Introduction
正確かつ迅速なタンパク質検出法は、医療診断およびプロテオミクスにおいて非常に重要である。そのようなバイオチップのような古典的なタンパク質検出アレイは、「ロックアンドキー」の認識の原理に基づいており、そのようなアプタマー、抗体、または模倣体などの特定の受容体を必要とする。
近年、人間の嗅覚と味覚に触発差動検出は、代替1として浮上している。この電子鼻/舌（EN / ET）のアプローチは、標的分子に対する高度に特異的または選択的である必要はありません交差反応性受容体（CRRs）の配列に分析物の結合差に基づいているので、面倒を克服することができます高度に選択的な受容体を開発するプロセス。これは、その同定を可能にする、指紋のように、各サンプルの異なるパターンを作成し、すべての受容体の結合応答である。
エレックの開発のための2つの主要な課題効果的なタンパク質検出のためのTRONIC鼻/舌は構造的に類似の検体と結合事象のための適切な伝達系を区別する能力を持っているセンシング素子の製造である。これまでの研究では、アレイの開発2にさまざまなアプローチを報告している。例えば、ある研究では、タンパク質のアレイベースの識別は、タンパク質とのための明確な荷電周囲との親和性のための疎水性コアを有する差動受容体を提供するために、各種アミノ酸やジペプチドにカルボキシル基を結合させることにより、テトラcarboxyphenylporphyrin誘導体から準備CRRsを使用して開発された異なる結合を付与する。このシステムを使用して、異なるタンパク質及びタンパク質混合物の分析物3,4との相互作用の際に受容体の蛍光消光を測定することによって同定した。別の研究では、hexasubstiにコンビナトリアルな方法で合成されたペプチドボロン酸部分を含有する29 CRRsのライブラリーtutedベンゼン骨格は、インジケータ取り込み比色検出5,6を有するタンパク質を検出するために開発された。そのような設計では、各受容体は、糖タンパク質からのタンパク質の分化に補助ペプチドの腕の中で分散に基づいて、タンパク質、およびボロン酸との差動結合能を示した。より最近では、アニオン性蛍光ポリマーであるポリ（p-フェニレンエチニレン）（PPE）とコンジュゲートし、異なるカチオン性官能化された金ナノ粒子で構成された配列は、タンパク質7を検出し、識別するために作成されている。競争力のあるタンパク質のための別個の認識パターンを生成する、タンパク質分析物との結合を、蛍光を再生しPPE /金ナノ粒子複合体をクエンチした。本研究では、官能化ナノ粒子 - タンパク質相互作用は、ナノ粒子の末端基の物理化学的性質を変えることによって調整した。更に、このアプローチは、複雑で、タンパク質に富む培地中でタンパク質分析のために有効であることが示された生理学的に関連の濃度でヒト血清として、このように疾患状態8を診断するための実際のサンプルをプロファイリングにおけるETの可能性を示した。
非常に有望なものの、これらのシステムは、いくつかの固有の限界を有する。彼らは設計と非常に複雑な構造を有する5〜29 CRRsから合成することを必要とする。また、各測定以下リセットされる嗅覚系とは異なり、タンパク質の検出は、サンプルあたりのアレイを準備する必要である。最後に、リアルタイムの結合事象を監視することは極めて困難である。
この文脈において、コンビナトリアルアプローチは、異なる物理化学的特性を持つ単純かつ容易にアクセス可能な少数の分子用いて、提案された（中性、負に帯電した、正に荷電、親水性、疎水性、 等 。）ビルディングブロック（BBS）9として。変化させ、制御された割合でのBBを混合し、混合物はオングストロームの金表面上に自己集合させることによりプリズムは、タンパク質を結合するための適切なプロパティをフィーチャーしたコンビナトリアル表面の配列が作成されました。注目すべきことに、このシステムの自己組織化単分子膜を迅速かつ効率的に製造することが、多様な組み合わせの交差反応性受容体（CoCRRs）を有効に、高度に分岐した方法で表面特性の範囲を簡単にチューニングを可能にする。タンパク質検出は、光学検出システムは、表面プラズモン共鳴画像（のSPRi）を用いて行った。