Abstract
Den främmande kroppsreaktion sker när en syntetisk yta införes i kroppen. Den kännetecknas av adsorption av blodproteiner och den efterföljande fastsättning och aktivering av blodplättar, monocyt / makrofag-vidhäftning, och inflammatoriska cellsignaleringshändelser som leder till post-behandlingskomplikationer. Den Chandler Loop Apparatus är en experimentell system som tillåter forskare att studera de molekylära och cellulära interaktioner som sker när stora mängder blod perfusion över polymera ledningar. För detta ändamål har denna apparat använts som en ex vivo-modell för att möjliggöra bedömning av de anti-inflammatoriska egenskaperna hos olika polymer ytmodifieringar. Vårt laboratorium har visat att blod ledningar, kovalent modifierade via fotokemi med rekombinant CD47 kan ge biokompatibilitet till polymera ytor. Lägga CD47 till polymera ytor kan vara ett effektivt medel för att främja effektiviteten av polymera blod ledningar. Hennesein är den metod med uppgifter om fotokemi används för att lägga rekombinant CD47 till kliniskt relevanta polymera blod ledningar och användning av Chandler Loop som en ex vivo experimentell modell för att undersöka blod interaktioner med CD47 modifierats och kontroll ledningar.
Introduction
Många kliniska procedurer, till exempel hjärt-bypass och njurdialys, kräver användning av polymera blod ledningar och är ofta förknippade med post-behandlingskomplikationer 1. När perfuserades med blod, är dessa polymerer illicit den främmande kroppsreaktion (FBR), vilket resulterar i adsorption av blodproteiner och blodplättar, monocyt / makrofag-vidhäftning och frisättning av proinflammatoriska cytokiner, som alla bidrar till post-behandlingskomplikationer och / eller enhet misslyckande 2,3. Således strategier för att hantera denna fråga är fortfarande en viktig och fortlöpande område biomaterialforskning. Utredarna har försökt att lösa denna fråga genom att ändra blodkontaktytor med bioaktiva eller bioinert molekyler 4-6. Forskning i vårt laboratorium har fokuserat på att lägga rekombinant CD47 (recCD47) till polymera biomaterial som en strategi för att mildra FBR och öka effekten av dessa material. CD47 är en ubiquitously uttryckt transmembrane protein med en känd roll i immun skatteflykt, ger "själv" status vid uttryckande celler 7-10 och visar löfte till ge biokompatibilitet då bifogas polymera ytor 11-13. Signal-reglerande protein alpha (SIRPα), den besläktade receptorn för CD47, och en medlem av immunoreceptor tyrosin baserade hämmande motiv (ITIM) -innehållande familj av transmembranproteiner, uttrycks på celler av myeloid ursprung 14. Vi har tidigare visat att CD47, via SIRPα-medierad cellsignalering, nedreglerar immunsvaren på polyuretan (PU) och polyvinylklorid (PVC) i in vitro, ex vivo och in vivo-modeller från 11 till 13.
Centralt för våra undersökningar är en relativt ny fotokemi, som beskrivs här, där kemiskt reaktiva tiolgrupper kovalent bifogas polymera slang genom omsättning av rör med en multifunktionell polymer (PDT-BzPh), bestående av 2-pyridylditio (PDT), den fotoreaktiva bensofenon (BzPh) och en kar-modifierat polyallylamin 11-13. Att minska de kovalent bifogade PDT grupper med tris (2-karboxietyl) fosfin hydroklorid (TCEP) 11 ger en tiolerad yta som kan vara senare reagerade med terapeutiska grupper. Detaljerad häri och tidigare 12,13, recCD47, ytterligare modifierad med tillägg av en C-terminal poly-lysin svans 12,13, reageras med Sulfosuccinimidyl-4-[N maleimidometyl] cyklohexan-1-karboxylat (sulfo-SMCC) under 1 h för att alstra tiolreaktiva grupper, vilket möjliggör en monosulfid bindningsbildning mellan slangen och recCD47 11. Den antiinflammatoriska kapaciteten hos CD47 funktion ytorna testades, ex viv o, med hjälp av Chandler Loop Apparater med humant helblod, som ursprungligen beskrevs 1958 som en modell för trombotisk koagulering 15 in vitro. Apparaten bygger på enSystemet slutna röret delvis fylld med luft och en rotationsmotor för att cirkulera blodet genom slangen 15. Denna försöksmodell ger möjlighet att undersöka effekten av blodexponering på modifierade och omodifierade ytor samt effekten av dessa ytmodifieringar på fysiologi celler i blodet.
