Abstract
Genetisk sletning ved hjælp af Cre-Lox-system i transgene mus linjer er et kraftfuldt værktøj, der anvendes til at studere protein funktion. Men bortset fra i meget specifikke Cre-modeller, sletning af et protein gennem et væv eller celle population fører ofte til komplekse fænotyper som følge af flere interagerende mekanismer. Vurdering af, om en fænotype resultater fra afbrydelse af en celle autonom mekanisme, som er uløseligt forbundet med den pågældende celle, eller fra en ikke-celle autonom mekanisme, der ville følge af nedskrivning af denne celle miljø, kan være svært at få øje på. At få indsigt i proteinfunktion i en in vivo kontekst, utero elektroporation (IUE) gør gendeletion i en lille delmængde af celler i cortex udvikling eller en anden udvalgt område af hjernen. IUE kan bruges til at målrette specifikke områder i hjernen, herunder dorsale telencephalon, mediale telencephalon, hippocampus, eller ganglie eminence. Dette letter observation of konsekvenserne af celleautonom deletion gen i forbindelse med et sundt miljø. Målet med denne protokol er at vise, hvordan IUE kan bruges til at analysere en defekt i radial migration i en floxed transgene mus linje, med vægt på at skelne mellem celle autonome og ikke-celle selvstændige effekter af sletning protein. Ved at sammenligne den fænotype, der hidrører fra gen deletion i hele cortex versus IUE-medieret deletion gen i en begrænset cellepopulation, større indsigt i proteinfunktion i hjernens udvikling kan opnås end ved anvendelse af enten teknik i isolation.
Introduction
Radial migration er en central proces til tidlig kortikale udvikling. Det afhænger af en række celle autonome faktorer, såsom korrekt mitotisk udgang og neuronal differentiering, cellepolaritet, regulering af cytoskeletale dynamik og ekspression af transmembrane receptorer, såvel som ikke-celle autonome faktorer, såsom dannelse af den radiale glial stillads og sekretion af vandrende vejledning molekyler 1-3. Da afbrydelse af nogen af disse mekanismer kan forringe neuronal migration i en transgen musemodel 4-8, bestemme den underliggende årsag til en defekt i migration kan være en kompliceret og vanskelig proces. I livmoderen elektroporation (IUE) kan bruges til at supplere og forenkle fortolkning af fænotypen af en genetisk knock-out model og derved belyse vigtige mekanismer, der kræves til radial migration 7,9-11.
I livmoderen elektroporation (IUE) er den proces, hvorved et plasmid carryi ng både et gen af interesse og et reporter indsprøjtes i ventrikel i hjernen hos en mus eller rotte foster og derefter trukket ind i celler, der beklæder ventrikel ved anvendelse af en elektrisk strøm 12-14. Dette tillader investigator at analysere effekten af op eller nedregulering af et gen af interesse i udvikling eller funktion af elektroporerede neuroner. Efter IUE kan hjerner behandles til immunhistokemi 7,9-11, elektrofysiologi 15 eller cellekultur 16,17. Den største fordel ved IUE er, at der tillader meget specifik manipulation af genekspression. Endvidere kan IUE anvendes til at målrette en specifik region af hjernens udvikling gennem en rettet strøm (figur 2). IUE kan også anvendes til at målrette en specifik celletype ved injektion af plasmider, der bærer gener under kontrol af forskellige promotorer eller plasmid aktiveringssystemer (tetracyclin induceret genekspression er et eksempel) 10,18-21.