簡単に説明すると、LEDからのブロードビーム単色偏光がプリズムの表面の全体CoCRRアレイ領域を照明する。高解像度のCCDビデオカメラがCoCRRアレイの全てのスポットにわたってリアルタイムの差分画像を提供する。それは、結合事象と運動過程10に関する詳細な情報を提供するCoCRR·アレイの表面に局所的な変化のすべてをキャプチャします。一方、イメージングソフトウェアの助けを借りて、スポットに対応するSPR画像は、自動的に反射率versuの変化に変換されますセンサーグラムと呼ばれる運動結合曲線のシリーズを生成し、時間だ。したがって、のSPRiはラベルフリー、同期、並列を可能にし、結合事象のリアルタイム観察。さらに、得られたCoCRRアレイは、タンパク質分析のための再生可能及び再利用可能である。
このプロトコルは、ビルディングブロックとしてつだけ小分子を用いて電子舌の構築を記載しのSPRiで得られた連続的な認識パターンに基づいて、一般的なタンパク質の分析への応用を示している。
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Protocol
さまざまなソリューションおよびタンパク質サンプルの調製
- の50mMのNaH 2 PO 4、50mMのNaCl、およびpH6.8で10％グリセロールを含むリン酸緩衝溶液（PBS-G）を100mlを調製する。
- pH7.4の10mMのHEPES、150mMのNaCl、0.005％Tween20を含むHEPES緩衝溶液250mlを調製する。
- PBS-G中の0.2mmにラクトース（ 図1）硫酸化ビルディングブロック1（BB1）乳糖およびビルディングブロック2（BB2）のストック溶液を調製します。
- 500 nMの、1μMでミオグロビン、および500nmでのリゾチームで梗のhypogaeaレクチン （AHL）：HEPES中タンパク質溶液の1ミリリットルを準備します。
- 超純水に1％SDSの20ミリリットルを用意してください。
CoCRRアレイの作製
- これらの条件下で3分間プラズマクリーナーを使用する前に、プリズム48時間の金表面を清掃してください：75％酸素、25％アルゴン、0.6ミリバール、電力40 W。
- 11純粋および混合solutioを準備PBS-G 0.1mmの総BB濃度で10％刻みを0〜100％の間[BB1] /（[BB1] + [BB2]）比でBB1とBB2のナノ秒。
- 預金合計で44のスポット（ 図2）を用いて、各比率のために四連での非接触スポッターを用いて、プリズム面上でこれらの純粋および混合液の8 nlの液滴。
NOTE：PBS-Gで追加の10％グリセロールを溶媒蒸発と堆積後BB濃度の変化を低減するために非常に重要である。 - 超純水1mlを含むペトリ皿の内側にプリズムを配置し、金表面上のBB1とBB2の自己集合を室温でO / Nのままにします。ここでは、混合SAMの平均表面組成は、堆積混合溶液（ 図3）11の組成を反映しているものとする。
- 超純水で十分にプリズムを洗浄した後、アルゴン流の下でそれを乾燥させてください。
3タンパク質センシングのSPRiによる
- incubatoを設定rは、その中のSPRi装置は、タンパク質検出時の温度変化により誘導される屈折率の変化を避けるために25°Cに配置されている。
- 10μlのポリエーテルエーテルケトン（PEEK）における非官能すすぎプリズムは、コンピュータ制御されたシリンジポンプ、脱気装置及び6ポート中圧噴射弁（ 図4）に接続されたセルを流れる挿入する。たて濾過し、バッファー、HEPESを実行して脱気をフローシステムに入力します。
- すすぎプリズムを外し、フローセル中CoCRR配列を含むプリズムを挿入します。 100μL/分の流量で運転HEPES。 CCDカメラの助けを借りてすぐにランニングバッファーを通過させることによって、プリズム表面上に存在する任意の気泡を除去。
- 配列のよく対比画像上とのSPRiシステム内の統合されたソフトウェアの助けを借りて、ベースの関心領域に対して同じ径の円を描くことによって各スポットについての研究領域を定義します。
- 反映表すプラズモン曲線をトレース全てのスポットのための入射角の関数でivity曲線。
