Abstract
A reacção de corpo estranho ocorre quando uma superfície sintética é introduzida no corpo. Caracteriza-se por adsorção de proteínas do sangue e a subsequente ligação e activação de plaquetas, monócitos / macrófagos de adesão, e os eventos de sinalização celular inflamatório, levando a complicações pós-procedimento. O Aparelho Chandler laço é um sistema experimental que permite aos investigadores a estudar as interacções celulares e moleculares que ocorrem quando grandes volumes de sangue são perfundidos sobre condutas poliméricos. Para esse efeito, o aparelho tem sido utilizado como um modelo ex vivo, permitindo que a avaliação das propriedades anti-inflamatórias de várias modificações da superfície do polímero. Nosso laboratório mostrou que condutas de sangue, covalentemente modificadas via química fotoativação com CD47 recombinante, pode conferir biocompatibilidade de superfícies poliméricas. Acrescentando CD47 para superfícies poliméricas pode ser um meio eficaz para promover a eficácia das condutas de sangue poliméricos. Seuein é a metodologia que detalha a química fotoativação usado para acrescentar CD47 recombinante para condutas de sangue poliméricos clinicamente relevantes e com o uso do laço Chandler como um modelo experimental ex vivo para examinar interações sangue com a CD47 modificado e controle de condutas.
Introduction
Muitos procedimentos clínicos, tais como a circulação extracorpórea e diálise renal, requerem o uso de condutos de sangue poliméricas e são frequentemente associados com complicações pós-procedimento 1. Quando perfundido com sangue, estes polímeros ilícito a reação de corpo estranho (FBR), resultando na adsorção de proteínas do sangue e plaquetas, a adesão de monócitos / macrófagos e liberação de citocinas pró-inflamatórias, o que contribui para complicações pós-procedimento e / ou 2,3 falha do dispositivo. Assim, estratégias para abordar esta questão continuar a ser uma área importante e contínuo de pesquisas em biomateriais. Os pesquisadores têm tentado resolver este problema modificando sangue entrar em contato com as superfícies com bioativos ou bio-inerte moléculas 4-6. A investigação no nosso laboratório tem-se centrado em acrescentando CD47 recombinante (recCD47) a biomateriais poliméricos como uma estratégia para mitigar o FBR e aumentar a eficácia destes materiais. CD47 é uma transmembr expressa ubiquamenteane proteína com um papel conhecido na evasão da resposta imune, conferindo status de "self" em cima de expressar as células 7-10 e mostra a promessa de conferir biocompatibilidade quando anexado a superfícies poliméricas 11-13. Sinal-alfa proteína reguladora (SIRPα), o receptor cognato para o CD47, e um membro do motivo inibidor de imunorreceptores baseado em tirosina (ITIM) molecular contendo família de proteínas transmembranares, é expresso em células de origem mielóide 14. Nós já anteriormente demonstrado que a CD47, por meio de sinalização celular mediada SIRPα, sub-regula as respostas imunitárias a de poliuretano (PU) e de cloreto de polivinilo (PVC) em in vitro, ex vivo e in vivo em modelos de 11-13.
Central de nossas investigações é uma relativamente nova química fotoactivação, aqui descrito, em que os grupos tiol reactivos quimicamente são covalentemente anexado ao tubo polimérico fazendo reagir o tubo com um polímero multifuncional (PDT-BzPh), composto de 2-piridilditio (PDT), a benzofenona fotoreactivo (BzPh) e uma polialilamina modificado por carboxi 11-13. A redução dos grupos PDT covalentemente anexas com tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) 11 produz uma superfície que pode ser tiolado subsequentemente reagido com porções terapêuticas. Aqui e anteriormente detalhada 12,13, recCD47, adicionalmente modificado com a adição de uma cauda poli-lisina C-terminal de 12,13, é feito reagir com sulfossuccinimidil-4-[N -maleimidomethyl] ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) durante 1 h para gerar grupos tiol-reactivo, que permite a formação da ligação entre o tubo monossulfureto e recCD47 11. A capacidade anti-inflamatória das superfícies funcionalizadas CD47 foi testado, ex viv o, utilizando o Aparelho de Chandler loop com sangue humano total, que foi inicialmente descrita em 1958 como um modelo in vitro da coagulação trombótica 15. O aparelho baseia-se numasistema de tubos fechado parcialmente cheio com ar e um motor rotativo para fazer circular o sangue através da tubagem 15. Este modelo experimental, proporciona a oportunidade de estudar o efeito da exposição a sangue sobre superfícies modificadas e não modificadas, bem como o efeito destas modificações de superfície sobre a fisiologia das células do sangue.
