCD47到聚合物中。为了帮助确保没有被用于反应从在CD47的氨基酸的胺基团，并从而缓解疗效固定化CD47，我们进一步修改recCD47通过在蛋白的C端插入多聚赖氨酸的标签。一个类似的分子的策略可以与其它蛋白质被应用于这将是可行的。因此，结合化学这里介绍和其他地方11-13为评估潜在的治疗性分子的合成后，表面赋予生物相容性能力的重要机会。
这个协议的缺点在于，露出某些类型的聚合物，如聚氨酯，UV照射的长时间可导致变色。这可避免放置在聚苯乙烯餐具的聚合物（在组织培养中常用的），以防止聚合物的变色，但又不妨碍了PDT-BzPh的光活化。在这个协议中使用的UV光的波长为302纳米;从该波长的偏差可能会导致低效率的光激活PDT-BzPh的。如果使用不同波长的紫外线光，紫外线照射时间的优化是必需的，以确保显著光激活。
根据这一协议允许recCD47到聚合物表面的附着，对免疫逃逸和输送的“自我”状态的宗旨，以聚合物表面，以防止异物反应。该recCD47的量化附加到表面使用完成了FITC标记的抗体对CD47的免疫球蛋白结构域使用的免疫测定和荧光显微镜（ 图3）。这种方法可以适用于附加在聚合物表面假设抗体的可用性的其他蛋白质。未能获得recCD47（或其他蛋白质）的显著附属物可能是由于多种因素，其中包括，未能光活化PDT-BzPh，在聚合物表面自由烃不足，聚合物表面的疏水性，或该聚合物可以是太厚或不透明的，以允许光线通过的足够quantific通报BULLETIN。所有这些变量可以通过实验测试，并为特定的聚合物进行了优化。
钱德勒循环装置是一种用于对整个人类的血液接触到聚合物表面的体外分析的独特工具。该系统非常类似于血液灌流通过各种医疗过程中使用的临床血液导管，从而实现了与血液接触面有关的许多生理端点分析。作为生理端点recCD47到聚合物表面的附属物，用DAPI染色（ 图4）和扫描电子显微镜（ 图5）细胞计数使用。其它端点也可以使用，这取决于设备的可用性，例如，也可以使用细胞计数之前，通过聚合血液导管的血液灌注后。相比未修改的控制面无论如何，recCD47改性表面显著表现出较少的贴壁细胞。这些大た表明recCD47传达生物相容性聚合物表面，并且可能被用于防止在使用聚合血液导管的临床程序的快堆。
虽然这是一种广泛使用的用于血液灌注研究的体外模型，它是有限的，在某些方面。从要求产生了该方法的两个主要的缺点，包括空气与血液样品的试管中。与空气中的频繁的血液相互作用可引起白细胞和血小板聚集和蛋白变性16-18，其可与某些端点干扰。其次，空气保持在最高点的电路，限制血液循环19的速率。尽管该方法的明显的局限性，它诱导血少损伤比竞争的方法19，并作为筛选潜在的生物分子的生物相容性上聚合血液导管的一种方式。一旦候选生物分子通过鉴定该方法中，进一步的分析可以通过在体内动物模型来获得。最终，需要改性的聚合物的生物相容性，以使用合适的体内模型系统中进行确认。
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Disclosures
研究报告本出版物中所生物医学成像与生物工程研究所在奖号R21 EB015612（SJS）和国家心脏，肺和血液研究所支持的国家中，根据奖号T32 HL007915（JBS和RJL）卫生研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
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