Introduction
שיטות חישת חלבון מדויקות ומהירים הן חשובות מאוד באבחון רפואי ופרוטאומיקה. מערכים קלאסיים לגילוי חלבון, כגון שבבים, המבוססים על עיקרון ההכרה "המפתח לנעול-and-" ודורשים קולטנים ספציפיים כגון aptamers, נוגדנים, או mimetics.
בשנים האחרונות, חישת ההפרש בהשראת olfaction וgustation האנושיים התפתחה כ1 חלופי. האף / לשון אלקטרונית זה גישה (en / ET) מבוססת על ההפרש המחייב של analytes למערך של קולטנים צלב-reactive (CRRs), שלא צריך להיות מאוד ספציפי או סלקטיבית למולקולות המטרה ובכך לאפשר להתגבר מייגע תהליך של פיתוח קולטנים בררנים במיוחד. זה התגובה המשולבת של כל הקולטנים שיוצר דפוס מובהק עבור כל דגימה, כמו טביעת אצבע, המאפשר זיהוי שלו.
שני אתגרים מרכזיים לפיתוח elecהאף / לשון tronic לחישת חלבון יעילה היא הייצור של רכיבי חישה כי יש את היכולת להבחין בין analytes מבני דומה ומערכת התמרה המתאימה לאירוע המחייב. עד עכשיו, מחקרים דיווחו גישות שונות לפיתוח מערך 2. לדוגמא במחקר אחד מבוסס זיהוי מערך של חלבונים שפותח באמצעות CRRs הוכן מנגזרי טטרה-carboxyphenylporphyrin על ידי צימוד קבוצות carboxyl לחומצות אמינו שונים או dipeptides לספק קולטנים ההפרש בעל ליבה הידרופובי לזיקה לחלבונים ופריפריה טעונה ברורה ל ההפרש הקניית מחייבת. באמצעות מערכת זו, חלבונים שונים ותערובות חלבון זוהו על ידי מדידת מרווה הקרינה של קולטנים על אינטראקציה עם analytes 3,4. במחקר אחר, ספרייה של 29 CRRs מכיל tripeptide וmoieties חומצת boronic המסונתזת בדרך קומבינטורית על hexasubstiפיגום בנזן tuted פותח עבור חישת חלבונים עם גילוי colorimetric מחוון הספיגה 5,6. עם עיצוב כזה, כל קולטן הראה יכולת מחייבת ההפרש עם חלבונים המבוססים על השונות בזרועות פפטיד, וחומצות boronic סייעו בבידול של חלבונים מגליקופרוטאינים. לאחרונה, מערך המורכב של חלקיקי זהב שונים קטיוני פונקציונליות מצומדות עם פולי אניוני ניאון פולימר (p-phenyleneethynylene) (PPE) נוצר כדי לאתר ולזהות חלבונים 7. התחרותי מחייב בין analytes החלבון ורווית מתחמי nanoparticle / זהב PPE מחדש הקרינה, ייצור תבניות הכרה ברורות לחלבונים. במחקר זה, אינטראקציות חלקיק החלבון פונקציונליות היו מכוונת על ידי שינוי מאפייני physicochemical של קבוצות קצה חלקיק. יתר על כן, הם הראו שגישה זו היא יעילה לניתוח חלבונים במדיום עשיר חלבון מורכב וכאלהכסרום אנושי בריכוזים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, ובכך מראה את הפוטנציאל של ET בפרופיל דוגמאות אמיתיות לאבחון מצבי מחלה 8.
למרות שמאוד מבטיח, יש לי מערכות אלה כמה מגבלות מובנות. הם דורשים עיצוב וסינתזת 5-29 CRRs עם מבנים מורכבים למדי. בנוסף, בניגוד למערכת חוש הריח שמתאפסת לאחר כל מדידה, חישת חלבון דורשת הכנת מערך לדגימה. לבסוף, אירועים המחייבים ניטור בזמן אמת קשים מאוד.