jove_content "> IUE kan anvendes i forbindelse med Cre-Lox-medieret gen excision systemet 7-9,11,22. kan et plasmid indeholdende et gen, der koder meddelelsen for Cre protein elektroporeret ind et foster homozygot for floxed allel ( hvor genet eller specifik DNA-regioner er flankeret af to loxP-sites for Cre-medieret DNA-rekombination). Cre vil derefter inducere rekombination af genet af interesse specifikt i elektroporerede neurale forstadier, generering af et knock-out af Floxed allele.The virkning protein knockdown på neural migration og udvikling inden for individuelle neuroner kan derefter undersøgt. Elektroporation af Cre inducerer rekombination i kun en lille population af påvirkede celler, der forlader den understøttende miljø intakt. I modsætning, vævsspecifik ekspression af Cre under kontrol af en celletype specifik promotor, forekommer i hele væv så både migrerer neuroblaster og det omgivende miljø kan blive påvirket. Således Juxtaposition af disse to tilgange kan afgøre, om en given migration defekt skyldes celle autonome eller celle ikke-selvstændige mekanismer. Defekt migration i både eksperimentelle systemer tyder på, at den observerede fænotype skyldes en celle autonom mekanisme; normal migration efter elektroporering af Cre med defekt migration på en vævsspecifik Cre model indikerer, at genet af interesse virker gennem en ikke-celleautonom mekanisme.IUE kan også anvendes til at udføre redning eksperimenter ved elektroporering potentielle interagerende gener i knock out dyr 7,9,10. For eksempel kunne en investigator forsøge at redde en migration fænotype i en transgen model ved elektroporere en downstream mål og bestemme, om migrationen defekt korrigeres i elektroporerede neuroner. Dette har den yderligere fordel, at en vellykket redning indikerer, at normal migration kan genoprettes ved at manipulere proteinekspression i en specifikke neuron, selvom det omgivende miljø stadig mangelfuld for målgenet. Igen, denne tilgang er mere tid og omkostningseffektiv end at krydse eller generere transgene linier, med den ekstra fordel af at fastslå, om den defekte mekanisme er celle autonom.
IUE kan bruges til at spore migrerende neuroner gennem elektroporering af et reporterplasmid i knock out embryoner (figur 4C). Da kun neuronerne foring ventriklen på tidspunktet for kirurgi er elektroporeret 17 kan IUE bruges til at følge de neuroner, der er født på et bestemt tidspunkt med den fordel visualisering af deres morfologi in vivo.
Endelig er det muligt at anvende IUE at målrette hjerneregioner som den mediale eller dorsale telencephalon, hippocampus eller ganglioniske eminence (figur 2). Det giver forskerne beføjelse til at undersøge genfunktion i et bestemt område uafhængig af komplikationer resultating fra protein knockdown i tilstødende bygninger.
Retinoblastoma protein (pRb), p107 og p130 omfatter lommen protein familie og er veletablerede regulatorer af cellecyklus exit. Men der er stigende tegn på, at disse proteiner også regulere cellecyklus uafhængige aspekter af neural udvikling. Som vi tidligere har vist, pRb og p107 spiller en afgørende rolle i både tangential 4,23 og radial migration 6. Her viser vi rollen af lommen protein familiemedlemmer pRb og p107 på neurale migration 6 at eksemplificere anvendelsen af in utero elektroporering af Cre i en transgen model. Sammenfattende IUE giver en kraftfuld måde at analysere celleautonom virkninger af gendeletion (eller overekspression). Når det kombineres med vævsspecifik knock out modeller kan IUE give yderligere oplysninger om de mekanismer, der styrer neurale migration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle forsøg blev godkendt af University of Ottawa Animal Care etiske udvalg, der tilslutter sig retningslinjerne fra den canadiske Rådet om Animal Care.
1. Pre-kirurgiske Forberedelse og materialer
- Plasmid Forberedelse:
- Forbered plasmider under anvendelse af Qiagen Megaprep ifølge producentens protokol. Inokulering mindst 400 ml LB-bouillon med transformerede bakterier at sikre et højt DNA udbytte og inkuberes natten over.
- Resuspender plasmid i 100-200 pi TE til en endelig koncentration på mindst 5 pg / pl. Alikvot DNA og opbevares ved -20 ° C. Hvis koncentrationen er for lav, ikke udfældes og resuspender da dette kan tilføje urenheder. Begynd forfra med en ny forberedelse.
- Før indgrebet, fortyndes et enkelt plasmid (Cre-GFP for eksempel) til 2 pg / pl i sterilt vand med 1 pi 0,1% (w / v) Fast Green farvestof per 10 eller 20 pi fortyndet plasmid løsning. Hvis GFPog genet af interesse, er co-elektroporeret på separate plasmider, injiceres GFP plasmid og plasmidet bærer genet af interesse i et forhold på 1: 4 for at maksimere sandsynligheden for, at alle celler er markeret med GFP co-elektroporeret med både plasmider.
