Introduction
原子力显微镜(AFM)是一种技术,它使定性和定量成像和探测的材料的表面。4-6传统AFM用于表面形貌,形貌和多相位材料的结构的评估。 AFM具有定量评价纳米尺度相互作用,如在空气和液体介质的特定探针和基板之间的电荷,吸引,排斥和粘附力的能力。7,8最初由分级,第四纪和Gerber 9的用途开发的原子力显微镜探测已知的/确定的灵敏度和弹性系数接近和/或扫描样本。由于探针与样品之间的物理相互作用,悬臂接触或接近时偏转,这取决于操作的模式下,该偏转可以被转换为获得本探针和样品之间的样品或测量力的地形。修改的原子力显微镜TECHNI阙,如胶体探针纳米显微,10已允许科学家直接评价存在于感兴趣的胶体系统,两种材料间的纳米相互作用力。
在胶体探针纳米显微,选择的球形颗粒附着到悬臂的先端,取代了传统的圆锥形和棱锥形的提示。球形粒子是理想的,允许与理论模型,如强生,肯德尔,罗伯茨(JKR)11和Derjaguin,朗多,Vervwey,Overbeek(DLVO)12-14理论,并尽量减少表面粗糙度对测量的影响比较。 15这些理论用于定义接触力学和颗粒间力预期的胶体系统中。 DLVO理论结合了有吸引力的范德华力和静电排斥力(由于双电层)来定量解释含水的胶体体系的聚集行为,而歼KR理论结合的接触压力和粘附到模型两个组件之间的弹性接触的效果。一旦适当的探针产生的,它被用来逼近的任何其它材料/颗粒,以评估在两个部件之间的力。使用制造的小费标准之一将是能够测量的尖端和选择的材料之间的相互作用力,但使用一个定制的胶体探针的利益使得目前所研究的系统中存在材料之间的力的测量。可测量相互作用包括:粘合剂,有吸引力,排斥力,电荷和存在于粒子之间甚至静电力16此外,胶体探针技术可以用来探索本颗粒和弹性材料之间的切向力17,18
进行测量,在各种媒体的能力是胶体探针纳米显微的主要优点之一。环境条件,液态间EDIA,或湿度可控的条件下都可以被用来模仿所研究的系统的环境条件。进行测量,在液体环境中的能力,使胶体系统中,它天然存在的环境中的研究;因此,能够定量地采集数据是直接翻译的系统在其自然状态。例如,定量吸入器(MDI)中存在粒子的相互作用可以用一个模型液体推进剂具有类似属性的计量吸入器所用的推进剂进行研究。在空气中测得相同的相互作用并不能代表在吸入器系统存在的。此外,液体介质可以被修改来评价水分侵入,二次表面活性剂,或温度上在MDI粒子相互作用的影响。以控制温度的能力,可用于模拟在胶体系统的制造某些步骤以评估温度无论是在制造或存储胶体系统可能对粒子的相互作用产生影响。
可以使用胶体探针来获得测量包括;地形扫描,个人的力量 - 距离曲线,力 - 距离粘连的地图里,住力距离测量。正在使用本文介绍的胶体探针纳米显微方法测量关键参数包括管理单元,最大负荷和分离能量值。管理单元是引力的测量,最大负载的最大附着力的价值,以及分离能传达到从接触撤回粒子所需的能量。这些值可以通过瞬时或停留力的测量来测量。两种不同类型的停留测量包括变形和压痕。驻留测量的长度和类型可以专门选择模仿所关心的系统中存在特异性相互作用。一个例子是使用偏转停留 - 持有来评估发展中形成的聚集体分散体胶粘剂债券 - 在希望的弯沉值在接触样品。所形成的粘合剂粘结可以测量作为时间的函数,并且可以提供深入了解再分散后的长期储存的聚集体所需的力。数据可以使用这种方法获得的大量证明了该方法的通用性。
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Protocol
1,准备胶体探针和原子力显微镜基板
- 为了准备胶体探针,使用由作者以前开发的方法。19
- 简而言之,使用45°角座贴上无针尖悬臂45°( 图1A)的特定角度。