recCD47 pode ser anexado a uma variedade de superfícies de polímeros, utilizando química de fotoactivação este, e a sua capacidade anti-inflamatória pode ser avaliada utilizando um modelo clinicamente relevante ex vivo imitando perfusão do sangue sobre as superfícies poliméricas 11,12. Condutas de sangue grau clínico modificados com recCD47 mostram significativamente menos de plaquetas e ligação de células inflamatórias, em comparação com os polímeros não modificados quando expostos a sangue humano no dispositivo. Uma descrição passo-a-passo do presente processo de modificação é detalhado abaixo.
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Protocol
1. Modificando poliméricos Superfícies com recCD47
NOTA:. O protocolo é resumido esquematicamente na Figura 1 A Figura 1A ilustra a geração de superfícies poliméricas tiol-reactivo Figura 1B ilustra a geração de recCD47 reactivo com tiol..
- Dia 1
- Prepara-se uma solução de PDT-BzPh (1 mg / ml) e bicarbonato de potássio (KHCO3) (0,7 mg / ml) em água estéril. Agita-se durante a noite a 4 ° C (protegido da luz).
- Dia 2
- Cortar tubo polimérico em 40 centímetros de comprimento (o tempo suficiente para caber em torno de rodas rotativas).
- Soak tubos em uma solução aquosa a 0,1% de hexacylpyridinium durante 90 minutos à temperatura ambiente num agitador ou em loop Aparelho Chandler. Lavar os tubos com 3x de água estéril após a 90 min de molho.
- Acidifica-se a solução de PDT-BzPh do Dia 1 por adição de 15% de potássio monobásico aquoso (KH 2 4). Adicionar 50 ul de KH 2 PO 4 por ml de PDT-BzPh, formando uma solução micelar turvo.
- Embeber os tubos na solução PDT-BzPh acidificada durante 40 minutos à temperatura ambiente num agitador ou no aparelho.
- Lavar os tubos com ácido acético diluído (1: 1000), uma vez.
- Expor os tubos a irradiação UV durante um período total de 60 minutos. Gire tubos de ¼ de volta a cada 15 min para irradiar toda a superfície.
- Embeber os tubos com uma solução de 20 mg / ml de bicarbonato de potássio (KHCO3), durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador ou no aparelho.
- Lavar os tubos com 3x de água estéril e armazenar a 4 ° C em água estéril.
- Dia 3
- Dissolver 5 mg Sulfo- SMCC em 200 mL dimetilformamida (DMF) (Atenção: Realize em hotte).
- Adicionar 50 ul da solução de Sulfo-SMCC, preparado no passo 1 a 0,1 mg / ml de solução de poli-lisina recCD47, e agita-se durante 60 min a rotemperatura om.
- Durante 60 min de agitação, degas estéril Tampão fosfato de Dulbecco (DPBS) e reserve.
- Purificar Sulfo- SMCC reagiu recCD47 usando um corte de coluna de dessalinização rotação 7K peso molecular por instruções do fabricante. Recolha de escoamento final (de alta qualidade tiol-reactivo recCD47) e diluir até ao volume necessário para revestir o interior do tubo com DPBS.
- Lavar os tubos a partir do dia 2 com estéril, desgaseificadas DPBS 3x.
- Reagir a superfície modificada dos tubos com uma solução de 20 mg / ml com tampão de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) em DPBS desgaseificados durante menos de 2 minutos. Lavar os tubos com estéril desgaseificadas DPBS 4x.
- Adicionar o recCD47 Sulfo-SMCC-reagido para os tubos e incubar durante a noite a 4 ° C num agitador ou em aparelhos.