- Træk glas mikrokapillære rør (1 mm ydre diameter - herefter benævnt nåle) på en standard nål aftrækker, ved hjælp af et enkelt trin pull ved 62 ° C.
- Autoklaver en kirurgisk indeholder følgende: nål indehavere, sår retraktor, pincet, saks til kirurgi, sakse til nåle, hæftemaskine, hæfteklammer, gaze, sår covers, kirurgiske forhæng (figur 1A, B; Materialer Table).
- Saml andre nødvendige værktøjer: elektroporator, Femtojet Microinjecter, Tweezertrodes (5 eller 7 mm), saltvand, sutur, 5 ml sprøjte (Materialer tabel).
2. Forbered Mouse for Kirurgi
- For smertebehandling, indsprøjte en tidsindstillet-pregnant mus med buprenorphin (0,05 mg / kg legemsvægt) en time før kirurgi. Anvende denne protokol til mus timede overalt fra fosterdag 12,5 (E12.5) til E17.5.
- Brug microloader pipettespidser til back-load trak nåle med plasmidet løsning. Fyld ikke hele vejen ind i spidsen af nålen endnu, da dette vil medføre, at nålen bliver fyldt op.
- Bedøve mus ved hjælp af 2-5% isofluran gas med 1 L / min O 2. Når immobile, placeres i ansigtsmaske og anvende salve øjnene for at forhindre udtørring. Injicer med 1 ml saltvand (0,9% NaCl) subkutant i ryggen.
BEMÆRK: Når du arbejder med isofluran gas, brug en gas ådselsæder at generobre overskydende gas og forhindre den i at slippe ud i rummet. - Shave maven. Vask maven med Chlorohexadine krat, skylles med vand, og anvende en endelig prep opløsning af chlorohexadine og 70% ethanol. Cover mus med sterilt afdækningsstykke eller gaze til at dække pels, men lad maven eksponeret (figur 1C, D).
i livmoderen Elektroporation
- Lave et snit i huden over maven mellem de nedre patterne. Træk huden væk fra den underliggende muskel lag ved at rive bindevæv, derefter skære gennem peritoneum i bughulen langs linea alba. Sæt retraktoren såret for at trække kanterne af såret hinanden.
- Fjern livmoderen fra bughulen og lægge det ud som vist (Figur 1E).
- Hvis der er forskellige unger skal injiceres med forskellige plasmider (såsom GFP vs. GFP med genet af interesse), tælle hvalpene på hver side og beslutte hvilke og hvor mange at injicere hvert plasmid. Erstat den ene side af livmoderen tilbage i maven for at holde embryoner varm og smurt. Umiddelbart fugte den udsatte livmoderen med saltvand (helst opvarmes til kropstemperatur).
- Hvis injicere alle hvalpe med samme plasmid (som når indsprøjtning Cre-GFP i transgene embryoner) only fjerne en horn af livmoderen ad gangen.
- Sæt en indlæst nål i grebet leder af injektionen wand og forsigtigt skære spidsen med et par små kirurgiske saks eller fine pincet. Skær spidsen så nålen forbliver så længe som muligt, mens det stadig tillader væske at passere gennem (Figur 1Ji-IV).
- Juster længden på injektion (i sekunder) og indsprøjtning pres på mikroinjektor således at en lille, men let synlige dråbe af 0,1-0,2 pi vises på spidsen af nålen, når der trykkes foden padle. Hold lydstyrken på denne dråbe så konsekvent som muligt mellem forskellige nåle.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for embryo overlevelse (se diskussion). - Brug følgende injektion parametre for Femtojet: indsprøjtning tryk (PI) = 250-300 hPa; injektion (Ti) = 0,8-1,2 sek; kompensation tryk = 10-50 hPa. Om nødvendigt justere disse parametre til at rumme variation mellem nåle.