- 反射率曲線の最も高い傾斜で作動角（運動曲線が記録される位置）を選択します。反応速度測定のために選択された作業角度を固定するために走査ミラーを回転させます。
- 全てのスポットのための反射率信号が安定して一定になるまでフローシステムを通してHEPESを実行し続けます。
- 位置「負荷」での噴射弁とサンプルループ（500μl）の中に注射器で1ミリリットルAHL液を注入。次に、 "注射"を配置するために注入バルブを置く。全てのタンパク質の注射のために使用流量を100μl/分であった。
- 全てのスポットで同時に時間に対して反射率の変化を監視することにより、反応速度測定を開始します。
- タンパク質注射の終了時に、8分間のランニング緩衝液でアレイをすすぐ。最後に、それを再生するために1ミリリットル1％SDSを注入。
- 他のpに対して同じ手順を繰り返しますroteins。
4。データ処理と解析
- フローセルへの蛋白質溶液のエントリに続いて、分子結合が発生し、プラズモン曲線のシフト及び反射率の変化を誘導する。画像取得ソフトウェアは、センサーグラム（ 図5B）を得、SPR画像は、 図5Aを与え、スケールレベルを灰色に測定された光強度値を変換して、時間に対する反射率の変化を生成する。
- 各サンプルについて2D連続進化プロファイル（CEP）を生成する[BB1] /（[BB1] + [BB2]）比に対する各タンパク質の注入の終了時に反射率（R％）をプロットする数学計算ソフトウェアを使用した（ 図5C）。
- [BB1] /（[BB1] + [BB2]）センサーグラムにおける比率を追加します（ 図5B）は、各タンパク質（ 図5D）のための3D連続進化ランドスケープ（CEL）を生成する。
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Representative Results
一般的なタンパク質分析のための電子舌の能力を調べるために、3つのタンパク質を用いた：AHL、ミオグロビンおよびリゾチーム。 図6に示すように、各タンパク質について、異なる2D連続進化プロファイル、CEPは、他で生成された。
また、リアルタイムの吸着と脱着速度を監視することができるのSPRi、おかげで、各タンパク質についての3D連続進化ランドスケープ（CEL）と呼ばれる時間依存の連続的な認識パターンは、生成された。 図7に、これらの三つのタンパク質の特性資料集が示されている。
CoCRRアレイを調製するために、このプロトコルで使用される2つのビルディングブロックの1化学構造図。51901 / 51901fig1highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2の四重の各比率と非接触圧電スポッターを用いてBB1とBB2の純粋および混合液の液滴44を堆積した後、プリズムの写真。プリズムを1.5mlのエッペンドルフチューブの隣に配置した。
CoCRRアレイは、さまざまな比率でBB1とBB2の純粋および混合溶液を用いて調製した11の差動受容体を含有すると自己集合金シュール上にこれらの混合を可能にする図3。模式図プリズムの顔。
マイクロ流体システムと組み合わせるのSPRi検出システムの4模式図を図。
先進の電子舌で連続認識パターンの2種類を生成するためのデータ処理の図5模式図：2D連続進化プロファイルおよび3D連続進化風景。
図6 Continuouの進化プロファイル3つの純粋なタンパク質のための：AHL（500 nM）の、ミオグロビン（1μM）、およびリゾチーム（500 nM）のそれらは、[BB1対タンパク質注射の終了時に反射率（R％）での変化をプロットすることによって生成された] /（[BB1] + [BB2]）比。
味の図7風景：AHL、ミオグロビン、電子舌によって生成されたリゾチームの特徴的な3D設定資料集。
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Discussion