2 Imuno Quantificação de recCD47 em Superfícies Modificadas
- Lavar tubos adaptados para ser quantificado a partir do dia 3 sagacidadeh DPBS 3x. Tubos loja não utilizado para a quantificação em DPBS a 4 ° C.
- Use uma biópsia por punção de 4 mm a fazer duplicados de amostras de tubo e colocar punções em poços de uma placa de 96 poços.
- Preparar um controle negativo constituído por um tubo de amostra não modificada não tratados com o anticorpo de detecção. Preparar um anticorpo de controlo que consiste de um tubo de amostra não modificada tratados com o anticorpo de detecção. Preparar as amostras para ensaio de tubagem modificados tratados com o anticorpo de detecção.
- Amostras do bloco com 0,4% de albumina de soro bovino (BSA) em DPBS durante 60 minutos à temperatura ambiente num agitador.
- Após o bloqueio, aspirado BSA e enxágüe com Tris salina acrescida de 1% (TBST) 3x-20 Tween, 10 min cada um em uma coqueteleira.
- Prepara-se uma diluição de trabalho de anticorpo em 0,4% de BSA de acordo com a diluição recomendada pelo fabricante para os imunoensaios. Diluir anticorpo CD47 humano B6H12-FITC a 1: 100 em 0,4% de BSA.
- Adicionar 200 ul da diluição do anticorpo aos poços apropriados. Incubacontrolos negativos te com 0,4% de BSA. Incubar à temperatura ambiente durante 60 min, num agitador (proteger da luz).
- Enxaguar com TBST 3x, 10 min cada um em uma coqueteleira. Aspirar o último enxágüe TBST e adicionar 200 DPBS ul para poços de amostra do tubo.
- Recolhe-se o fluxo de passagem final, que é de alta qualidade tiol reactivos CD47 recombinante e diluir até ao volume necessário para revestir o interior dos tubos com DPBS.
- Leia intensidade do sinal FITC utilizando um leitor de microplacas com FITC excitação (485 nm) e emissão (538 nm) configurações.
- Calcular recCD47 ligado à superfície polimérica com base em valores de referência, correspondendo a autofluorescência e ligação não específica a partir da amostra de controlo sem anticorpo.
3. Chandler Circuito Aparelho Protocolo
Procure Institutional Review Board (IRB) aprovação do protocolo de coleta de sangue e informado consentimento papelada antes do início da recolha de amostras de sangue humano. Obter informaçõesconfirmada através consentimento de um doador de sangue humano.
NOTA: Um diagrama que representa o aparelho é mostrado na Figura 2.
- Encha banho de água com água destilada até aproximadamente 1/2 do diâmetro das rodas estão submersas. Adicionar branqueador suficiente para o banho de água para fazer uma solução de lixívia a 10%. Definir banho de água a 37 ° C e deixar equilibrar à temperatura.
- Reunir placas de metal (mostrados na Figura 1B), tubos não modificada e modificada tubagem, e montar em torno de rodas de aparelhos, como mostrado na Figura 1C. Certifique-se de que os tubos se encaixa confortavelmente em torno da roda com a placa de metal no local.
- Obter 30 ml de amostra de sangue utilizando um protocolo IRB-aprovado, em um frasco pré-cheio com 2 ml de citrato ou outro anticoagulante, e misturar por inversão para evitar a coagulação, uma vez que a amostra tenha sido recolhida.
- Adicionar cerca de 10 ml de sangue para cada tubo, utilizando a válvula e uma seringa de metal, deixando um pouco de ar no tubo. Fixe a tampa da válvula e rotate durante 3 horas.
- Drenar o sangue em um copo de resíduos tratados com uma solução de água sanitária a 10% (ou conforme exigido pela política institucional).
- Gentilmente lavar interior tubulação com DPBS para remover todos os vestígios de sangue. Recolha de escoamento no copo de resíduos. Descarte de sangue em conformidade com a política institucional.
- Desinfectar o aparelho e qualquer contato com sangue superfícies usando uma solução de água sanitária a 10% ou de acordo com a política institucional.
- Amostras de processo para a microscopia eletrônica de varredura ou microscópio fluorescente, conforme descrito abaixo.
