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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

प्रोटीन विलोपन के प्रेरण के माध्यम से Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/51983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

Abstract

ट्रांसजेनिक माउस लाइनों में रचनात्मक-Lox प्रणाली का उपयोग कर जेनेटिक विलोपन प्रोटीन समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, बहुत विशिष्ट रचनात्मक मॉडल में, सिवाय एक ऊतक या सेल की आबादी के दौरान एक प्रोटीन का विलोपन अक्सर कई बातचीत तंत्र से उत्पन्न जटिल phenotypes के लिए जाता है। सवाल में, या कि सेल के पर्यावरण की हानि से नतीजा होगा जो एक गैर-सेल स्वायत्त तंत्र, से सेल के लिए स्वाभाविक है जो एक सेल स्वायत्त तंत्र के विघटन से एक phenotype परिणाम है, विचार करने के लिए मुश्किल हो सकता निर्धारण। गर्भाशय electroporation में, एक में विवो संदर्भ में प्रोटीन समारोह में जानकारी हासिल करने के लिए (IUE) के विकास कोर्टेक्स या कुछ अन्य चयनित मस्तिष्क क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं के एक छोटे सबसेट में जीन विलोपन सक्षम बनाता है। IUE पृष्ठीय telencephalon, औसत दर्जे का telencephalon, हिप्पोकैम्पस, या ganglionic श्रेष्ठता सहित विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस अवलोकन ओ की सुविधाएक स्वस्थ वातावरण के संदर्भ में सेल स्वायत्त जीन विलोपन के परिणामों एफ। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य IUE प्रोटीन विलोपन की सेल स्वायत्त और गैर-सेल स्वायत्त प्रभाव के बीच भेद पर एक जोर के साथ, एक floxed ट्रांसजेनिक माउस लाइन में रेडियल प्रवास में एक दोष का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे दिखाने के लिए है। मस्तिष्क के विकास में प्रोटीन समारोह में एक सीमित सेल की आबादी में IUE की मध्यस्थता जीन विलोपन बनाम पूरे कॉर्टेक्स के भीतर जीन विलोपन से उत्पन्न फेनोटाइप, अधिक से अधिक जानकारी की तुलना करके अलगाव में या तो तकनीक का उपयोग करके अधिक से प्राप्त किया जा सकता है।

Introduction

रेडियल प्रवास जल्दी कॉर्टिकल विकास के लिए एक केंद्रीय प्रक्रिया है। यह ऐसी सही mitotic बाहर निकलें और neuronal भेदभाव, सेल polarity, cytoskeletal गतिशीलता और transmembrane रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति के नियमन, साथ ही इस तरह के रेडियल glial पाड़ के गठन के रूप में गैर-सेल स्वायत्त कारक है, और के रूप में सेल स्वायत्त कारकों की एक किस्म पर निर्भर करता है प्रवासी मार्गदर्शन के स्राव को 1-3 अणु है। इन तंत्रों में से किसी के विघटन के बाद से एक जटिल और कठिन प्रक्रिया हो सकती प्रवास में एक दोष के मूल कारण का निर्धारण, एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल 4-8 में neuronal प्रवास ख़राब कर सकते हैं। Utero electroporation (IUE) में पूरक और सरल बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जिससे एक आनुवंशिक नाक आउट मॉडल के phenotype और की व्याख्या रेडियल प्रवास 7,9-11 के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण तंत्र को स्पष्ट।

