Method Article

לשון אלקטרונית יצירת דפוסי הכרה רציפה לניתוח חלבון

DOI:

10.3791/51901

⸱

September 16th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Structure et Propriétés d'Architectures Moléculaires, Institut Nanosciences et Cryogénie, CEA-Grenoble, 2Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d'Orsay, Université Paris-Sud, 3Institut de Biologie Structurale

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארת גישה חדשה לבניית לשון אלקטרונית (eT), המפשטת מאוד את התכנון והייצור של חומרי חישה, ומאפשרת ל-eT ליצור פרופילי אבולוציה רציפה ונופים עבור דגימות בנוזל. ה-eT המתקבל יעיל לניתוח חלבונים נפוץ כגון אפליה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול הנוכחי, פותחה גישה קומבינטורית כדי לפשט את התכנון והייצור של חומרי חישה לבניית לשונות אלקטרוניות (eT) לניתוח חלבונים. על ידי ערבוב מספר קטן של מולקולות פשוטות ונגישות בעלות תכונות פיזיקו-כימיות שונות, המשמשות כאבני בניין (BBs), בפרופורציות משתנות ומבוקרות ומאפשרות לתערובות להרכיב את עצמן על משטח הזהב של פריזמה, נוצר מערך של משטחים קומבינטוריים בעלי תכונות מתאימות לחישת חלבונים. בדרך זו ניתן להשיג מספר רב של קולטנים צולבים במהירות וביעילות. על ידי שילוב מערך כזה של קולטנים קומבינטוריים צולבים (CoCRRs) עם מערכת גילוי אופטית כגון הדמיית תהודה פלזמון על פני השטח (SPRi), ה-eT המתקבל יכול לנטר את אירועי הקישור בזמן אמת וליצור דפוסי זיהוי רציפים כולל פרופיל אבולוציה רציפה דו-ממדי (CEP) ונוף אבולוציה רציפה תלת-ממדית (CEL) עבור דגימות בנוזל. מערכת eT כזו יעילה להבחנה של חלבונים מטוהרים נפוצים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות חישת חלבון מדויקות ומהירים הן חשובות מאוד באבחון רפואי ופרוטאומיקה. מערכים קלאסיים לגילוי חלבון, כגון שבבים, המבוססים על עיקרון ההכרה "המפתח לנעול-and-" ודורשים קולטנים ספציפיים כגון aptamers, נוגדנים, או mimetics.

בשנים האחרונות, חישת ההפרש בהשראת olfaction וgustation האנושיים התפתחה כ1 חלופי. האף / לשון אלקטרונית זה גישה (en / ET) מבוססת על ההפרש המחייב של analytes למערך של קולטנים צלב-reactive (CRRs), שלא צריך להיות מאוד ספציפי או סלקטיבית למולקולות המטרה ובכך לאפשר להתגבר מייגע תהליך של פיתוח קולטנים בררנים במיוחד. זה התגובה המשולבת של כל ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 הכנת פתרונות שונים ודוגמאות חלבון

  1. הכן של פתרון פוספט חיץ (PBS-G) המכיל 50 מ"מ לאא 2 PO 4, 50 mM NaCl 100 מ"ל, וגליצרול% 10 בpH 6.8.
  2. הכן 250 מ"ל של תמיסת חיץ HEPES מכיל 10 HEPES מ"מ, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20 בpH 7.4.
  3. הכן פתרון מניות של אבן בניין 1 (BB1) לחסום לקטוז ובניית 2 (BB2) הגופריתית לקטוז (איור 1) ב0.2 מ"מ בPBS-G.
  4. הכן 1 מ"ל של פתרונות חלבון....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לחקור את היכולת של הלשון האלקטרונית לניתוח חלבונים נפוץ, שלושה חלבונים היו בשימוש: AHL, מיוגלובין ויזוזים. לכל חלבון, פרופיל שונה 2D רציף אבולוציה, CEP, נוצר על ידי ET, כפי שמוצג באיור 6.