- Juster længden på injektion (i sekunder) og indsprøjtning pres på mikroinjektor således at en lille, men let synlige dråbe af 0,1-0,2 pi vises på spidsen af nålen, når der trykkes foden padle. Hold lydstyrken på denne dråbe så konsekvent som muligt mellem forskellige nåle.
- Svælger et foster og forsigtigt placere den på ryggen, hoved vippes opad (figur 1F).
BEMÆRK: Dette kan kræve at dreje eller flytte foster; være forsigtig med ikke at anvende for meget pres og undgå brud på fosterhinden, mens manipulere embryoet. - Når fosteret er på plads, skal du finde hjertekammer, der præsenterer som en halvmåne formet skygge parallelt med sagittale sinus. Tryk på spidsen af nålen til livmoderen over ventriklen ved en lille vinkel og før nålen gennem livmodervæggen. Mængden af tryk, der kræves, afhænger af skarpheden af nålen. Skub nålen gennem cortex i ventrikel.
BEMÆRK: Selvom der er sjældent nogen yderligere detekterbar modstand, fosterets hoved er ofte skubbet væk lidt og derefter viger som nålen passerer gennem cortex i ventriklen. - Pump foden padle at injicere plasmid løsning. Fortsæt med at pumpe indtil et grønt område er synligt og i overensstemmelse medbueform af ventriklen (figur 1G). Hos unge embryonerne (E12.5 til E14.5) farvestoffet vil ofte diffundere ind i den kontralaterale ventrikel.
BEMÆRK: Antallet af pumper afhænger af diameteren af nålespidsen, alder embryo (og resulterende størrelse af ventriklen) og injektionsvolumen ønskes. Hold volumen injiceres så konsekvent som muligt mellem embryoner. - Injicer tre eller fire fostre. Hold alle udsatte embryoner fugtige med saltvand under hele proceduren.
- Gå tilbage til den første embryoner injiceret og placere skovlene, således at den positive elektrode vil trække plasmidet i det ønskede område af hjernen (figur 1 H). Vinkel den negative elektrode, således at den korteste vej mellem elektroderne passerer direkte gennem strukturen målrettet til elektroporation (figur 2).
- Når skovlene er på plads, anvender stød. Afhængigt af alder og størrelsen af de embryoner, anvende 5 pulser af 35-50 V (se Tstand 1). Brug følgende elektroporation parametre: pulslængde af 5 msek med en puls interval på 950 ms. Gentag med alle injicerede embryoner.
- Skær spidsen af nye pre-loaded nål som i trin 3.3, da den sidste nål sandsynligvis tørret og tilstoppet under trin 3.9. Sprøjt det næste sæt af tre eller fire fostre med enten den samme plasmid eller en anden plasmid og derefter anvende det chok som i trin 3.9. Når alle hvalpe i den ene side af livmoderen injiceres, fjerne den anden side af livmoderen fra hunnens maven og derefter erstatte den færdige side til at holde den varm.
- Retur begge sider af livmoderen til den kvindelige sørge for at holde overfladen fugtig med saltvand og ikke at anvende for meget pres for at forhindre traume fosterhinde sække. Suturere muskel lag lukket ved hjælp af en simpel kontinuert søm. Staple huden lukket. Hvis hæfteklammer ikke er tilgængelige, suturere huden med en simpel afbrudt søm. (Figur 1I)
- Mens suturing, gradvist skrue ned for isofluran til at tillade den gravide kvindens anæstesi at lysne.
BEMÆRK: Dette vil fremskynde ophidselse af dæmningen efter operationen er færdig; holde kvindelige bedøvet så kort tid som muligt vil forbedre embryo overlevelse. Total kirurgi, der starter fra når hun først bedøvet, bør være ca. 30 min.
4. Efterbehandling
- Placer sutureres kvindelige i en inkubator eller på en varmepude til at komme sig anæstesi. Bed hende om ren strøelse og placere en standard opsving gel i buret opretholde væskebalancen. Til smertebehandling efter kirurgi, giver de kvindelige tre doser af buprenorphin (0,05 mg / kg legemsvægt) ved 8 timers intervaller efter operationen, derefter fire yderligere doser på 12 timers intervaller.