בהקשר זה, גישה קומבינטורית הוצעה על ידי שימוש במספר קטן של מולקולות פשוטות ונגישים בקלות עם מאפייני physicochemical שונים (הידרופילי, הידרופובי, מטען חשמלי חיובי, מטען שלילי, ניטראלי, וכו '.) כאבני בניין (BBS) 9. על ידי ערבוב הביבי במשתנה ופרופורציות מבוקרות ומאפשר תערובות לעצמיות להרכיב על משטח הזהב שלפריזמה, מערך של משטחים קומבינטורית הכוללים תכונות מתאימות לכריכה חלבון נוצר. יש לציין, monolayers העצמי התאספו במערכת זו מאפשר כוונון קל של מגוון רחב של מאפייני פני השטח באופן סוטה ביותר, המאפשר לקולטנים שונים קומבינטורית צלב-reactive (CoCRRs) להיות מיוצר במהירות וביעילות. חישת חלבון בוצעה באמצעות מערכת זיהוי אופטית, משטח הדמיה בתהודה plasmon (spri). בקצרה, אור מקוטב מונוכרומטי רחב קרן מLED מאיר את כל אזור מערך CoCRR על פני השטח של פריזמה. מצלמת וידאו CCD ברזולוציה גבוהה מספקת תמונות הבדל בזמן אמת בכל הנקודות של מערך CoCRR. היא לוכדת את כל השינויים המקומיים על פני השטח של מערך CoCRR מתן מידע מפורט על אירועים מחייבים ותהליכים הקינטית 10. בינתיים, בעזרת תוכנת הדמיה, תמונות SPR המתאימות לכתמים תומרנה אוטומטית לווריאציות של versu רפלקטיביותזה זמן, שהניבו סדרה של עקומות מחייבות הקינטית נקראות sensorgrams. לפיכך, spri מאפשר התבוננות תווית חופשית, סינכרוני, מקבילה, בזמן אמת של אירועים מחייבים. בנוסף, מערך CoCRR המתקבל הוא regenerable וניתן לשימוש חוזר לניתוח חלבונים.
פרוטוקול זה מתאר את הבנייה של הלשון האלקטרונית באמצעות מולקולות קטנות רק שני כאבני בניין וממחיש את בקשתה לניתוח של חלבונים נפוצים המבוססים על דפוסי הכרה מתמשכים שהושגו עם spri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הכנת פתרונות שונים ודוגמאות חלבון
- הכן של פתרון פוספט חיץ (PBS-G) המכיל 50 מ"מ לאא 2 PO 4, 50 mM NaCl 100 מ"ל, וגליצרול% 10 בpH 6.8.
- הכן 250 מ"ל של תמיסת חיץ HEPES מכיל 10 HEPES מ"מ, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20 בpH 7.4.
- הכן פתרון מניות של אבן בניין 1 (BB1) לחסום לקטוז ובניית 2 (BB2) הגופריתית לקטוז (איור 1) ב0.2 מ"מ בPBS-G.
- הכן 1 מ"ל של פתרונות חלבון בHEPES: לקטינים hypogaea rachis (AHL) בשעה 500 ננומטר, מיוגלובין ב1 מיקרומטר, ויזוזים ב500 ננומטר.
- הכן 20 מ"ל של 1% SDS במי ultrapure.
2 הכנת מערך CoCRR
- נקה את משטח הזהב של hr פריזמה 48 לפני שימוש עם שואב פלזמה למשך 3 דקות בתנאים אלה: חמצן 75%, 25% ארגון, 0.6 mbar, כוח 40 W.
- הכן solutio הטהור ומעורב אחד עשרהns של BB1 וBB2 עם [BB1] / ([BB1] + [BB2]) יחסים בין 0 ל 100% במרווחים של 10% בריכוז BB כולל של 0.1 מ"מ בPBS-G.