- 通过涂抹一薄层的环氧树脂在显微镜载玻片上制备环氧滑动。用干净的抹刀或缓慢的氮气流,以确保环氧树脂加入到显微镜载玻片的层是最小的高度。
- 加盖环氧幻灯片使用一个定制设计的支架( 图1B)一个40X光学变倍显微镜镜头。然后使用悬臂接近环氧滑动并获取对悬臂少量的环氧树脂。
- 重复上述步骤,还附上感兴趣的单个粒子在悬臂( 图1C)的顶点。
- 通过粘贴胶体面值准备基板的AFM幕进行到使用热塑性胶粘剂安装的原子力显微镜的盖玻片。
- 热火35毫米的圆形盖玻片至120℃,并涂抹少量的粘合剂盖玻片。高温是必要的,以熔化热塑粘合剂应用。
- 然后冷却,将盖玻片至40℃喷粉胶体粒子上胶前。注:在40℃下的胶被充分地设定,该粒子将不会成为嵌入到胶,但胶是足够粘性的,以确保颗粒将附着在基板上。
- 进一步冷却盖玻片至室温,并用氮气吹干吹掉多余的独立的粒子。
- 与将用于胶体探针测量液体介质洗涤所述基板几次,以确保所有未连接的颗粒从基片上除去。注意:这是重要的,以减少自由流动的颗粒的测量过程中的影响,这可以跨行事悬臂和结果引入误差。
2,安装的胶体探头,对准激光和平衡系统
- 安装盖玻片与胶体颗粒进入底部的液态电池的一半,并确保该O型圈安装正确,以防止任何泄漏。
- 放置的疏水性透明片材上的显微镜载物台上,以防止可能在实验过程中漏出的液体,特别是如果只使用一种液体的细胞进行测定,下半部分,然后将液晶单元上的显微镜载物台上。注意:为了简单起见可以使用一个液晶单元的唯一的下半区,鉴于该系统可以适当地平衡化;提示 - 蒸发改变了测量和影响结果/读取的情况。
- 附加胶体探针的原子力显微镜扫描头和组装到原子力显微镜。随着对原子力显微镜仪器软件,请使用旋钮扫描头使悬臂尖端成为关注的焦点。注意:所有的程序步骤和测量使用的MFP-3D生物原子力显微镜与庇护研究软件完成。
- 为了最大限度地提高强度,对准激光上使用适当的调节旋钮上的扫描头的悬臂的末端。
- 允许系统达到平衡5-10分钟,或直至偏转值稳定。使用该偏转调节旋钮使偏转到零或稍负。
- 当系统在空气中达到平衡,使用原子力显微镜的软件(在主面板窗口中热板),以热计算InvOLS(灵敏度)和胶体探针的弹簧常数。注意:这种敏感性会暂时使用,直到真正的灵敏度的测量是在测量完成(见第4步)。
- 选择“校准弹簧常数”或“校准InvOLS”,然后点击“捕获热数据”。
- 一旦一个突出的峰值很明显,停止捕获数据,然后单击放大了主峰。
- 点击“初始化飞度”,其次是“适合热数据”,以获得自动计算弹簧常数或InvOLS值。
- 慢慢加入2毫升液体培养基来使用注射器将液体细胞,并确保没有气泡周围的悬臂本。重新对准激光器中,由于介质的折射率现在已经改变,并再次平衡系统允许挠度值,以调整所述偏转回零之前稳定下来。注意:如果环境和液体之间的温差较大存在,平衡将需要更长的时间。
3,成像和数据采集
- 设置初始扫描大小为20微米,扫描速度为1赫兹,扫描角度90°时,设置点到0.2 V,将获得的样品的扫描。如需要获得重叠跟踪调整增益而折回的曲线。
- 一旦感兴趣的粒子被发现,立刻放大到该粒子限制与获得力量体积测量前基底延伸探针的相互作用。
- 一旦放大,获得单个粒子的单个粒子的或部分的足够的图像。然后切换到部队面板中的软件。把红色位置栏到最高位置,设置强制距离5微米,扫描速率为0.1赫兹,触发通道为none,并进行单测力。确保探头不接触基板。
- 从所获得的单次测量图,计算出虚拟的偏转线通过右键单击图形窗口,并选择“计算虚拟高清线”选项。这将自动计算虚拟偏转,并根据需要在软件中更新值。
- 改变触发通道偏转,并设置触发点到20纳米。将力区ANCE到1微米和根据感兴趣的测力需要调节扫描速度。
