Abstract
La réaction de corps étranger se produit lorsqu'une surface synthétique est introduit dans le corps. Il est caractérisé par l'adsorption de protéines du sang et la fixation subséquente et l'activation des plaquettes, des monocytes / macrophages adhérence, et les événements de signalisation des cellules inflammatoires, ce qui conduit à des complications post-procédure. L'Appareil Chandler Loop est un système expérimental qui permet aux chercheurs d'étudier les interactions moléculaires et cellulaires qui se produisent lorsque de grandes quantités de sang sont perfusés sur des conduites polymériques. A cet effet, ce dispositif a été utilisé comme un modèle ex vivo permettant d'évaluer les propriétés anti-inflammatoires des différentes modifications de surface polymère. Notre laboratoire a montré que les conduits sanguins, modifiées de façon covalente par photoactivation chimie avec CD47 recombinant, peuvent conférer à la biocompatibilité des surfaces polymères. L'ajout de CD47 sur des surfaces polymères pourrait être un moyen efficace de promouvoir l'efficacité de conduits sanguins polymères. Sonein est la méthodologie en détail la chimie de photoactivation utilisé pour ajouter CD47 recombinant à des conduits sanguins cliniquement pertinentes polymères et l'utilisation de la boucle de Chandler comme un modèle expérimental ex vivo pour étudier les interactions de sang avec le CD47 modifiée et de contrôle des conduits.
Introduction
De nombreuses procédures cliniques, tels que la circulation extracorporelle et de dialyse rénale, nécessitent l'utilisation de conduits sanguins polymères et sont souvent associés à des complications post-procédure 1. Lorsque perfusé avec du sang, ces polymères illicite la réaction de corps étranger (FBR), résultant en adsorption des protéines et des plaquettes sanguines, des monocytes / macrophages adhérence, et la libération de cytokines pro-inflammatoires, qui contribuent tous complications post-procédure et / ou défaillance de l'appareil 2,3. Ainsi, les stratégies pour résoudre ce problème restent un domaine important et continu de recherche sur les biomatériaux. Les enquêteurs ont tenté de résoudre ce problème en modifiant les surfaces en contact avec le sang ou bioactifs bioinertes molécules 4-6. Recherche dans notre laboratoire a mis l'accent sur l'ajout de CD47 recombinant (recCD47) de biomatériaux polymères comme une stratégie pour atténuer la FBR et augmenter l'efficacité de ces matériaux. CD47 est un transmembr exprimée de manière ubiquitaireprotéine ane avec un rôle connu dans l'évasion immunitaire, conférant le statut de «soi» sur des cellules exprimant 7-10 et présente des résultats prometteurs à conférer biocompatibilité lorsqu'elle se rapporte à des surfaces polymères 11-13. Signal alpha-protéine de régulation (SIRPα), le récepteur apparenté pour le CD47, et un élément de motif d'inhibition à base de tyrosine d'immunorécepteur (ITIM) contenant famille de protéines transmembranaires, est exprimé sur les cellules d'origine myéloïde 14. Nous avons précédemment démontré que CD47, par l'intermédiaire de la signalisation cellulaire médiée par SIRPα, régule à la baisse les réponses immunitaires à de polyuréthane (PU) et le chlorure de polyvinyle (PVC) dans in vitro, ex vivo et in vivo dans des modèles de 11 à 13.
Au cœur de nos enquêtes est relativement nouveau en chimie des photoactivation, décrit ici, dans lequel les groupes thiol chimiquement réactifs sont ajoutés de manière covalente à un tube polymère en faisant réagir le tube avec un polymère multifonctionnel (PDT-BzPh), composée de 2-pyridyldithio (PDT), la benzophénone photo-réactif (BzPh) et une polyallylamine carboxy modifié 11-13. La réduction des groupes PDT annexés covalente avec le tris (2-carboxyéthyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) 11 donne une surface thiolé qui peut être ensuite mis à réagir avec des fragments thérapeutiques. Détaillées ici précédemment et 12,13, recCD47, en outre modifié par l'addition d'une queue poly-lysine C-terminal 12,13, est mis à réagir avec le sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) pendant 1 heure pour produire des groupes thiol réactifs, ce qui permet une formation d'une liaison entre le tube monosulfure et recCD47 11. La capacité anti-inflammatoire des surfaces CD47 fonctionnalisés a été testé, ex viv o, en utilisant l'appareil Chandler boucle avec du sang humain total, qui a été décrite à l'origine en 1958 comme un modèle in vitro de la coagulation thrombotique 15. L'appareil repose sur unSystème de tube fermé partiellement rempli d'air et un moteur rotatif pour faire circuler le sang à travers la tubulure 15. Ce modèle expérimental offre la possibilité d'étudier l'effet de l'exposition du sang à des surfaces modifiés et non modifiés, ainsi que l'effet de ces modifications de surface sur la physiologie des cellules du sang.