गर्भाशय electroporation में (IUE) की प्रक्रिया है जो एक प्लाज्मिड carryi द्वारा ब्याज की एक जीन और एक पत्रकार के दोनों एनजी एक माउस या चूहा भ्रूण के मस्तिष्क में निलय में इंजेक्शन और फिर एक विद्युत प्रवाह 12-14 के उपयोग के माध्यम वेंट्रिकल परत कोशिकाओं में तैयार की है। इस अन्वेषक ऊपर या विकास या electroporated न्यूरॉन्स के समारोह में ब्याज की एक जीन के नियमन के नीचे के प्रभाव का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। IUE के बाद, दिमाग immunohistochemistry के 7,9-11, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी 15 या सेल संस्कृति 16,17 के लिए कार्रवाई की जा सकती है। IUE का प्रमुख लाभ यह है कि जीन की अभिव्यक्ति की अत्यधिक विशिष्ट हेरफेर के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, IUE एक निर्देशित वर्तमान (चित्रा 2) के माध्यम से विकासशील मस्तिष्क के एक विशेष क्षेत्र को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। IUE भी विभिन्न प्रमोटरों या प्लाज्मिड सक्रियण प्रणालियों के नियंत्रण के तहत जीन ले जाने plasmids के इंजेक्शन के माध्यम से एक विशेष सेल प्रकार लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 10,18-21 (टेट्रासाइक्लिन प्रेरित जीन अभिव्यक्ति एक उदाहरण है)।

> IUE Cre-Lox मध्यस्थता जीन छांटना प्रणाली 7-9,11,22 के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता jove_content "। Cre प्रोटीन के लिए संदेश एन्कोडिंग एक जीन से युक्त एक प्लाज्मिड floxed एलील के लिए एक भ्रूण समयुग्मक (में electroporated किया जा सकता है जिसमें जीन या विशिष्ट डीएनए क्षेत्रों Cre मध्यस्थता डीएनए पुनर्संयोजन के लिए दो loxP साइटों) द्वारा flanked कर रहे हैं। Cre तो विशेष रूप से electroporated तंत्रिका व्यापारियों के हित में जीन के पुनर्संयोजन प्रेरित करेगा, के floxed allele.The प्रभाव की एक दस्तक बाहर पैदा करने तंत्रिका प्रवास और व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के भीतर विकास पर पछाड़ना प्रोटीन तो अध्ययन किया जा सकता है। Cre के electroporation बरकरार समर्थन कर पर्यावरण छोड़ रहा है, प्रभावित कोशिकाओं का केवल एक छोटी सी आबादी में पुनर्संयोजन लाती है। इसके विपरीत, विशिष्ट एक सेल प्रकार के नियंत्रण के तहत Cre के ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रमोटर, पूरे ऊतक भर में होता है दोनों ओर पलायन neuroblasts और आसपास के वातावरण को प्रभावित किया जा सकता है। इस प्रकार, jux इसलिएइन दो दृष्टिकोणों के taposition एक दिया प्रवास दोष स्वायत्त या सेल गैर स्वायत्त तंत्र सेल की वजह से है कि क्या यह निर्धारित कर सकते हैं। दोनों प्रयोगात्मक सिस्टम में दोषपूर्ण प्रवास से पता चलता है कि एक सेल स्वायत्त तंत्र से मनाया फेनोटाइप परिणाम है कि; एक ऊतक विशिष्ट रचनात्मक मॉडल में दोषपूर्ण प्रवास के साथ रचनात्मक की electroporation निम्नलिखित सामान्य प्रवास हित के जीन एक गैर सेल स्वायत्त तंत्र के माध्यम से काम कर रहा है कि इंगित करता है।

IUE भी बाहर दस्तक जानवरों 7,9,10 में संभावित बातचीत जीन electroporating से बचाव प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक अन्वेषक एक बहाव के लक्ष्य electroporating और प्रवास दोष electroporated न्यूरॉन्स में ठीक किया जाता है तो निर्धारित करने से एक ट्रांसजेनिक मॉडल में एक प्रवास फेनोटाइप बचाव करने का प्रयास कर सकता है। यह एक सफल बचाव सामान्य प्रवास एक विशेष में प्रोटीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ से बहाल किया जा सकता है कि इंगित करता है कि अतिरिक्त लाभ हैcific न्यूरॉन, आसपास के वातावरण अभी भी लक्षित जीन के लिए की कमी है, भले ही। फिर, यह दृष्टिकोण और अधिक समय और दोषपूर्ण तंत्र सेल स्वायत्त है कि क्या निर्धारित करने के अतिरिक्त लाभ के साथ, ट्रांसजेनिक लाइनों को पार करने या पैदा करने की तुलना में लागत प्रभावी है।