recCD47 kan läggas till en mängd olika polymera ytor med hjälp av denna fotokemi och dess anti-inflammatoriska kapacitet kan bedömas genom att använda ett kliniskt relevant ex vivo-modell härma blödning över polymera ytor 11,12. Klinisk kvalitet blodledningarna modifierade med recCD47 visar signifikant lägre trombocyt och inflammatorisk cellvidhäftning jämfört med omodifierade polymerer när de exponeras för humanblod i anordningen. En steg-för-steg-beskrivning av denna modifiering process beskrivs nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Modifiera Polymera Ytor med recCD47
OBS:. Protokollet sammanfattas schematiskt i Figur 1 Figur 1A illustrerar generation tiolreaktiva polymera ytor Figur 1B illustrerar generation tiolreaktiv recCD47..
- Dag 1
- Bered en lösning av PDT-BzPh (1 mg / ml) och kaliumbikarbonat (KHCO3) (0,7 mg / ml) i sterilt vatten. Rör om över natten vid 4 ° C (ljuskänsligt).
- Dag 2
- Skär polymera slangen i 40 cm långa bitar (tillräckligt länge för att passa runt roterande hjul).
- Blöt rören i en 0,1% vattenlösning av hexacylpyridinium för 90 min vid rumstemperatur på en skakapparat eller på Chandler Loop Apparatus. Skölj rören med sterilt vatten 3x efter 90 min blöt.
- Surgör lösningen av PDT-BzPh från dag 1 genom tillsats av 15% vattenlösning av kaliumfosfat monobasisk (KH 2 4). Tillsätt 50 l KH 2 PO 4 per ml PDT-BzPh, bildar en grumlig micellösning.
- Blöt rören i den surgjorda PDT-BzPh lösning för 40 min vid rumstemperatur på en skakapparat eller på apparaten.
- Skölj tuberna med utspädd ättiksyra (1: 1000) en gång.
- Exponera rören till UV-bestrålning under sammanlagt minst 60 min. Rotera rören ¼ varv var 15 min för att bestråla hela ytarean.
- Blöt rören i en lösning av 20 mg / ml kaliumbikarbonat (KHCO3) i 20 minuter vid rumstemperatur på en skakapparat eller på apparaten.
- Skölj tuberna med sterilt vatten 3x och förvara vid 4 ° C i sterilt vatten.
- Dag 3
- Lös upp 5 mg Sulfo-SMCC i 200 | il dimetylformamid (DMF) (Varning: Utför i dragskåp).
- Lägg 50 | il av Sulfo-SMCC-lösning framställd i steg 1 till 0,1 mg / ml av recCD47 polylysin lösningen och rör om under 60 min vid roOM temperatur.
- Under 60 min rör om, degas sterila Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) och ställ åt sidan.
- Rena Sulfo-SMCC reagerade recCD47 använder en 7K molekylvikt cut-off spin avsaltningskolonn enligt tillverkarens instruktioner. Samla slutlig genomströmning (högkvalitativ tiolreaktivt recCD47) och späd till en volym som behövs för att belägga det inre av röret med DPBS.
- Skölj rören från dag 2 med steril, avgasas DPBS 3x.
- Reagera den modifierade ytan av rören med en lösning av 20 mg / ml med tris (2-karboxietyl) fosfin hydroklorid (TCEP) i avgasad DPBS för mindre än 2 min. Skölj rören med sterilt avgas DPBS 4x.
- Till Sulfo-SMCC-reagerade recCD47 till rören och inkubera över natten vid 4 ° C på en skakapparat eller på apparaten.