- הפקדה 8 טיפות NL של פתרונות טהורים ומעורבים אלה על פני השטח המנסרה באמצעות ללא מגע צופה בארבעה העתקים עבור כל יחס עם 44 נקודות בסך הכל (איור 2).
הערה: 10 גליצרול% הוסיף בPBS-G הוא מאוד חשובה כדי להפחית את האידוי ממס והשינוי של ריכוז BB לאחר בתצהיר. - הנח את הפריזמה בתוך צלחת פטרי המכילה 1 מ"ל של מים ultrapure ולהשאיר אותה O / N ב RT להרכבה עצמית של BB1 וBB2 על משטח הזהב. במסמך זה, הנחה היא כי הרכב פני השטח הממוצע בסאמס המעורב משקף את הרכב הפתרון המעורב בתצהיר (איור 3) 11.
- שטוף ביסודיות את הפריזמה עם מים ultrapure ולאחר מכן לייבש אותו תחת זרם של ארגון.
.3 חלבון חישה על ידי spri
- הגדר את incubator שבו מנגנון spri ממוקם ב25 ° C כדי למנוע שינויי מקדם שבירה הנגרמים על ידי שינויי טמפרטורה במהלך חישת חלבון.
- הכנס פריזמה שטיפה-פונקציונליות שאינו בקיטון אתר Polyether 10 μl (פיק) לזרום תא מחובר למשאבה בשליטת מחשב מזרק, מסלק גזים ושסתום הזרקה בלחץ בינוני 6 יציאות (איור 4). מלא את מערכת הזרימה עם מסונן טרי וdegassed פועל HEPES חיץ.
- הסר את הפריזמה השטיפה והכנס את הפריזמה המכילה את מערך CoCRR בתא הזרימה. הפעלת HEPES ב100 μl / קצב זרימה דק '. בעזרתו של מצלמת CCD להסיר בועות אוויר על פני השטח פריזמה על ידי העברת מאגר פועל במהירות.
- הגדר את אזור מחקר לכל מקום על ידי ציור עיגול עם הקוטר זהה לתחום עניין של מבוסס על תמונה בניגוד היטב של המערך ועם העזרה של תוכנה משולבת במערכת spri.
- עקוב אחר עקומות plasmon, המייצגות משקפיםעקומות ivity בפונקציה של זווית האירוע, לכל המקומות.
- בחר את הזווית (מיקום שבו יירשמו עקומות קינטית) עובד במדרון הגבוה ביותר של עיקולי רפלקטיביות. סובב את מראה הסריקה כדי לתקן את זווית עבודה שנבחרה למדידות קינטית.
- תמשיך לפעול HEPES באמצעות מערכת הזרימה עד אות רפלקטיביות עבור כל הנקודות היא יציבה וקבועה.
- הזרק 1 מ"ל פתרון AHL עם מזרק לתוך לולאת המדגם (500 μl) עם שסתום ההזרקה ב" עומס "עמדה. ואז לשים את שסתום ההזרקה למצב את "זריקה". קצב הזרימה המשמש לכל הזרקת החלבון היה 100 μl / דקה.
- התחל מדידות קינטית על ידי ניטור שינויי רפלקטיביות נגד הזמן בו זמנית בכל המקומות.
- בסופו של הזרקת חלבון, לשטוף את המערך עם הפעלת מאגר ל8 דקות. לבסוף, להזריק 1 מ"ל 1% SDS להתחדש זה.
- חזור על אותו התהליך p האחרroteins.
.4 עיבוד נתונים וניתוח
- בעקבות כניסתו של פתרון חלבון לתוך תא הזרימה, מולקולרי מחייב מתרחש וגורם לתזוזה של עקומות plasmon ווריאציה של רפלקטיביות. תוכנת רכישת התמונה ממירה את ערכי עוצמת אור הנמדדים לאפור רמות גוניות, נותנת תמונות SPR איור 5A, ויוצרת וריאציה של רפלקטיביות לעומת זמן, נותן sensorgrams (איור 5).