IUE बाहर दस्तक भ्रूण (चित्रा 4C) में एक संवाददाता प्लाज्मिड की electroporation के माध्यम से न्यूरॉन्स पलायन को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सर्जरी के समय निलय अस्तर केवल न्यूरॉन्स 17 electroporated कर रहे हैं, IUE विवो में उनकी आकृति विज्ञान के दृश्य के लाभ के साथ एक विशिष्ट समय में पैदा हुआ न्यूरॉन्स का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

अंत में, यह इस तरह के औसत दर्जे का या पृष्ठीय telencephalon, हिप्पोकैम्पस या ganglionic श्रेष्ठता (चित्रा 2) के रूप में मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने IUE उपयोग करने के लिए संभव है। यह शोधकर्ताओं जटिलताओं परिणाम के एक विशिष्ट क्षेत्र स्वतंत्र में जीन समारोह की जांच करने की शक्ति देता हैपड़ोसी संरचनाओं में पछाड़ना प्रोटीन से आईएनजी।

रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (PRB), p107 और P130 जेब प्रोटीन परिवार शामिल है और अच्छी तरह से कोशिका चक्र से बाहर निकलें के नियामकों की स्थापना कर रहे हैं। हालांकि, इन प्रोटीनों भी तंत्रिका विकास की सेल चक्र स्वतंत्र पहलुओं को विनियमित है कि बढ़ती सबूत नहीं है। हम पहले से पता चला है के रूप में, PRB और p107 दोनों स्पर्शरेखा 4,23 और रेडियल प्रवास 6 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहाँ, हम एक ट्रांसजेनिक मॉडल में Cre के गर्भाशय electroporation में के उपयोग के उदाहरण देना करने के लिए तंत्रिका प्रवास 6 पर जेब प्रोटीन परिवार के सदस्यों PRB और p107 की भूमिका प्रदर्शित करता है। सारांश में, IUE जीन विलोपन (या overexpression) के सेल स्वायत्त प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है। मॉडल बाहर दस्तक विशिष्ट ऊतक के साथ संयुक्त, IUE तंत्रिका प्रवास को नियंत्रित तंत्र के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

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Protocol

नोट: सभी प्रयोगों पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों का पालन करने, ओटावा पशु की देखभाल आचार समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. पूर्व शल्य चिकित्सा की तैयारी और सामग्री

  1. प्लाज्मिड तैयारी:
    1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार क्विएज़न MegaPrep का उपयोग कर प्लास्मिड तैयार करें। एक उच्च डीएनए उपज सुनिश्चित करने और रातोंरात सेते तब्दील बैक्टीरिया के साथ लेग शोरबा के कम से कम 400 मिलीलीटर Innoculate।
    2. कम से कम 5 माइक्रोग्राम प्रति / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए 100-200 μl ते में Resuspend प्लाज्मिड। -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य डीएनए और दुकान। एकाग्रता भी कम है, तो वेग नहीं है और इस दोष को जोड़ सकते हैं के रूप में resuspend। एक नई तैयारी के साथ शुरू।
    3. सर्जरी से पहले, 0.1% पतला प्लाज्मिड समाधान के 10 या 20 μl प्रति (डब्ल्यू / वी) फास्ट ग्रीन डाई की एक μl साथ बाँझ पानी में दो माइक्रोग्राम प्रति / μl के लिए एक एकल प्लाज्मिड (उदाहरण के लिए रचनात्मक GFP) पतला। GFP हैंGFP के साथ चिह्नित सभी कोशिकाओं दोनों साथ-electroporated सह रहे हैं संभावना है कि अधिकतम करने के लिए 4: और ब्याज की जीन GFP प्लाज्मिड और एक के अनुपात में ब्याज की जीन ले जाने प्लाज्मिड इंजेक्षन, अलग प्लास्मिड पर सह-electroporated जा करने के लिए कर रहे हैं प्लास्मिड।
  2. 62 डिग्री सेल्सियस पर एक भी कदम पुल का उपयोग कर, एक मानक सुई खींचने पर - गिलास microcapillary ट्यूब (इसके बाद सुई के रूप में भेजा 1 मिमी बाहरी व्यास) खींचो।
  3. निम्नलिखित युक्त एक शल्य पैक आटोक्लेव: सुई धारकों, घाव प्रतिकर्षक, संदंश, सर्जरी के लिए कैंची, सुई के लिए कैंची, ऊन बेचनेवाला, स्टेपल, धुंध, घाव को शामिल किया गया, शल्य पर्दे (चित्रा 1 ए, बी, सामग्री तालिका)।
  4. अन्य आवश्यक उपकरण लीजिए: electroporator, Femtojet Microinjecter, Tweezertrodes (5 या 7 मिमी), खारा, सिवनी, 5 मिलीलीटर सिरिंज (सामग्री तालिका)।