4. Microscopia fluorescente e contando celular
- Prepare uma solução de paraformaldeído 4% (PFA) (Atenção: Realize em hotte).
- Incubar tubagem numa solução PFA a 4% durante a noite a 4 ° C.
- Após incubação durante a noite, retire PFA 4% e enxaguar filmes muito suavemente com DPBS.
- Corte o tubo em seções para expor a superfície do lúmen para a coloração.
- Stainuma secção do tubo com algumas gotas de meios de montagem com o 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), durante 30 min à temperatura ambiente (proteger da luz). Após a coloração, lavar a tubulação muito suavemente com DPBS para reduzir o sinal DAPI fundo.
- Imagem usando um microscópio de fluorescência equipado com um filtro de DAPI e câmara digital para contar o número de células em 9 campos cegamente seleccionados de vista sob uma ampliação de 200X.
- Célula registro contagens por campo de visão e realizar análises estatísticas apropriadas para determinar a significância estatística dos resultados.
5. Microscopia Eletrônica de Varredura
- Prepare uma solução de glutaraldeído 2% (Atenção: Realize em hotte).
- Incubar tubagem numa solução de glutaraldeído a 2% durante a noite a 4 ° C.
- Após incubação durante a noite, lavar cuidadosamente o tubo de 3x com DPBS.
- Prepare uma solução de 1% de tetróxido de ósmio (Cuidado: perigo de inalação grave! Use em hotte).
- Incubar a tubagem para uma solução a 1% de tetróxido de ósmio durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Lave o tubo de 3x com DPBS.
- Prepara-se uma série de concentrações de etanol (25%, 50%, 75%, 95%, e 100% de etanol).
- Desidratar a tubagem por incubação em série de concentrações de etanol. Incubar em 25%, 50%, 75%, e etanol a 95% durante 20 min cada. Incubar em etanol a 100% durante 30 min.
- Ponto supercrítico secar a tubulação com CO 2 por 45 min para remover toda a umidade.
- Secções tubulares montar em um esboço espécime com pasta de prata ou grafite.
- Secções tubulares de revestimento com 12,5 nm de ouro-paládio.
- Analisar em um microscópio eletrônico de varredura.
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Representative Results
Gerando superfícies poliméricas tiol-reactivo por meio do uso de PDT-BzPh e TCEP juntamente com tiol-reactivo recCD47 poli-lisina usando SMCC permite a fixação de recCD47 a superfícies poliméricas. O processo de modificação é resumida esquematicamente na Figura 1. A conveniência deste processo de modificação é que ele pode ser aplicado a muitas proteínas diferentes e as diversas superfícies poliméricas diferentes, assumindo que a proteína pode ser modificado com grupos quimicamente reactivos, tais como suficientes lisinas contendo amina e que o polímero possui suficientemente hidrocarbonetos disponíveis.
Foi demonstrado anteriormente que recCD47 pode ser anexado a superfícies poliméricas, utilizando este protocolo de 11-13. Como mostrado na Figura 3A, a coloração FITC significativa é visível para recCD47, usando um anticorpo conjugado com FITC para o domínio Ig extracelular de CD47, que está localizada especificamente para a película, como mostrado por DIC imagiologia(Figura 3B). Estes resultados demonstram que recCD47 pode ser covalentemente ligado a películas de poliuretano. Medindo as unidades fluorescentes e comparação com uma curva padrão determinada a concentração de superfície ligado recCD47. Nós mostramos que recCD47 pode ser anexado a superfícies poliméricas em teores superiores a 500 ng / cm 2,11-13. Estes resultados confirmam que este protocolo de modificação de polímeros à base de tiol pode ser usado para acrescentar proteínas recombinantes modificados com poli-lisina para superfícies poliméricas.