2. Immun Kvantifiering av recCD47 på modifierade ytor
- Skölj modifierade rör kvantifieras från Dag 3 with DPBS 3x. Förvara rören inte används för kvantifiering i DPBS vid 4 ° C.
- Använd en 4 mm biopsistans att göra dubbla slangprov och placera biopsi slag i brunnar i en 96-brunnar.
- Bered en negativ kontroll bestående av en omodifierad provrör som inte behandlats med detektionsantikropp. Bered en antikroppskontroll bestående av en omodifierad provrör behandlades med detektionsantikropp. Förbered de modifierade slang proverna behandlade med detektionsantikroppen.
- Blockera prov med 0,4% bovint serumalbumin (BSA) i DPBS för 60 min vid rumstemperatur på en skak.
- Efter blockering, aspirera BSA och skölj med Tris-buffrad saltlösning plus 1% Tween-20 (TBST) 3x, 10 min vardera på en skakapparat.
- Bered en arbetsutspädning av antikropp i 0,4% BSA enligt tillverkarens rekommenderade utspädning för immun. Späd humant CD47 Antibody B6H12-FITC 1: 100 i 0,4% BSA.
- Tillsätt 200 l av utspädnings antikropp till lämpliga brunnar. Incubate negativa kontroller med endast 0,4% BSA. Inkubera vid rumstemperatur i 60 minuter på en shaker (ljuskänsligt).
- Skölj med TBST 3x, 10 min vardera på en skakapparat. Sug sista TBST skölj och tillsätt 200 | il DPBS till röret provbrunnar.
- Samla den slutliga genomströmning, som är av hög kvalitet tiolreaktivt rekombinant CD47 och späd till en volym som behövs för att belägga det inre av rören med DPBS.
- Läs FITC signalstyrkan med hjälp av en mikroplattläsare med FITC excitation (485 nm) och utsläpp (538 nm) inställningar.
- Beräkna recCD47 bundet till polymerytan baserad på standardvärden, som står för auto-fluorescens och icke-specifik bindning från provet antikroppskontroll.
3. Chandler Loop Apparat protokoll
Seek Institutional Review Board (IRB) godkännande av blodinsamling protokoll och informerat samtycke pappersarbete innan behandlingen med insamling av blodprover mänskliga. Erhåll Informed samtycke från en människa blodgivare.
OBS: Ett diagram som avbildar anordningen visas i figur 2.
- Fyll vattenbad med destillerat vatten tills ca 1/2 hjul diameter är nedsänkta. Tillsätt tillräckligt med blekmedel till vattenbadet för att göra en 10% blekmedelslösning. Ställ badvattnet till 37 ° C och låta temperaturen till jämvikt.
- Samla adaptrar metall (som visas i figur 1B), omodifierade slangar och modifierade slangar och montera runt apparathjul, som visas i figur 1C. Se till att slangen passar tätt runt hjulet med metalladaptern på plats.
- Skaffa 30 ml blod prov med hjälp av en IRK-godkända protokoll, i en injektionsflaska förifyllda med 2 ml citrat eller annan antikoagulant, och blanda genom inversion för att förhindra koagulering när provet har samlats.
- Tillsätt ca 10 ml blod till varje rör med hjälp av metallventil och injektionsspruta, vilket lämnar en del luft i röret. Fäst ventilhatten och rotate för 3 tim.
- Tappa blodet i en avfallsbägare behandlas med en 10% blekmedel (eller som krävs av institutionella politik).
- Skölj försiktigt slang interiör med DPBS för att avlägsna alla spår av blod. Samla genomströmning i avfalls bägaren. Släng blod enligt institutionell policy.
- Desinficera apparaten och alla blodkontaktytor med en 10% blekmedel eller enligt institutionella politiken.
- Processprover för fluorescensmikroskopi eller svepelektronmikroskopi såsom beskrivs nedan.
4. Fluorescent Mikroskopi och cellräkning
- Förbered en 4% paraformaldehyd (PFA) lösning (Varning: Utför i dragskåp).