- השתמש בתוכנת מחשוב מתמטיקה לתכנן רפלקטיביות (% R) בסוף כל הזרקת חלבון לעומת [BB1] / ([BB1] + [BB2]) יחס כדי ליצור פרופיל 2D רציף אבולוציה (CEP) עבור כל דגימה (איור 5C).
- הוסף את [BB1] / ([BB1] + [BB2]) יחס בsensorgrams (איור 5) כדי ליצור נוף 3D רציף אבולוציה (CEL) עבור כל חלבון (איור 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לחקור את היכולת של הלשון האלקטרונית לניתוח חלבונים נפוץ, שלושה חלבונים היו בשימוש: AHL, מיוגלובין ויזוזים. לכל חלבון, פרופיל שונה 2D רציף אבולוציה, CEP, נוצר על ידי ET, כפי שמוצג באיור 6.
בנוסף, הודות לspri, שהוא מסוגל לעקוב אחר קינטיקה הספיחה וdesorption בזמן אמת, לכל חלבון זמן דפוס הכרה מתמשכת תלוי, נקרא נוף 3D רציף אבולוציה (CEL), נוצר. באיור 7, cels האופייני של שלושת חלבונים אלה מוצגים.
מבני איור 1 הכימי של אבני בניין שני שימוש בפרוטוקול זה כדי להכין את מערך CoCRR.51,901 51901fig1highres.jpg "target =" / _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 תמונה של פריזמה לאחר הפקדת 44 הטיפות של הפתרונות הטהורים ומעורבים של BB1 וBB2 באמצעות טיווח פיזואלקטריים ללא מגע עם כל יחס בארבעה העתקים. פריזמה הוצבה בסמוך לצינור Eppendorf של 1.5 מ"ל.
איור 3 איור סכמטי של מערך CoCRR מכיל 11 קולטנים ההפרש שהוכנו עם פתרונות טהורים ומעורבים של BB1 וBB2 ביחסים שונים ומאפשר תערובות לעצמיות להרכיב על sur הזהבפנים של המנסרה.
איור 4 איור סכמטי של מערכת איתור spri בשילוב עם מערכת microfluidic.
איור 5 איור סכמטי של טיפול נתונים לדור של שני סוגים של דפוס הכרה מתמשך עם לשון מפותחת אלקטרונית: פרופיל אבולוציה מתמשך 2D ונוף אבולוציה מתמשכת 3D.
איור 6 Continuouשל פרופילי אבולוציה לשלושה חלבונים טהורים:. AHL (500 ננומטר), מיוגלובין (1 מיקרומטר), ויזוזים (500 ננומטר) הם נוצרו על ידי התוויית הווריאציה של רפלקטיביות (R%) בסוף הזרקת חלבון לעומת [BB1 יחס] / ([BB1] + [BB2]).
איור 7 נוף של טעם: cels 3D האופייני של AHL, מיוגלובין ויזוזים שנוצר על ידי הלשון האלקטרונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר לבנייה של ET זה מוקדשים כדי להבטיח שחזור טוב של המערכת. לדוגמא, לנקות את משטח הזהב של פריזמה עם הליך סטנדרטי לפני השימוש, הוספת 10% מגליצרול באחד עשרה פתרונות טהורים ומעורבים של BB1 וBB2 לחסל אידוי ממס במהלך BBs עצמי הרכבה על משטח הזהב של פריזמה, הפקדת משכפל מרובה עבור כל [BB1] / ([BB1] + [BB2]) יחס, וכו '. באשר לחישת חלבון על ידי spri, הבחירה של זווית העבודה היא קריטית. בדרך כלל, זה קבוע במדרון הגבוה ביותר של עיקולי רפלקטיביות. בנוסף, זה מאוד חשוב להשתמש בתנאים סטנדרטיים ניסיוניים עבור כל חישת חלבון, כגון טמפרטורת עבודה, קצב זרימה, וכו '. לאחר כל הזרקת חלבון, מערך CoCRR חייב להיות מחדש לשימוש חוזר עם פתרון מתאים המאפשר התחדשות של המערכת שלמה ללא כל נזק לקולטנים.