recCD47 peut être ajouté à une variété de surfaces de polymères à l'aide de cette chimie de photoactivation, et sa capacité anti-inflammatoire peut être évaluée en utilisant un modèle ex vivo cliniquement pertinente imitant la perfusion sanguine sur des surfaces polymériques 11,12. Grade clinique conduits sanguins modifiés avec recCD47 montrent nettement moins plaquettaire et la fixation des cellules inflammatoires par comparaison à des polymères non modifiés lors d'une exposition à du sang humain dans le dispositif. Une description étape par étape de ce processus de modification est détaillée ci-dessous.
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Protocol
1. Modification des polymères surfaces avec recCD47
REMARQUE:. Le protocole est résumé schématiquement à la figure 1 Figure 1A illustre la génération de surfaces polymères réagissant avec un thiol Figure 1B illustre génération de thiol-réactive recCD47..
- Jour 1
- Préparer une solution de PDT-BzPh (1 mg / ml) et du bicarbonate de potassium (KHCO 3) (0,7 mg / ml) dans de l'eau stérile. Agiter pendant une nuit à 4 ° C (abri de la lumière).
- Jour 2
- Couper tube polymère en 40 cm de long morceaux (assez longtemps pour s'adapter autour de rotation des roues).
- Faire tremper les tubes dans une solution aqueuse à 0,1% de hexacylpyridinium pendant 90 min à température ambiante sur un agitateur ou en boucle Dispositif Chandler. Rincer les tubes avec 3x d'eau stérile après 90 minutes de trempage.
- Acidifier la solution de la PDT-BzPh du jour 1 en ajoutant 15% de potassium aqueux phosphate monosodique (KH 2 4). Ajouter 50 ul KH 2 PO 4 par ml de PDT-BzPh, formant une solution micellaire nuageux.
- Faire tremper les tubes dans la solution PDT-BzPh acidifiée pendant 40 min à température ambiante sur un agitateur ou sur un appareil.
- Rincer les tubes avec de l'acide acétique dilué (1: 1000) une fois.
- Exposer les tubes à rayons UV pour une durée totale de 60 minutes. Tournez tubes ¼ de tour toutes les 15 min pour irradier la totalité de la surface.
- Tremper les tubes dans une solution de 20 mg / ml de bicarbonate de potassium (KHCO 3) pendant 20 min à température ambiante sur un agitateur ou sur un appareil.
- Rincer les tubes avec 3x de l'eau stérile et conserver à 4 ° C dans de l'eau stérile.
- Jour 3
- Dissolvez 5 mg sulfo-SMCC dans 200 ul diméthylformamide (DMF) (Attention: Effectuez en hotte).
- Ajouter 50 ul de la solution de sulfo-SMCC préparée à l'étape 1 à 0,1 mg / ml de solution de poly-lysine recCD47, et remuer pendant 60 min à rotempérature om.
- Pendant 60 min remuer, dégazer stérile saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) et mettre de côté.
- Purifier sulfo-SMCC a réagi recCD47 en utilisant une colonne de dessalage 7K de poids moléculaire de coupure de spin selon les instructions du fabricant. Recueillir finale écoulement (thiol-réactive de grande qualité recCD47) et diluer à un volume nécessaire pour revêtir l'intérieur du tube avec du DPBS.
- Rincer les tubes du jour 2 avec stérile, dégazée DPBS 3x.
- Réagir la surface modifiée des tubes avec une solution de 20 mg / ml de tris (2-carboxyéthyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) dans du DPBS dégazés pendant moins de 2 minutes. Rincer les tubes avec stérile dégazé DPBS 4x.
- Ajouter le recCD47 Sulfo-SMCC-réagi dans les tubes et laisser incuber pendant une nuit à 4 ° C sur un agitateur ou sur un appareil.