- Inkubera slangen i en 4% PFA lösning över natten vid 4 ° C.
- Efter inkubation över natten, ta bort 4% PFA och skölj filmer väldigt försiktigt med DPBS.
- Skär slangen i sektioner för att exponera lumen yta för färgning.
- Fläcken sektion av slangen med några droppar montering media med 4 ", 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 30 minuter vid rumstemperatur (ljuskänsligt). Efter färgning, skölj slangen väldigt försiktigt med DPBS att minska bakgrunds DAPI signal.
- Bild med hjälp av en fluorescerande mikroskop utrustat med en DAPI filter och digitalkamera för att räkna antalet celler i nio blint utvalda synfält i 200 gångers förstoring.
- Record cell räknas per synfält och genomföra lämpliga statistiska analyser för att bestämma statistisk signifikans av resultaten.
5. Svepelektronmikroskopi
- Bered en 2% glutaraldehydlösning (Varning: Utför i dragskåp).
- Inkubera slang i en 2% glutaraldehyd lösning över natten vid 4 ° C.
- Efter inkubation över natten, försiktigt skölja slangen 3x med DPBS.
- Bered en 1% lösning av osmiumtetroxid (Varning: Svår inandningsrisk! Användning i dragskåp).
- Inkubera slangen i en 1% lösning av osmiumtetroxid i 15 min vid rumstemperatur.
- Skölj försiktigt slangen 3x med DPBS.
- Bered en serie av etanolkoncentrationer (25%, 50%, 75%, 95% och 100% etanol).
- Dehydrera slangen genom inkubation i serien av etanolkoncentrationer. Inkubera i 25%, 50%, 75% och 95% etanol under 20 min vardera. Inkubera i 100% etanol under 30 min.
- Superkritisk punkten torka slangen med CO2 under 45 minuter för att ta bort all fukt.
- Montera slangsektioner på en prov påbörjad med silverpasta eller grafit.
- Rörsektioner Coat med 12,5 nm guld-palladium.
- Undersök i ett svepelektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generera tiolreaktiva polymera ytor genom användning av PDT-BzPh och TCEP tillsammans med tiolreaktivt recCD47 poly-lysin med användning av SMCC möjliggör fastsättning av recCD47 till polymera ytor. Modifieringen Processen sammanfattas schematiskt i figur 1. Bekvämligheten med denna modifiering process är att den kan tillämpas på många olika proteiner och många olika polymera ytor, förutsatt att proteinet kan modifieras med tillräckligt kemiskt reaktiva grupper såsom amininnehållande lysiner och att polymeren har tillräckligt tillgängliga kolväten.
Det har visats tidigare att recCD47 kan fogas till polymera ytor som använder detta protokoll 11-13. Såsom visas i figur 3A, är signifikant FITC-färgning synlig för recCD47, med användning av en FITC-konjugerad antikropp mot den extracellulära Ig-domänen av CD47, vilken är lokaliserad specifikt till filmen såsom visas av DIC avbildning(Figur 3B). Dessa resultat visar att recCD47 kan vara kovalent bunden till polyuretanfilmer. Att mäta de fluorescerande enheter och jämförelse med en standardkurva bestäms koncentrationen av ytbundet recCD47. Vi har visat att recCD47 kan fogas till polymera ytor på nivåer som överstiger 500 ng / cm 2,11-13. Dessa resultat bekräftar att denna tiol-baserad polymer modifiering protokoll kan användas för att foga poly-lysin modifierade rekombinanta proteiner till polymera ytor.
CD47 har visat sig vara en markör för "själv", förhindra inflammatorisk cellbindning och immunförsvar aktivering 7-13. För att efterlikna in vivo förhållanden så nära som möjligt i en ex vivo inställning kan helt mänskligt blod perfusion genom omodifierade och modifierade polymer slang i Chandler Loop Apparat (visas i figur 2). Cell fastsättning på slangen kan bedömas via DAPI färgning (
Figur 1 Schematisk bild av Ytmodifiering. A) tiolerad polymerytor genererades genom inkubering av polymera yta med fotoaktiverbar tvärbind PDT-BzPh och efterföljande reduktion med TCEP. B) </ Strong> SMCC användes för att producera tiolreaktivt recCD47, som sedan reagerades med den tiolerade syntetisk yta till bildning recCD47 funktion ytor.