2. सर्जरी के लिए माउस को तैयार

  1. दर्द प्रबंधन के लिए, एक समय-P इंजेक्षनएक घंटे की सर्जरी से पहले Buprenorphine (0.05 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के साथ प्रबल होनेवाला माउस। E17.5 करने के लिए भ्रूण दिन 12.5 (E12.5) से कहीं भी समय समाप्त हो चूहों को इस प्रोटोकॉल को लागू करें।
  2. बैक लोड करने के लिए microloader विंदुक युक्तियों का उपयोग करें प्लाज्मिड समाधान के साथ सुई खींच लिया। इस सुई भरा बनने के लिए कारण होगा के रूप में अभी तक सुई की नोक में सभी तरह से भर नहीं है।
  3. 1 एल / मिनट ओ 2 के साथ 2-5 isoflurane% गैस का उपयोग माउस चतनाशून्य। एक बार स्थिर, फेस मास्क में डाल दिया है और सुखाने को रोकने के लिए आंखों को मरहम लागू होते हैं। 1 मिलीलीटर खारा पीठ में (0.9% सोडियम क्लोराइड) subcutaneously साथ इंजेक्षन।
    नोट: isoflurane गैस के साथ काम करते हैं, तो अतिरिक्त गैस हटा देना और कमरे में भागने से रोकने के लिए एक गैस मेहतर का उपयोग करें।
  4. पेट दाढ़ी। , Chlorohexadine हाथ धोने के साथ पेट साफ पानी से कुल्ला, और chlorohexadine और 70% इथेनॉल के अंतिम प्रस्तुत करने का समाधान लागू होते हैं। बाँझ कपड़ा या धुंध के साथ कवर माउस फर कवर लेकिन पेट उजागर (चित्रा 1C, डी) छोड़ने के लिए।