2 immunologique de quantification sur des surfaces modifiées recCD47
- Rincer tubes modifiés pour être quantifié à partir de 3 jours d'esprith DPBS 3x. tubes de magasins pas utilisées pour la quantification dans DPBS à 4 ° C.
- Utilisez une biopsie poinçon de 4 mm pour réaliser des échantillons de tubes en double et placer pinces à biopsie dans les puits d'une plaque de 96 puits.
- Préparer un contrôle négatif constitué par un échantillon de tube non modifié n'est pas traité avec l'anticorps de détection. Préparation d'un anticorps de contrôle constitué d'un échantillon de tube non modifié traité avec l'anticorps de détection. Préparation des échantillons d'essai de tubes modifiés traités avec l'anticorps de détection.
- Des échantillons de bloc avec 0,4% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du DPBS pendant 60 minutes à température ambiante sur un agitateur.
- Après blocage, aspirer BSA et rinçage avec une solution saline tamponnée au tris plus 1% (TBST) 3x-Tween 20, 10 minutes à chaque fois sur un agitateur.
- Préparer une dilution de travail de l'anticorps dans 0,4% de BSA selon la dilution recommandée par le fabricant pour les immunoessais. Diluer l'anticorps CD47 humain-FITC B6H12 1: 100 dans 0,4% de BSA.
- Ajouter 200 ul de dilution d'anticorps dans les puits appropriés. Incubatémoins négatifs TE avec 0,4% de BSA seulement. Incuber à température ambiante pendant 60 min sur un agitateur (abri de la lumière).
- Rincer avec du TBST 3x, 10 min chacun sur un agitateur. Aspirer le dernier TBST rinçage et ajouter 200 DPBS ul aux puits d'échantillons de tube.
- Recueillir le dernier flux continu, qui est un thiol réactif de qualité CD47 recombinant et diluer à un volume nécessaire pour revêtir l'intérieur des tubes avec du DPBS.
- Lire FITC intensité de signal en utilisant un lecteur de microplaques avec FITC excitation (485 nm) et d'émission (538 nm) paramètres.
- Calculer recCD47 lié à surface polymère sur la base de valeurs standards, ce qui représente pour l'auto-fluorescence et de la liaison non spécifique de l'échantillon de contrôle d'anticorps.
Protocole de Appareil 3. Chandler boucle
Cherchez Institutional Review Board (IRB) l'approbation d'un protocole de collecte de sang et éclairé documents de consentement avant le début de la collecte des échantillons de sang humain. Obtenir infosrmé consentement d'un donneur de sang humain.
REMARQUE: Un diagramme représentant le dispositif est représenté sur la figure 2.
- Remplir un bain d'eau avec de l'eau distillée jusqu'à environ 1/2 du diamètre des roues sont submergés. Ajouter suffisamment d'eau de Javel pour le bain d'eau pour obtenir une solution d'eau de Javel à 10%. Set bain d'eau à 37 ° C et laisser s'équilibrer à la température.
- Rassemblez adaptateurs métalliques (voir figure 1B), des tubes et des tuyaux non modifiée modifié, et assembler autour des roues de l'appareil, comme le montre la figure 1C. Assurez-vous que le tube est bien ajusté autour de la roue avec l'adaptateur métallique en place.
- Obtenir 30 ml d'échantillon de sang en utilisant un protocole approuvé par l'IRB, dans un flacon pré-rempli avec 2 ml de citrate ou un autre anticoagulant, et mélanger par inversion une fois pour empêcher la coagulation de l'échantillon a été collecté.
- Ajouter environ 10 ml de sang de chaque tube en utilisant la soupape de métal et d'une seringue, ce qui laisse un peu d'air dans le tube. Fixer le bouchon de la valve et rOtate pendant 3 heures.
- Drainer le sang dans un bécher de déchets traités avec une solution d'eau de Javel à 10% (ou tel que requis par la politique institutionnelle).
- Rincer délicatement l'intérieur du tube avec du DPBS pour éliminer toute trace de sang. Recueillir accréditives dans le bécher de déchets. Disposer de sang conformément à la politique institutionnelle.
- Désinfecter l'appareil et tout contact avec le sang des surfaces en utilisant une solution d'eau de Javel à 10% ou conformément à la politique institutionnelle.
- Traitement des échantillons pour la microscopie électronique à balayage ou microscopie à fluorescence comme décrit ci-dessous.