Figur 2 Diagram över Chandler Loop Apparatus. A) Apparaten består av ett vattenbad uppvärmt till 37 ° C, roterande hjul fasta på en metall stång fäst till en rotationsmotor. Detta upplägg möjliggör rotationsmotorn att vrida hjulen, varigenom nedsänkning partier av slangen i 37 ° C vattenbad och perfusion av blod genom slangen. B) Metall adaptrar används för att ansluta ändarna av slangen som bildar en slinga runt en av de roterande hjulen. Blod läggs till rören genom metallventilporten och utjämnade med ventilkåpan. C) När monteras, bör slangen och metallventil passar snuggly around det roterande hjulet, som visas här med ett tomt rör.
Figur 3 kvantisering av recCD47 på polyuretanfilmer. Antikroppar riktade mot den externa Ig domänen av CD47 användes för att kvantifiera mängden recCD47 bundet till polyuretanfilmer. Fluorescerande mikroskop bilder tas i 200 gångers förstoring med lämpliga filtersatser som visar FITC upptäckt av recCD47 bifogas polyuretan (A). (B) DIC-bilder visar att FITC-signalen är specifik för den polyuretanfilm.
Figur 4 Celladhesion till omodifierad och recCD47 modifierad polyuretan. Hela människoblod samlades och perfusion över omodifierad eller recCD47-modifieradePU filmer för 3 tim. Efter 3 tim perfusionen fick filmerna sköljdes med DPBS, och de vidhäftade cellerna fixerades med 4% PFA över natten vid 4 ° C och DAPI färgades under 30 min vid rumstemperatur. DAPI-färgade celler räknades med hjälp av en fluorescerande mikroskop under 200 gångers förstoring och lämpliga filteruppsättningar. (A) 9 slumpvis utvalda synfält räknades för varje modifiering. (B) Data är representativa för 9 synfälten och uttrycks som medelvärde ± standardfel (p = 0,004).
Figur 5 SEM-analys av recCD47 modifierade och kontrollytor efter ex vivo analys. Humant helblod uppsamlades och perfusion över omodifierat eller recCD47 modifierad PVC-slang för 3 tim. Bilderna visar signifikant cellbindning till unmodified ytor medan recCD47 modifierade ytorna visar bara en tillfällig bifogad cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den fotokemi (sammanfattas i figur 1) medger ändring av praktiskt taget alla polymerytan som har tillräckliga kolväten för att underlätta PDT-BzPh fastsättning och efterföljande UV-bestrålning till foto-aktivera PDT-BzPh. Funktionalisering av polymeryta med reaktiva tiolgrupper tillåter för efterföljande fastsättning av en rad av testbara molekyler av intresse. I våra speciella studier valde vi rekombinant CD47 11-13. Den särskilda konjugeringskemi som vi använde involverade reaktionen av proteinets aminogrupper med den bifunktionella tvärbindare SMCC 11-13. Detta förutsatt tiolreaktivt recCD47 för efterföljande reaktion med den tiolerade polymeryta. Slutprodukten var en mono-sulfidbindning kovalent binda recCD47 till polymeren. För att se till att de amingrupperna från aminosyrorna i CD47 inte används för reaktionen, och därmed mildra effektenav den immobiliserade CD47, modifierade vi vidare den recCD47 genom insättning av ett poly-lysin-tagg vid proteinets C-terminal. Det skulle vara möjligt att en liknande molekyl strategi kan tillämpas med andra proteiner. Således konjugeringskemi presenteras här och på andra håll 11-13 erbjuder en god möjlighet att bedöma möjligheterna för potentiellt terapeutiska molekyler för att ge biokompatibilitet på syntetiska ytor.