utero electroporation में

  1. कम निपल के बीच पेट पर त्वचा में एक चीरा बनाओ। संयोजी ऊतक फाड़ से दूर अंतर्निहित मांसपेशियों परत से त्वचा खींचो, तो linea अल्बा के साथ उदर गुहा में पेरिटोनियम माध्यम से काटा। अलग घाव के किनारों को खींचने के लिए घाव प्रतिकर्षक डालें।
  2. उदर गुहा से गर्भाशय निकालना और दिखाया (चित्रा 1E) के रूप में इसे बाहर रखना।
    1. अलग पिल्ले (जैसे ब्याज की जीन के साथ GFP बनाम GFP के रूप में) अलग plasmids के साथ इंजेक्शन जा रहे हैं, हर तरफ पिल्ले गिनती और प्रत्येक प्लाज्मिड के साथ कितने इंजेक्षन करने के लिए जो लोगों को और फैसला। वापस गर्म और चिकनाई भ्रूण रखने के लिए पेट में गर्भाशय के एक तरफ बदलें। इसके तत्काल बाद नमक के साथ उजागर गर्भाशय (अधिमानतः शरीर के तापमान पर गरम) गीला करना।
    2. एक ही प्लाज्मिड के साथ सभी पिल्ले इंजेक्शन लगाने अगर onl (जैसे कि ट्रांसजेनिक भ्रूण में रचनात्मक-GFP के इंजेक्शन लगाने के रूप में जब)Y एक समय में गर्भाशय के एक सींग हटा दें।
  3. छोटे शल्य कैंची या ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ टिप कटौती ध्यान से इंजेक्शन की छड़ी की चपेट सिर में एक भरी हुई सुई रखो और। अभी भी तरल पदार्थ (चित्रा 1Ji-चतुर्थ) के माध्यम से पारित करने की अनुमति है, जबकि सुई के रूप में लंबे समय के रूप में संभव रहता है तो टिप काटें।
    1. पैर पैडल दबाया जाता है जब 0.1-0.2 μl के एक छोटे से अभी तक आसानी से दिखाई छोटी बूंद सुई की नोक पर दिखाई देता है, ताकि microinjector पर (सेकंड में) इंजेक्शन की लंबाई और इंजेक्शन के दबाव को समायोजित करें। अलग सुइयों के बीच संभव के रूप में लगातार इस छोटी बूंद की मात्रा रखें।
      नोट: इस चरण भ्रूण अस्तित्व (चर्चा देखें) के लिए महत्वपूर्ण है।
    2. Femtojet के लिए निम्नलिखित इंजेक्शन मापदंडों का उपयोग करें: दबाव इंजेक्शन लगाने (पीआई) = 250-300 इंच; इंजेक्शन समय (तिवारी) = 0.8-1.2 सेकंड; मुआवजा दबाव = 10-50 इंच। यदि आवश्यक हो, सुइयों के बीच भिन्नता को समायोजित करने के लिए इन मापदंडों को समायोजित।
  4. एसएक भ्रूण का चुनाव और धीरे से अपनी पीठ, ऊपर की ओर झुका हुआ सिर (चित्रा 1F) पर यह स्थिति।
    नोट: यह मोड़ या भ्रूण स्थानांतरण की आवश्यकता हो सकती; बहुत अधिक दबाव लागू करते हैं और भ्रूण जोड़ तोड़ जबकि एमनियोटिक थैली का टूटना से बचने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  5. भ्रूण जगह में है एक बार, बाण के समान साइनस के लिए एक अर्द्ध चंद्राकार आकार छाया समानांतर रूप में प्रस्तुत करता है, जो निलय, की स्थिति जानें। एक मामूली कोण पर निलय से ऊपर गर्भाशय को सुई की नोक टच और गर्भाशय की दीवार के माध्यम से सुई गाइड। आवश्यक दबाव की राशि सुई के तीखेपन पर निर्भर करता है। वेंट्रिकल में कॉर्टेक्स के माध्यम से सुई पुश।
    नोट: शायद ही कभी किसी भी अतिरिक्त पता लगाने योग्य प्रतिरोध है हालांकि, भ्रूण के सिर अक्सर थोड़ा दूर धकेल दिया जाता है और फिर सुई वेंट्रिकल में कॉर्टेक्स के माध्यम से गुजरता के रूप में recoils।