בנוסף, הודות לspri, שהוא מסוגל לעקוב אחר קינטיקה הספיחה וdesorption בזמן אמת, לכל חלבון זמן דפוס הכרה מתמשכת תלוי, נקרא נוף 3D רציף אבולוציה (CEL), נוצר. באיור 7, cels האופייני של שלושת חלבונים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים הקריטיים ביותר לבנייה של ET זה מוקדשים כדי להבטיח שחזור טוב של המערכת. לדוגמא, לנקות את משטח הזהב של פריזמה עם הליך סטנדרטי לפני השימוש, הוספת 10% מגליצרול באחד עשרה פתרונות טהורים ומעורבים של BB1 וBB2 לחסל אידוי ממס במהלך BBs עצמי הרכבה על משטח הזהב של פריזמה, הפקדת משכפל מרובה עבור כל [BB1] / ([BB1] + [BB2]) יחס, וכו '. באשר לחישת חלבון על ידי spri, הבחירה של זווית העבודה היא קריטית. בדרך כלל, זה קבוע במדרון הגבוה ביותר של עיקולי רפלקטיביות. בנוסף, זה מ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות למענק הדוקטורט של LANEF בגרנובל על תמיכתה של לורי-אמנדין גרסון. עבודה זו נתמכה כספית על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-grant 06-NANO-045).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מכשירי SPRi Horiba Scientific-GenOpticsSPRi ממוקם בחממה מווסתת טמפרטורה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
אינקובטורממרט
 מכשירים מדעיים CavroCavro XLP 6000
Micro Elite Degasser AlltechAT590507
שסתום הזרקת לחץ בינוני עם 6 יציאותUpchurch Scientificנפח לולאת ההזרקה בשימוש הוא 500 µl.
מנקה פלזמה Femto (גרסה 7)של Dienerעם 2 ערוצים.
ספוטרSiliflowזהו ספוטר פיזואלקטרי ללא מגע.
SPRi-BiochipHoriba Scientific-GenOptics36000067המנסרה עשויה מפריזמת זכוכית בעלת מקדם שבירה גבוה המצופה בסרט זהב דק (45 ננומטר) ופותחה במיוחד למטרות הדמיה.
לקטין אריתרינה קריסטגאלי Sigma-AldrichL5390
Arachis hypogaea לקטין  סיגמא-אולדריץ'L0881
מיוגלוביןסיגמא-אולדריץ'M1882
ליזוזיםסיגמא-אולדריץ'L6876
CXCL12 ואלפא;סופק על ידי ד"ר Hugues Lortat-Jacob; לפרטי הכנה, ראה מידע תומך בהפניה 9
CXCL12γ  סופק על ידי ד"ר Hugues Lortat-Jacob; לפרטי הכנה, ראה מידע תומך בהפניה 9
לקטוזשסופק על ידי פרופ' דיוויד בונף;; לפרטי הכנה, ראה מידע תומך בהפניה 9
לקטוזסופק על ידי פרופ' דיוויד בונףé; לפרטי הכנה, ראה מידע תומך בהפניה 9
גליצרולSigma-AldrichG5150
SDSSigma-AldrichL4509
Tween 20Sigma-Aldrich274348
HEPESSigma-AldrichH3375
נתרן פוספט מונו-בסיסיSigma-AldrichS0751
נתרן כלוריSigma-AldrichS3014
מכשיר משאבת מזרק מערכת הסרת גז אלקטרונית מקוונת גופרתי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
  2. Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general app....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Electronic TongueProtein AnalysisCombinatorial ApproachSurface Plasmon Resonance ImagingContinuous Evolution ProfileContinuous Evolution LandscapeCross Reactive ReceptorsSelf Assembly MonolayersBuilding Block MixturesKinetic Binding Curves

Related Articles