4. microscopie à fluorescence et Comptage des cellules
- Préparer un 4% de paraformaldéhyde (PFA) solution (Attention: Effectuez en hotte).
- Incuber les tubes dans une solution de PFA à 4% pendant une nuit à 4 ° C.
- Après une nuit d'incubation, retirer 4% PFA et rincer films très doucement avec du DPBS.
- Couper le tube en sections pour exposer la surface de lumière de coloration.
- Stainune section de la tubulure avec quelques gouttes de milieu de montage avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 30 min à température ambiante (abri de la lumière). Après coloration, rincer la tubulure très doucement avec du DPBS à réduire signal de DAPI de fond.
- L'image en utilisant un microscope à fluorescence équipé d'un filtre DAPI et un appareil photo numérique pour compter le nombre de cellules dans neuf champs de vue sélectionnés en aveugle sous un grossissement de 200X.
- cellule d'enregistrement compte par le champ de vision et d'effectuer des analyses statistiques appropriées pour déterminer la signification statistique des résultats.
5. microscopie électronique à balayage
- Préparer une solution de glutaraldéhyde à 2% (Attention: Effectuez en hotte).
- Incuber les tubes dans une solution de glutaraldéhyde à 2% pendant une nuit à 4 ° C.
- Après une nuit d'incubation, rincer délicatement le tube 3x avec du DPBS.
- Préparer une solution à 1% de tétroxyde d'osmium (Attention: Grave danger d'inhalation! Utiliser dans une hotte).
- Incuber les tubes dans une solution à 1% de tétroxyde d'osmium pendant 15 minutes à température ambiante.
- Rincer délicatement le tube 3x avec du DPBS.
- Préparer une série de concentrations d'éthanol (25%, 50%, 75%, 95% et 100% d'éthanol).
- Déshydrater la tubulure par une incubation dans la série de concentrations d'éthanol. Incuber à 25%, 50%, 75% et 95% d'éthanol pendant 20 min chacun. Incuber à 100% d'éthanol pendant 30 min.
- Point supercritique sécher le tube avec du CO 2 pendant 45 min pour éliminer toute trace d'humidité.
- Sections de tubes de montage sur un bout de l'échantillon avec de la pâte d'argent ou graphite.
- sections de tubes Coat avec 12,5 nm d'or-palladium.
- Examiner dans un microscope électronique à balayage.
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Representative Results
Génération de surfaces polymères réagissant avec un thiol par l'utilisation de la PDT et TCEP-BzPh avec un groupe thiol réactif recCD47 poly-lysine en utilisant SMCC permet la fixation de recCD47 à des surfaces polymères. Le processus de modification est résumé schématiquement sur la figure 1. L'avantage de ce procédé de modification est qu'elle peut être appliquée à de nombreuses protéines différentes et de nombreuses surfaces polymères différents, en supposant que la protéine peut être modifiée par des groupements chimiquement réactifs nécessaires tels que les lysines et contenant une amine que le polymère présente des hydrocarbures suffisamment disponibles.
Il a été démontré précédemment que recCD47 peut être ajouté à des surfaces polymères utilisant ce protocole 11-13. Comme le montre la figure 3A, la coloration importante du FITC est visible pour recCD47, en utilisant un anticorps conjugué au FITC pour le domaine de type Ig extracellulaire du CD47, qui est localisée spécifiquement à la pellicule comme indiqué par imagerie DIC(Figure 3B). Ces résultats démontrent que recCD47 peut être fixé de manière covalente à des films de polyuréthanne. Mesurer les unités de fluorescence et la comparaison avec une courbe standard déterminé la concentration de surface lié recCD47. Nous avons montré que recCD47 peut être ajouté à des surfaces polymères à des niveaux dépassant 500 ng / cm 2,11-13. Ces résultats confirment que ce polymère protocole de modification à base de thiol peut être utilisé pour ajouter des protéines recombinantes modifiées de poly-lysine à des surfaces polymères.
CD47 a été montré comme étant un marqueur de «soi», empêchant la fixation des cellules inflammatoires et l'activation du système immunitaire 7-13. Pour mimer les conditions in vivo aussi étroitement que possible dans un milieu ex vivo, du sang humain entier peut être perfusé à travers les tubes de polymère non modifié et modifié dans le dispositif de boucle de Chandler (représenté sur la figure 2). La fixation des cellules à la tubulure peut être évaluée par coloration DAPI (
Figure 1: Schéma de la modification de surface. A) des surfaces de polymères thiolées ont été générés par l'incubation de la surface polymère avec l'agent de réticulation photo-activable PDT-BzPh et la réduction subséquente avec PTCE. B) </ Strong> SMCC a été utilisé pour produire un groupe thiol réactif recCD47, qui a ensuite été mis à réagir avec la surface synthétique thiolé pour donner des surfaces fonctionnalisées recCD47.