このeTとの建設のための最も重要なステップは、システムの良好な再現性を確保するために専念しています。例えば、BB1およびBB2の11の純粋および混合溶液中に10％グリセロールを添加すること、使用前に標準化された手順により、プリズムの金表面を洗浄するのBBは、プリズムの金表面上の自己組織化の際に溶媒の蒸発を排除するために、それぞれについて、複数の反復[BB1] /（[BB1] + [BB2]）比などを堆積させる。のSPRiによるタンパク質の検知については、作動角の選択が非常に重要です。通常、それは、反射率曲線の最も高い勾配に固定されている。また、このようなどの作業温度、流量などの各タンパク質の検出のための標準化された実験条件を使用することは非常に重要である。各タンパク質注入後、CoCRRアレイは、受容体へのダメージを与えることなく、システムの完全な再生を可能にする適切な溶液を用いて再利用のために再生成する必要があります。
開発されたETはだけでなく、以前に9に報告するだけでなく、一般的なタンパク質について、2つの非糖結合タンパク質ミオグロビンとリゾチームと1レクチンAHLを使用したとして、これらは結合タンパク質、糖の研究に有効であることを示すためにe_content "> HEPES（pH7.4）中の電荷の多様有するように選択した：。AHL（等電点（pI）6.0）、ミオグロビン（pIの7.2）及びリゾチーム（pIを11）を図6に示すように、注目すべきは、各タンパク質が固有に持っている応答パターンは、AHLわずかに負にHEPESに充電される。そのCEPは、それが負に帯電しBB2リッチCoCRRsとの強い相互作用を有することを示す。ほとんどの場合、タンパク質の正に荷電したドメインおよびBB2リッチCoCRRs間の相互作用によるものであるさらに高い濃度で、AHLとリゾチームのCEPはにCEPでのミオグロビンを比較する。HEPES中でグローバルに中性であるミオグロビン、の場合は、すべてのCoCRRsで得られた信号の間に大きな違いはありません。信号はずっとLOですWER。正にHEPESに充電されるリゾチームについては、最大シグナルは純粋BB2を含むCoCRRを得た。リアルタイムの吸脱着速度を監視することができるのSPRiの利点のおかげで、各タンパク質についての3D連続進化風景が生成された。時間依存性の認識パターンのこのようなタンパク質分析のための補助的な分化パラメータをもたらす。特に、CoCRRsのセットに対して同様の親和性を提示するが、相互作用の彼らの反応速度が異なる2つの検体を分析するために非常に有用である可能性があります。 図7に示すように、セル画は容易に識別可能である。これらの結果は、CoCRRsを有する3つのタンパク質の相互作用は、例えば、疎水性、中性及び荷電アミノ酸残基の分布などの、それらの表面特性に依存することを示している。 CEPとCELの両方は、タンパク質の識別および見込みのための「指紋」として使用することができ電性の識別。したがって、Etは共通のタンパク質の分析に有効である。
ここに記載されたプロトコルは、タンパク質分析のためのET構築するコンビナトリアルアプローチを使用しています。合成が構造的に複雑で面倒である分子の数を使用する他のアプローチとは異なり、唯一つの小さな分子は、本研究で良好な解像度を有するタンパク質を分化することができる交差反応性受容体配列を調製した。また、前回の調査によると、Etは、安定した再現性があり、9再利用可能である。さらに、のSPRiは、リアルタイムでの結合事象を監視し、これまでにない信頼性を有する新規な連続認識パターンを生成することができます。近い将来には、相補的な物理化学的特性を有する追加のBBは、液体中またはガス中の複雑な混合物の分析のためのアレイにおけるCoCRRの多様性を増加させるために導入される。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| Erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| Arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
References
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