CD47 tem sido demonstrado ser um marcador de "auto", impedindo a ligação de células inflamatórias e de activação do sistema imunitário 7-13. Para imitar as condições in vivo, tanto quanto possível num ambiente ex vivo de sangue humano total pode ser perfundida através de tubagem polimérica não modificada e modificada no Aparelho Chandler Loop (mostrado na Figura 2). A adesão celular à tubulação pode ser avaliada através de coloração DAPI (
Figura 1 Diagrama esquemático de modificação de superfície. A) superfícies de polímeros tiolado foram geradas por incubação da superfície polimérica com o agente de reticulação fotoactivável PDT-BzPh e redução subsequente com TCEP. B) </ Forte> SMCC foi usada para produzir tiol-reactivo recCD47, o qual foi depois feito reagir com a superfície sintética tiolada, para se obter recCD47 superfícies funcionalizadas.
Figura 2 Diagrama de Chandler Circuito Aparelho. A) O aparelho é constituído por um banho de água aquecida a 37 ° C, as rodas giratórias fixas sobre um poste de metal ligada a um motor rotativo. Esta configuração permite que o motor rotativo, para rodar as rodas, submergindo assim as porções de tubos no banho de água a 37 ° C e a perfusão de sangue através da tubagem. B) placas de metal são usados para ligar as extremidades dos tubos que formam um circuito em torno de uma das rodas rotativas. O sangue é adicionada aos tubos, através do orifício de passagem de metal e coberto com a tampa da válvula. C) Uma vez montada, a válvula de tubo de metal e deve estar apertado around a roda girando, como mostrado aqui com um tubo vazio.
Figura 3 Quantização da recCD47 em filmes de poliuretano. Os anticorpos dirigidos contra o domínio externo de Ig de CD47 foram utilizados para quantificar a quantidade de recCD47 ligado a películas de poliuretano. Imagens de microscopia fluorescente tomada sob aumento de 200X com filtros adequados mostrando detecção FITC de recCD47 anexado ao poliuretano (A). Imagens (B) mostram que a DIC sinal FITC é específico para o filme de poliuretano.
Figura 4 adesão celular de poliuretano modificado e recCD47 modificado. O sangue humano total foram recolhidos e perfundido sobre não modificado ou modificado recCD47Filmes de PU para 3 horas. Após a perfusão de 3 horas, as películas foram lavadas com DPBS e as células aderentes foram fixadas com PFA a 4% durante a noite a 4 ° C e DAPI coradas durante 30 min à temperatura ambiente. Células DAPI corados foram contadas utilizando um microscópio de fluorescência sob aumento de 200X e filtros adequados. (A) 9 campos selecionados aleatoriamente de vista foram contados para cada modificação. (B) Os dados são representativos de nove campos de visão, e é expressa como a média ± erro padrão (p = 0,004).
Figura 5 análise de SEM recCD47 modificado e superfícies de controle seguinte ex vivo análise. O sangue humano total foram recolhidos e perfundido sobre os tubos de PVC não modificado ou modificado recCD47 durante 3 horas. Imagens representativas mostram a ligação de células significativa para unmodified superfícies enquanto superfícies recCD47 modificados mostram apenas uma célula ligada ocasional.
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Discussion
A química fotoativação (resumidos na Figura 1) permite a modificação de praticamente qualquer superfície de polímero que tem hidrocarbonetos suficientes para facilitar PDT-BzPh apego e irradiação UV subseqüente ao photo-ativar o PDT-BzPh. Funcionalização da superfície polimérica com grupos tiol reactivos permite a subsequente ligação de uma série de moléculas de interesse testáveis. Em nossos estudos específicos que escolhemos recombinante CD47 11-13. A conjugação química particular que utilizado envolvia a reacção de grupos amina da proteína com o agente de reticulação bifuncional SMCC 11-13. Isto proporcionou recCD47 tiol reactivo para a reacção subsequente com a superfície polimérica tiolado. O produto final era uma ligação de mono-sulfureto de se ligar covalentemente a recCD47 para o polímero. Para ajudar a assegurar que não estavam a ser usados os grupos de amina a partir dos aminoácidos de CD47 para a reacção, e diminuindo assim a eficáciado CD47 imobilizados, que adicionalmente modificado através da inserção do recCD47 uma etiqueta de poli-lisina na proteína de C-terminal. Seria possível que uma estratégia molecular semelhante pode ser aplicado a outras proteínas. Assim, a conjugação química apresentada aqui e em outros lugares 11-13 proporciona uma oportunidade importante para avaliar a capacidade de moléculas potencialmente terapêuticas para conferir biocompatibilidade sobre superfícies sintéticas.