- 2-3进行初步的连续单力测量后手动调整数值的审查小组委员会在偏转逆光杠杆灵敏度(InvOLS)。
- 进行单测力,然后点击在部队面板的“审阅”按钮,打开了一个法师部队面板。
- 突出显示最近完成的测力。在“轴”的标题确保只有“DeflV”被选中。以“日”使用下拉菜单更改“X轴”输入字段,并单击“制作图表。”
- 点击主面板部队的“帕姆”选项卡上,并调整“InvOLS”的值,直到图形的接触区域是完全垂直的。然后填充这个值在“DEFL InvOLS”栏位于下加州60,子选项卡中的强制选项卡位于主主面板窗口上。
- 重复这个2-3次,以确保InvOLS值不显著改变。
- 现在,所有的参数都已经设置,确保液体介质水平仍然足够,偏转仍然是稳定的。注意:在这个时候,可以得到单力曲线或力地图。如果停留力的测量需要,驻留选项可强制面板中进行访问。
4,后调整灵敏度的分析
- 在完成测量数据的收集之后,测量胶体探针的真实感光度。要做到这一点,使用相对大挠度/力与胶体探针在相同的液体培养基中对“无限”硬表面如云母进行测力。实验结束后,获得灵敏度,因为大挠度/力可能会损坏胶体:注意新娘探针制备多孔或脆弱的胶体。
- 接触区域的斜率是所使用的软件,自动计算出的灵敏度( 图2)。在所有使用该特定胶体探针得到的曲线数据分析使用灵敏度这个真正的价值。
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Representative Results
液体胶体系统用于多种药物给药系统。用于吸入给药,常见的胶体系统是悬浮加压计量剂量吸入器(pMDI的)。在的pMDI中存在粒子的相互作用配方的物理稳定性,存储和药物输送均匀性起到了至关重要的作用。在这个手稿,多孔基于脂质的颗粒之间的颗粒间力(〜2微米的光学平均粒径)在一个模型中的推进剂(2H,3H-全氟戊烷),在室温下进行了评价,以传达的功能,并且与呈现相关的可能的错误程序。
图3示出了两个有代表性的胶体探针使用,可用于胶体探针纳米显微的基于脂质的可吸入颗粒制备。重要的是单一的胶体粒子被固定在悬臂的顶端,使得其最突出的特征,并将所述第一点在测量过程中的联系。这确保了测量的相互作用是纯粹由于胶体粒子。附着多个颗粒或颗粒聚集体可以由于由两个粒子同时检测相同的单粒子存在于基板上的多个悬臂的偏转产生错误的结果( 图4)。使用适当的准备胶体探针,粒子基板的地形图像,如在图5中示出可以在液体介质中来实现。
使用胶体探针扫描地形会比那些使用锋利的锥尖所得之值定义;然而,在驻地网,地形扫描的主要目的是找到可以用来评价粒子间相互作用的基片上的粒子, 如图6传送几个力曲线在液体介质中进行的胶体探针测量时,人们可能会遇到。液体测量测量过程中包含错误的更多的来源,一个应该知道的所有来源,适当减少对测量( 图6A)的精度的影响。
迅速和尖锐的峰明显,在图6B的力曲线是指示突然干扰的系统在测量过程中的。这可以归因于原子力显微镜仪器的运动或在背景中(如关门声,打喷嚏),结果在瞬时和快速的不稳定的一个短的时间内突然噪声。在图6C中的基线中的悬臂的方法和缩回的波动表明与该液体介质中的问题。如果液体的细胞不能充分填充,允许该介质的蒸发对本系统和测量的稳定性有很大的影响,这可能会发生。这种不稳定的替代来源可以是从不正当的平衡悬臂的理趣介质ID在分析之前。悬臂是在温度变化和诸如“一流关闭'液晶单元的动作敏感需要足够的再平衡时间。 图6D描绘了进近过程中基线偏移和收缩周期。这个干净的转变是不存在的期间,瞬发力的测量,但更明显的停顿力测量。此漂移是悬臂的热漂移的影响,这可能有几个原因,包括:在液体培养基中,导致在该介质的温度变化缓慢蒸发,用这仍然是平衡到周围温度的介质,或者进行测量在未理想地控制的环境。在测量过程中的液体介质的温度最小稳定位移产生这样的漂移。这种类型的测量漂移的难以控制的高蒸发的液体,除非一个封闭液细胞被测量过程中使用; howeveR,大多数原子力显微镜分析软件可以修正这种漂移。