Figure 2 Schéma de Chandler boucle Appareil. A) L'appareil est constitué d'un bain-marie chauffé à 37 ° C, les roues rotatives fixées sur un poteau de métal attaché à un moteur rotatif. Cette configuration permet au moteur de rotation pour faire tourner les roues, immergeant ainsi des parties de la tubulure dans le bain d'eau à 37 ° C et la perfusion de sang à travers le tube. B) adaptateurs de métal sont utilisés pour connecter les extrémités du tuyau formant une boucle autour de l'une des roues tournantes. Le sang est ajouté à des tubes à travers l'orifice de soupape en métal et coiffé par le capuchon de valve. C) Une fois assemblé, le tube de soupape et le métal doit s'ajuste parfaitement around la roue en rotation, comme montré ici avec un tube vide.
Figure 3 Quantification de recCD47 sur des films de polyuréthane. Les anticorps dirigés contre le domaine Ig externe de CD47 ont été utilisés pour quantifier la quantité de recCD47 lié à des films de polyuréthane. Des images prises au microscope à fluorescence sous un grossissement de 200X avec des filtres appropriés indiquant la détection de FITC de recCD47 annexée à polyuréthanne (A). Les images (B) montrent que le signal DIC FITC est spécifique à la couche de polyuréthane.
Figure 4 L'adhésion cellulaire à polyuréthane non modifiée et recCD47 modifié. Sang humain entier a été prélevé et perfusé sur non modifié ou modifié recCD47-Films PU pendant 3 heures. Après la perfusion de 3 heures, des films ont été rincées avec du DPBS et les cellules adhérentes ont été fixées avec 4% de PFA pendant une nuit à 4 ° C et DAPI colore pendant 30 min à température ambiante. Cellules DAPI-colorées ont été comptées en utilisant un microscope à fluorescence sous 200X et des filtres appropriés. (A) 9 champs choisis au hasard de vue ont été comptés pour chaque modification. (B) Les données sont représentatives de 9 champs de vision et est exprimé sous forme de moyenne ± erreur standard (p = 0,004).
Figure 5 Analyse de SEM recCD47 modifié et les surfaces de contrôle suivant l'analyse ex vivo. Sang humain entier a été prélevé et perfusé sur le tube de PVC non modifié ou recCD47 modifié pendant 3 heures. Des images représentatives montrent l'attachement cellulaire significative à unmodified surfaces tandis que les surfaces recCD47 modifiés montrent qu'une cellule joint occasionnel.
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Discussion
La chimie de photoactivation (résumé à la figure 1) permet la modification de pratiquement n'importe quelle surface du polymère qui a des hydrocarbures suffisantes pour faciliter PDT-BzPh fixation et l'irradiation UV subséquente de photo-activer la PDT-BzPh. La fonctionnalisation de la surface polymère avec des groupes thiol réactifs permet la fixation ultérieure de toute une série de molécules d'intérêt testables. Dans nos études particulières, nous avons choisi recombinant CD47 11-13. La chimie de conjugaison particulier que nous avons utilisé impliqués la réaction des groupes amine de la protéine avec la croix bifonctionnel linker CCSM 11-13. Cela a fourni un thiol réactif recCD47 pour la réaction ultérieure avec la surface polymère thiolé. Le produit final est une liaison mono-sulfure de liaison par covalence à la recCD47 le polymère. Pour faire en sorte que les groupes amine des acides aminés dans CD47 ne sont pas utilisés pour la réaction, et d'atténuer ainsi l'efficacitédu CD47 immobilisé, on en outre modifié par l'insertion, la recCD47 un tag poly-lysine à l'extrémité C-terminale de la protéine. Il serait possible qu'une stratégie moléculaire similaire peut être appliqué à d'autres protéines. Ainsi, la chimie de conjugaison présenté ici et d'ailleurs 11-13 offre une occasion importante d'évaluer la capacité des molécules potentiellement thérapeutiques à conférer biocompatibilité sur des surfaces synthétiques.