En nackdel med detta protokoll är att exponera vissa typer av polymerer, såsom polyuretan, till längre perioder av UV-strålning kan orsaka missfärgningar. Detta kan undvikas genom att placera polymeren i polystyren rätter (som vanligen används i vävnadskultur) för att förhindra missfärgning av polymeren utan att hindra foto av PDT-BzPh. Våglängden för UV-ljus används i detta protokoll är 302 nm; avvikelse från denna våglängd kan leda till ineffektiva fotoaktivering av PDT-BzPh. Om man använder en annan våglängd avUV-ljus är nödvändigt optimering av UV-exponering tid för att säkerställa betydande fotoaktivering.
Efter detta protokoll möjliggör fastsättning av recCD47 till polymera ytor, för att immun skatteflykt och förmedla "själv" status till den polymera ytan för att förhindra att främmande kroppsreaktion. Kvantifiering av recCD47 bifogas ytan ska fyllas med hjälp av en FITC-märkt antikropp till Ig-området av CD47 med hjälp av en immun och fluorescerande mikroskopi (Figur 3). Denna metod kan anpassas till andra proteiner bifogas polymera ytor förutsatt antikropps tillgänglighet. Underlåtenhet att erhålla betydande bihang recCD47 (eller annat protein) kan bero på en mängd olika faktorer, inklusive underlåtenhet att photoactivate PDT-BzPh, otillräckliga gratis kolväten på polymerytan, hydrofoba polymerytan, eller polymeren kan vara för tjockt eller ogenomskinlig för att tillåta ljus att passera igenom för adekvat quantification. Alla dessa variabler kan experimentellt testas och optimeras för en viss polymer.
Den Chandler Loop Apparatus är ett unikt verktyg för analys av humant helblod exponering för polymera ytor ex vivo. Detta system liknar den perfusion av blod genom kliniska blod ledningar som används i olika medicinska procedurer, som möjliggör analys av många fysiologiska endpoint orsakade av blodkontaktytor. Som fysiologiska endpoints för bihang recCD47 till polymera ytor, var cellräkningar med hjälp DAPI färgning (Figur 4) och svepelektronmikroskop (Figur 5) användas. Andra slutpunkter kan också användas, beroende på utrustningens tillgänglighet, exempelvis cellräkningar före och efter genomblödning genom polymera blodledningarna skulle också kunna användas. Oavsett, recCD47-modifierade ytor uppvisar betydligt lägre vidhäftade celler jämfört med omodifierade kontrollytor. Dessa data tyder på att recCD47 förmedlar biokompatibilitet till polymera ytor och skulle kunna användas för att förhindra att FBR i kliniska procedurer med polymera blod ledningar.
Även om detta är en allmänt använd modell in vitro för blodperfusion studier, är den begränsad i vissa avseenden. De två största nackdelarna med detta förfarande härrör från kravet att inkludera luft i röret med blodprovet. Den täta blod interaktion med luft kan orsaka leukocyter och trombocytaggregation och proteindenaturering 16-18, vilket kan störa vissa endpoints. För det andra förblir luften vid den högsta punkten av kretsen, vilket begränsar hastigheten för blodcirkulationen 19. Trots de uppenbara begränsningarna med denna metod, inducerar det mindre skador blod än konkurrerande metoder 19 och fungerar som ett sätt att screena biokompatibilitet potentiella biomolekyler på polymera blod ledningar. När kandidat biomolekyler identifieras genomdenna metod kan vidare analys erhållas genom in vivo-djurmodeller. Ytterst behöver biokompatibiliteten hos modifierade polymerer som skall bekräftas med användning av en lämplig in vivo modellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forskningen rapporteras i denna publikation stöddes av National Institute of Biomedical Imaging och bioteknik, i enlighet med tilldelningsnummer R21 EB015612 (SJS), och National Heart, Lung, and Blood Institute, enligt tilldelningsnummer T32 HL007915 (JBS och RJL), av det nationella Institute of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
- Bruck, S. D.
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
- Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
- Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
- Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
- Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
- Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
- Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
- Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
- Ravetch, J. V., Lanier, L. L.
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
- Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).