之后错误的所有可控源已被消除,并在系统被适当地平衡化,粘附映射可以采用跨样本的确定的尺寸,以获得数据的一个大的统计机构。力的映射可以被独立地或与地形扫描结合用于评估地形对粒子的粘附力( 图7)的效果。力映射将提供感兴趣的两个主要的图表:样品的基础上,高度地形图在该悬臂式触头在衬底( 图7A)和粘合地图传送每个单独的力曲线的最大拉力( 图7B)。在图7B的曲线图还可以用于获得粘附的数值平均值和标准偏差和管理单元中的力量,以及在整个样品分离的能量。这些原始数据GRAPHS可以被看作是整个样品( 图7C / D)的粘合力测量的地形或传播的三维表示和覆盖它们将产生一个三维的粘合力的分布图作为地形的函数( 图7E)。这种类型的数据提供了当前胶体以及如何胶体进一步影响相互作用的表面之间的力的批判性理解。
另外住力测量可以用来评价接触力学和在粘合力接触的长度的影响。固体脂质颗粒被用来传达此驻留的所测量的粘合力( 图8)的效果, 图8表明,粘合力的增加作为时间使用缩进驻留功能,而它们的高原使用偏转停留。这种趋势变得更加明显较长的停留时间(180秒)。
。图1描写用于生产胶体探针胶体探针纳米显微方法的(A)的原子力显微镜悬臂梁,附着于设计45°悬臂支架的自定义,(B)环氧/粒子滑动固定到辅助保持器被滑动到显微镜透镜(C)的悬臂缓慢升 至获得环氧基和一个粒子。
图2。悬臂梁的灵敏度是一个偏转与z轴的距离的曲线的接触区域的斜率。
图4:使用胶体探针具有固定多个颗粒可能会导致在单个粒子存在于基板上的基板的构形扫描期间的错误的重复。
使用适当的准备胶体探针得到图5。地形扫描。(A)大扫描揭示了利益多重粒子(B)更集中的扫描揭示了利益的一个主要粒子(C)的扫描集中的单个颗粒的表面上。
。良好的动力曲线图6与各种条件的限制,人们必须意识到获得力曲线(a)为例,(B)力曲线显示或者通过原子力显微镜的运动或噪声测量过程中存在的干扰;(C )由于非平衡悬臂波动可能导致不稳定的逼近/回退,因为缓慢蒸发的测量,存在于(D)热漂移存在,导致中期或不稳定的环境控制的冷却。
。样品表面,可以使用胶态纳米显微探针来获得图7粘附力映射(A)的地形分布;(B)的最大粘附力在样品分配(C / D)的曲线图的3维表示示分别在A和B(E)的地形和粘附力产生粘附力的一个三维插图作为地形的函数的叠加。
图8。测量的停留时间使用两种不同的驻留测量(N = 30),(◊)IND函数的粘附力entation(□)偏转; *表示使用两尾t-检验在95%置信度(P <0.05)值之间的差异显著在特定时间点。
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Discussion
系统不稳定时液体胶体探针纳米显微目前的几个来源可以很容易地通过适当的平衡过程来缓解。所讨论的不稳定性先前导致错误的结果和力曲线更难以客观分析。如果不稳定的所有来源已趋向和图形相似,在图4所示的仍然存在,另一次测量的参数可以是原因。这是要考虑的重要过程中的胶体探针纳米显微其他测量参数包括在该悬臂啮合并从样品回缩的速度和力测量的触发点。另外,应该指出的是,胶体探针的中心的位置可以是一个传统的针尖不同。因此,它表示到位置的正上方的探测粒子的中心激光点以最大化测量精度。