e_content "> כדי להדגים שET פיתח הוא לא רק יעיל לחקר חלבוני סוכר מחייב כפי שדווחו בעבר 9, אלא גם לחלבונים נפוצים, יחד AHL קטינים אחד עם שני חלבונים שאינם מחייב סוכר מיוגלובין ויזוזים היו בשימוש. הם נבחרו יש מגוון של חיובים בHEPES (pH 7.4):. AHL (נקודה איזואלקטרית (PI) 6.0), מיוגלובין (PI 7.2) ויזוזים (PI 11) יש לציין, כפי שמוצג באיור 6, כל חלבון בעל ייחודי דפוס תגובה. AHL הוא מעט טעון שלילי בHEPES. CEP מראה כי יש לו אינטראקציה חזקה יותר עם CoCRRs BB2 העשיר הטעון השלילי. סביר להניח שזה נובע מהאינטראקציה בין תחום מטען החשמלי החיובי של החלבון וCoCRRs BB2 העשיר . למיוגלובין, שהוא ניטראלי בעולם בHEPES, אין הרבה הבדל בין האותות שהושגו עם כל CoCRRs. כאשר משווים מיוגלובין בCEP לפטריות הלבנות של AHL ויזוזים, אפילו בריכוז גבוה יותר האות היא הרבה lower. באשר ליזוזים, שמטען חשמלי חיובי בHEPES, האות המקסימלי הושגה עם CoCRR מכיל BB2 הטהור.הודות ליתרונות של spri מסוגלים ניטור קינטיקה הספיחה וdesorption בזמן אמת, לכל חלבון נוף אבולוציה מתמשכת 3D נוצר. סוג זה של דפוס תלוי זמן הכרה מביא פרמטרים בידול נוספים לניתוח חלבון. במיוחד, זה יכול להיות מאוד שימושי לניתוח שני analytes הצגת הזיקה הדומה לקבוצה של CoCRRs אך שונה בקינטיקה שלהם אינטראקציה. כפי שניתן לראות באיור 7, cels הוא להבחין בקלות. תוצאות אלו מראות כי האינטראקציה של שלושה חלבונים עם CoCRRs תלויה במאפייני פני השטח שלהם, כגון ההפצה של שאריות חומצת אמינו הידרופובי, ניטרליות וטעונות. CEP וCEL שניהם יכולים לשמש כ" טביעות אצבעות "לאפלית החלבון וprospecזיהוי מופרז. לפיכך, ET הוא יעיל לניתוח של חלבונים נפוצים.
הפרוטוקול המתואר במסמך זה משתמש בגישה קומבינטורית לבנות et לניתוח חלבונים. שלא כמו גישות אחרות המשתמשות במספר המולקולות שהן מבחינה מבנית מורכבים ומייגעים לסנתז, רק שתי מולקולות קטנות המשמשות להכנת מערך קולט צלב-reactive מסוגל להבדיל חלבונים עם רזולוציה טובה במחקר נוכחי. בנוסף, על פי החקירה הקודמת, ואח הוא יציב, לשחזור והשימוש חוזר 9. יתר על כן, spri מאפשר ניטור אירועים המחייבים בזמן אמת ויצירת דפוסי הכרה מתמשכים רומן עם אמינות חסרת תקדים. בעתיד הקרוב, הביבי נוסף עם מאפייני physicochemical משלימים יהיה הציג להגדיל את המגוון של CoCRR במערכים לניתוח של תערובות מורכבות בגז נוזלי או ב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| Erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| Arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
References
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
- Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
- Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
- Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
- Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
- De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
- Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
- Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
- Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).