5. Høst Brains
BEMÆRK: Brains kan høstes på alle alderstrin op til voksenalderen. Følgende gældertil opsamling af hjerner før fødslen. Bemærk, at når ungerne er født, er rækkefølgen i livmoderen tabt, så enten hver hvalp i kuldet skal injiceres med det samme plasmid, eller en anden metode til at skelne mellem kontrol og forsøgsdyr skal udformes.
- Forbered kold (4 ° C), filtreret 4% paraformaldehyd (PFA) før euthanizing kvinde.
- Aflive kvindelige ved hjælp af en intraperitoneal injektion af en dødelig dosis af natriumpentobarbital (100 mg / kg legemsvægt) og skæres åbent abdomen. Træk begge sider af livmoderen og lægge ud som når ungerne blev oprindeligt injiceret.
- I tilfælde, hvor alle hvalpe fik det samme plasmid, såsom ved injektion Cre i en transgen kuld, embryo ordre er ikke vigtigt, derfor skåret livmoderen ud af hunnen og sted i PBS.
- Hvis ungerne blev injiceret med forskellige plasmider, skal du sørge for at finde hver hvalp, at bemærke eventuelle døde unger, og afgøre, hvilke der blev injiceret med kontrol og eksperimenterendeTal plasmider Inden du fjerner livmoderen fra hunnen. Vær omhyggelig med at holde styr på hvilke hvalp tilhører hvilken gruppe efter livmoderen er i PBS.
- Fjern hver hvalp individuelt halshugge med skarpe saks eller et barberblad og placere hovedet i PBS. I tilfælde af transgene mus, indsamle vævsprøver til genotypebestemmelse og holde hvert hoved separat, såsom i en 12-brønds plade.
- Under en dissekering omfang, fjerne hjernen fra kraniet, pas på ikke at nick cortex eller rive midterlinjen. Ved hjælp af et fluorescerende mikroskop, kontrollere, om hjerner har en GFP + patch, der angiver, at de blev elektroporeret med succes.
- Fix hjerner ved nedsænkning i PFA ved 4 ° C natten over.
BEMÆRK: Kontroller hjerner til ekspression af GFP før fiksering siden PFA ofte slukker signalet. - Cryoprotect hjerner gennem fordybelse i 20% saccharose i mindst tre dage før frysning. Brug en sucrosegradient på 10%, 15% og 20% (24 timer i hver opløsning) to forhindre vævsbeskadigelse som følge af det osmotiske tryk. Opbevar frosne hjerner ved -80 ° C og skåret på en kryostat på 10-14 um tykke sektioner.
6. Co-farvning med anti-GFP
BEMÆRK: Hvis antigen hentning er nødvendig for at co-pletten med anti-GFP, er det vigtigt at anvende en blid antigen hentning protokol, der ikke kompromitterer GFP signal. Nogle antigen hentning protokoller er for barsk at bruge sammen med GFP farvning (selv med et antistof mod GFP). En grundlæggende citronsyre forbehandling før påføring af det primære antistof er vellykket for de fleste epitoper 24.
- Lav en 0,01 M opløsning af citronsyre i Hedeselskabet 2 O. pH 6 under anvendelse af et kalibreret pH-meter.
- Heat citronsyre i farvningen kammer i mikrobølgeovn eller vandbad, indtil citronsyre når 75-80 ° C. Sæt dias i farvning kammer i 10-15 min. Oprethold temperaturen så stabil som muligt.
- Vask slides i PBS3x i 3 minutter ved stuetemperatur. Anvend det primære antistof og fortsætte med immunofarvning i henhold til en standard protokol.