Un inconvénient de ce protocole est que l'exposition de certains types de polymères, tels que le polyuréthane, à de longues périodes d'irradiation UV peut provoquer une décoloration. Ceci peut être évité en plaçant le polymère dans des boîtes en polystyrène (couramment utilisé dans la culture de tissus) afin d'éviter une décoloration du polymère sans nuire à la photoactivation de la PDT-BzPh. La longueur d'onde de la lumière UV utilisée dans ce protocole est 302 nm; écart par rapport à cette longueur d'onde peut entraîner une inefficacité photo-activation de PDT-BzPh. Si l'on utilise une longueur d'onde différente dela lumière UV, l'optimisation du temps d'exposition aux UV est nécessaire pour assurer significatif photo-activation.
À la suite de ce protocole permet la fixation de recCD47 de surfaces polymères, dans le but d'évasion immunitaire et transporter état "libre" à la surface polymère pour empêcher la réaction de corps étranger. Quantification de la recCD47 annexée à la surface est effectué à l'aide d'un anticorps marqué au FITC pour le domaine Ig de CD47 en utilisant un dosage immunologique et la microscopie à fluorescence (Figure 3). Cette méthode pourrait être adaptée à d'autres protéines annexées à des surfaces polymères en supposant la disponibilité d'anticorps. Le défaut d'obtenir appendice important de recCD47 (ou une autre protéine) pourrait être due à une variété de facteurs, y compris, le défaut de photoactiver PDT-BzPh, hydrocarbures libres insuffisantes sur la surface du polymère, l'hydrophobie de la surface de polymère, ou le polymère pourrait être trop épais ou opaque pour permettre à la lumière de passer à travers pour quantific adéquateation. Toutes ces variables peuvent être expérimentalement testées et optimisées pour un polymère particulier.
L'Appareil Chandler Loop est un outil unique pour l'analyse ex vivo de l'exposition dans le sang total humain à des surfaces polymères. Ce système ressemble étroitement à la perfusion de sang à travers les conduits de sang cliniques utilisés dans diverses procédures médicales, ce qui permet l'analyse de plusieurs paramètres physiologiques associés à des surfaces de mise en contact du sang. Comme paramètres physiologiques de l'appendice de recCD47 de surfaces polymères, le nombre de cellules à l'aide de la coloration DAPI (figure 4) et la microscopie électronique à balayage (figure 5) ont été utilisés. D'autres paramètres peuvent également être utilisés, en fonction de la disponibilité des équipements, par exemple, le nombre de cellules avant et après la perfusion sanguine à travers les conduits sanguins polymères pourraient également être utilisés. Surfaces en soit, recCD47 modifié exposées de manière significative des cellules moins adhéré par rapport aux surfaces de contrôle non modifiés. Ces data suggèrent que recCD47 transmet biocompatibilité des surfaces polymères et pourrait être utilisé pour prévenir la FBR dans les procédures cliniques utilisant des conduits sanguins polymères.
Bien que ce soit un modèle largement utilisé dans des études in vitro de la perfusion de sang, il est limité à certains égards. Les deux principaux inconvénients de cette méthode résultent de la nécessité d'inscrire l'air dans le tube avec l'échantillon de sang. L'interaction de sang fréquent avec de l'air peut causer des leucocytes et l'agrégation plaquettaire et la dénaturation des protéines 16-18, ce qui peut interférer avec certains effets. D'autre part, le reste de l'air au niveau du point le plus haut du circuit, ce qui limite la vitesse de circulation du sang 19. En dépit des limitations apparentes de ce procédé, il provoque moins de dommages que les procédés concurrents sang 19 et sert comme un moyen de criblage de la biocompatibilité des biomolécules potentiels sur les conduits de sang polymères. Une fois biomolécules candidats sont identifiés parcette méthode, une analyse plus poussée peut être obtenue grâce à des modèles animaux in vivo. En fin de compte, la biocompatibilité des polymères modifiés doivent être confirmés au moyen d'un système approprié dans le modèle in vivo.
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Disclosures
Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l'Institut national d'imagerie biomédicale et bio-ingénierie, sous le numéro d'attribution R21 EB015612 (SJS) et le National Heart, Lung, and Blood Institute, sous le numéro d'attribution T32 HL007915 (JBS et RJL), de la National Institut de la santé.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
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