我t为重要的是选择一个速度是足够的力问津的测量和一个是适合在液体介质中使用。如果只关心存在于粒子之间的粘合力,的方法的速度不是关键的。然而,对于颗粒之间的吸引力和排斥力的测量,选择的方法和缩回速度足够慢是很重要的。的接近速度的选择应使相互作用,而不是速度支配悬臂的偏转。一个快速的方法将掩盖,不让时间吸引作用形成,而一个非常缓慢的方式在液体介质中会产生不稳定的基线类似于图6C。引起的慢方法的不稳定性是由于在悬臂液体浮力是类似于在悬臂的方法中使用的力。
应事先将数据视为另一次测量参数收购是最终的触发力。过大的触发力能够导致大的变形的测量过程中,甚至可能会压碎取决于材料特性的探针或样品。可替换地,太小的力会产生不准确的结果,因为探针和样品之间的液体层可能不能充分地从颗粒之间压出,从而测得的相互作用不是颗粒 - 颗粒。优化方法是非常重要的适当筛选和测试各种测量参数,以确保所获得的数据可表示和准确。
力对应于图7中所示可以提供大容易地得到数据集。地形地图,并随后覆盖三维表示的分辨率直接相关的测量进行的次数。但是,即使数据点的数量较多会产生更高分辨率的图像,扫描时间可大大增加。保持液体测量系统稳定贯穿力的映射可以是具有挑战性取决于液体介质和环境控制。液体的蒸发,这是最大的问题之一,可通过定期'摘心断开“系统与附加的液体受到限制。然而,当务之急是扫描暂停和足够的时间恢复之前的测量给出了再平衡的系统。一种合适的扫描时间的选择应确保该系统可以保持稳定,以确保测量的准确度。
进行瞬时力曲线,住力曲线,并武力地图大数据集的能力传达的胶体纳米显微探针在评价目前的胶体系统中,模仿自然发生的环境相互作用的多功能性。使用此处介绍的方法得到的实验数据可以提供重要的见解胶体安定性,静电相互作用,一ND凝固动力学。此信息可用于筛选和或改善目前的胶体系统在多个不同的行业。此外该方法可用于与生物的细胞系来评价某些药物或材料对细胞的相互作用和功能的影响(其制备的胶体探针)。这可以提供在小分子,药物发现和配方设计很大的启示。此外,随着生产亚微米甚至纳米胶体探针的能力的最新进展,可以使用提出的方法来学习,甚至纳米胶体体系。
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Acknowledgments
作者承认(1)从纳米生物医学科学与BK21 PLUS NBM全球研究再生医学中心的檀国大学,并系资金支持的重点由NRF,大韩民国,(资助研究中心计划(编号2009-0093829) 2)设施,科学和技术援助的澳大利亚中心显微镜和微量分析在悉尼大学。 HKC感谢澳大利亚研究理事会通过发现项目补助(DP0985367&DP120102778)的财务支持。世界锦标赛是感谢澳大利亚研究理事会通过联动项目补助(LP120200489,LP110200316)的财务支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Double-Bubble Epoxy | Hardman | 4004 | |
Veeco Tipless Probes | Veeco | NP-O10 | |
Porous Particles | Pearl Therapeutics | ||
Atomic Force Microscope (MFP) | Asylum | MFP-3D | |
SPIP Scanning Probe Image Processor Software | NanoScience Instruments | ||
35 mm Coverslips | Asylum | 504.003 | |
Tempfix | Ted Pella. Inc. | 16030 |
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