- Godkend Cre-medieret udskæring ved co-mærkning for GFP og genet af interesse for at bekræfte vælte (figur 3A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To af de primære udfordringer i at udføre i livmoderen elektroporeringer er 1) at forebygge embryo dødelighed og 2) faldende variabilitet mellem elektroporeringer. En af de vigtigste faktorer i at forebygge dødelighed er nål kvalitet, som stumpe nåle påfører mere skade på fosteret. Ved skæring af nålen, holder spidsen så længe som muligt, mens det stadig tillader en synlig dråbe af 0,1-0,2 pi væske til at blive vist efter en pumpe af foden padle (Figur 1J). Hvis nålen er for kedelig eller akslen for kort, kan den resulterende vævsskade dræbe embryoet. Omvendt, hvis spidsen af nålen er for fin, vil det tage for lang tid at injicere tilstrækkelig plasmid volumen; forlader nålen i hjernen for længe årsager skader på grund af uundgåelige vibrationer af investigator hænder og små rotationer af fosteret. Desuden skal du bruge en microbeveler at lave nåle med en skarp, skrå tips til at gøre det muligt for injektioner i yngre, Mere skrøbelige embryoer, selv om dette ikke skulle være nødvendigt for embryoner E13.5 og ældre.
Stress niveau af den gravide kvinde er en anden central faktor, der påvirker embryo overlevelse. Jo højere dæmningen stressniveau, jo mere sandsynligt hun vil afbryde kuld. Af denne grund er det vigtigt at minimere anæstesi tid og ændre boliger så lidt som muligt før og efter operationen. Baggrunden stamme kan også påvirke stress niveau, og det kan være nødvendigt at udkrydsning kolonier udsat for angst onto en stamme såsom CD1, forudsat at fænotypen under undersøgelsen opretholdes over forskellige baggrunde stammer.
Den største enkeltstående begrænsning til IUE er for de variationer mellem elektroporeringer. Hver elektroporerede hjerne er anderledes på grund af variationer i injektionsvolumen, padle placering, padle kontakt og embryo alder. Da nåle er variable, er det ikke muligt at injicere et fast volumen - snarere undersøgteforskers skal svare til størrelsen af den grønne patch til at levere tilsvarende beløb til alle embryoer. Ligeledes fordi embryonet flydende i en væskefyldt sæk, er det ikke muligt systematisk at måle lokationen og orienteringen af skovlene over fosterets hoved, som er gjort for stereotaktiske injektioner. Endelig kan små forskelle i embryonale alder få væsentlig indvirkning på eksperimentelle resultater. Af denne grund anbefales sammenligning mellem kuld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 Square Wave Electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | Electroporator only – buy cables separately (45-0204) |
| 1250FS Footswitch for ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0211 | Foot paddle is necessary for hands-free electroporation |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 (5mm) 45-0488 (7mm) | Platinum forcep style electrodes |
| Femtojet | Eppendorf | 920010504 | Microinjector |
| Griphead 0 | Eppendorf | 920007414 | Holds the pulled needle |
| Universal Capillary Holder | Eppendorf | 920007392 | Connects griphead to tube |
| Injection Tube | Eppendorf | 920007431 | Connects capillary holder to Femtojet |
| Foot Control | Eppendorf | 920005098 | Foot paddle for hands-free injection |
| Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Tips for loading the pulled capillary tubes |
| Plasmid Mega Kit | Qiagen | 12181 | 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Non-toxic dye |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | For trimming the needles |
| Bonn Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Straight |
| Colibri Retractors | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Stapler | Fine Science Tools | 12031-07 | For 7mm clips |
| Castroviejo Needle Holder | Medical Tools | SNH-6737 | Straight, with lock |
| Needle Puller | Narishige | PC-10 | For pulling microcappillaries |
| Microcapillaries | Drummond | 1-000-800 | 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes |
References
- Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).
- Wu, Q., et al.
- McClellan, K. A., et al. Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions. Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).
- Nguyen, L., et al. P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex. Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).
- Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis. Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex. Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).
- Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse. Neural Dev. 6, (2011).
- Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors. J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).
- Heng, J. I., et al. Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2. Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).
- Alfano, C., et al. COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression. Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Dixit, R., et al. Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).
- Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro. Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Miyagi, S., et al. The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells. Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 Forthcoming.
- Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. 19, Suppl 1. 120-125 (2009).
- Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K.
- Ferguson, K. L., et al. A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration. EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).
- Lagace, D. C., et al. Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis. J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).
- Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons. J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).
- Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression. Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 Forthcoming.
- Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).