A desvantagem para este protocolo é que a exposição de certos tipos de polímeros, tais como o poliuretano, a longos períodos de irradiação UV pode provocar a descoloração. Isto pode ser evitado através da colocação do polímero em pratos de poliestireno (vulgarmente utilizados na cultura de tecidos), para evitar a descoloração do polímero, sem prejudicar a fotoactivação do PDT-BzPh. O comprimento de onda da luz UV utilizada neste protocolo é 302 nm; desvio deste comprimento de onda pode resultar em foto-ativação ineficiente do PDT-BzPh. Se estiver usando um comprimento de onda diferente deLuz UV, otimização do tempo de exposição UV é necessário assegurar foto-ativação significativa.
Seguindo este protocolo permite a fixação de recCD47 a superfícies poliméricas, com a finalidade de evasão imune e transmitindo estado "auto" para a superfície polimérica para impedir a reacção de corpo estranho. Quantificação da recCD47 anexado à superfície é completada utilizando um anticorpo marcado com FITC para o domínio de Ig de CD47 usando um imunoensaio e microscopia de fluorescência (Figura 3). Esta metodologia poderia ser adaptada para outras proteínas anexas às superfícies poliméricas assumindo disponibilidade de anticorpos. A falha em obter apêndice significativa de recCD47 (ou outra proteína) pode ser devido a uma variedade de fatores, incluindo, insuficiência de fotoactivar PDT-BzPh, hidrocarbonetos livres suficientes sobre a superfície do polímero, a hidrofobicidade da superfície do polímero, ou o polímero pode ser demasiado espessa ou opaco para permitir que a luz passe através de Quantific adequadação. Todas estas variáveis podem ser testados experimentalmente e optimizadas para um determinado polímero.
O Aparelho Chandler Laço é uma ferramenta única para a análise ex vivo da exposição todo o sangue humano para superfícies poliméricas. Este sistema se assemelha a perfusão de sangue através de condutas de sangue clínicos utilizados em vários procedimentos médicos, permitindo a análise de muitos terminais fisiológicas associadas com superfícies de contacto do sangue. Como os resultados fisiológicos para o apêndice de recCD47 a superfícies poliméricas, foram usadas as contagens de células utilizando DAPI (Figura 4) e de microscopia electrónica de varrimento (Figura 5). Outros terminais podem também ser usados, dependendo da disponibilidade de equipamento, por exemplo, a contagem de células antes e após a perfusão de sangue através de condutas de sangue poliméricos podem também ser utilizados. Independentemente superfícies, recCD47 modificados exibiram significativamente menos células aderidas em relação às superfícies de controlo não modificados. Estes data sugerem que transmite recCD47 biocompatibilidade a superfícies poliméricas e poderia potencialmente ser usada para impedir a FBR em procedimentos clínicos utilizando condutas de sangue poliméricos.
Embora esta seja amplamente utilizado um modelo in vitro para estudos de perfusão de sangue, que é limitada, em alguns aspectos. As duas principais desvantagens deste método surgem a partir do requisito de inclusão de ar no tubo, com a amostra de sangue. A interação freqüente com sangue do ar pode causar leucócitos e agregação plaquetária e desnaturação de proteínas 16-18, o que pode interferir com determinados parâmetros. Em segundo lugar, o ar permanece no ponto mais alto do circuito, o que limita a velocidade de circulação do sangue 19. Apesar dos aparentes limitações deste método, induz menos danos no sangue do que os métodos concorrentes 19 e serve como meio de rastreio a biocompatibilidade de potenciais biomoléculas em condutas de sangue poliméricos. Uma vez que as biomoléculas candidatos são identificados atravésNeste método, uma análise mais aprofundada pode ser obtido através de modelos animais in vivo. Em última análise, a biocompatibilidade dos polímeros modificados deve ser confirmado usando um adequado sistema de modelo in vivo.
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Disclosures
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia, sob o número prêmio R21 EB015612 (SJS), e do National Heart, Lung, and Blood Institute, sob o número prêmio T32 HL007915 (JBS e RJL), da National Institute of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
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