  6. प्लाज्मिड समाधान इंजेक्षन करने के लिए पैर पैडल पम्प। हरे रंग की जगह दिखाई देता है और के अनुरूप जब तक पंप जारीवेंट्रिकल (चित्रा 1G) की चाप आकार। युवा भ्रूण (E14.5 को E12.5) में डाई अक्सर contralateral वेंट्रिकल में फैलाना होगा।
    नोट: पंपों की संख्या सुई टिप के व्यास पर निर्भर करता है, भ्रूण (और निलय के परिणामस्वरूप आकार) और इच्छित इंजेक्शन की मात्रा की उम्र। मात्रा रखें भ्रूण के बीच संभव के रूप में लगातार इंजेक्शन।
  7. तीन या चार भ्रूण इंजेक्षन। प्रक्रिया के दौरान नमक के साथ नम सभी उजागर भ्रूण रखें।
  8. वापस इंजेक्शन के पहले भ्रूण के पास जाओ और सकारात्मक इलेक्ट्रोड मस्तिष्क (चित्रा 1H) के वांछित क्षेत्र में प्लाज्मिड आकर्षित करेगा कि इस तरह पैडल जगह है। कोण नकारात्मक इलेक्ट्रोड इतना है कि इलेक्ट्रोड के बीच कम से कम पथ electroporation के लिए लक्षित संरचना (चित्रा 2) के माध्यम से सीधे गुजरता है।
  9. पैडल जगह में हैं एक बार, सदमे लागू होते हैं। भ्रूण की उम्र और आकार पर निर्भर करता है, 35-50 वी के 5 दालों का उपयोग (टी देखनासक्षम 1)। निम्नलिखित electroporation के मापदंडों का उपयोग करें: 5 मिसे की नब्ज लंबाई 950 मिसे के एक नाड़ी अंतराल के साथ। सभी इंजेक्शन भ्रूण के साथ दोहराएँ।
  10. पिछले सुई की संभावना सूखे और कदम 3.9 दौरान भरा रूप में कदम 3.3 में के रूप में नए पूर्व लोड सुई की नोक काटें। एक ही प्लाज्मिड या एक अलग प्लाज्मिड के साथ या तो तीन या चार भ्रूण के अगले सेट इंजेक्षन और फिर कदम 3.9 में के रूप में सदमे लागू होते हैं। गर्भाशय के एक तरफ के सारे पिल्ले इंजेक्ट कर रहे हैं, जब महिला के पेट से गर्भाशय के दूसरे पक्ष को हटाने और फिर गर्म रखने के लिए यह पूरा पक्ष की जगह।
  11. एमनियोटिक थैलियों को आघात को रोकने के लिए बहुत अधिक दबाव लागू करने के लिए नमक के साथ और नहीं नम सतह रखने के लिए सावधान किया जा रहा महिला को गर्भाशय के दोनों ओर लौटें। एक साधारण निरंतर सिलाई का उपयोग कर बंद कर दिया पेशी परत सीवन। स्टेपल त्वचा बंद कर दिया। स्टेपल उपलब्ध नहीं हैं, तो एक साधारण बाधित सिलाई के साथ त्वचा सीवन। (चित्रा 1 मैं)
  12. Suturi जबकिएनजी, उत्तरोत्तर गर्भवती महिला की संज्ञाहरण हल्का करने के लिए अनुमति देने के लिए isoflurane के नीचे बारी।
    नोट: सर्जरी के पूरा होने के बाद इस बांध की कामोत्तेजना को शीघ्र होगा; भ्रूण अस्तित्व में सुधार होगा जितना संभव हो कम एक समय के लिए anesthetized मादा रखते हुए। कुल सर्जरी समय, महिला पहले anaesthetized है जब से शुरू, लगभग 30 मिनट का होना चाहिए।

4. Aftercare

  1. एक मशीन में या संज्ञाहरण से उबरने के लिए एक हीटिंग पैड पर sutured महिला रखें। साफ बिस्तर पर उसके बिस्तर और पिंजरे में एक मानक वसूली जेल जलयोजन बनाए रखने के लिए जगह है। सर्जरी के बाद दर्द प्रबंधन के लिए, तो सर्जरी के बाद 8 घण्टे के अंतराल, 12 घंटा के अंतराल पर चार अतिरिक्त खुराक पर Buprenorphine (0.05 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) की महिला तीन खुराक दे।

5. फसल काटने दिमाग

नोट: दिमाग वयस्कता के लिए किसी भी उम्र में ही काटा जा सकता है। निम्नलिखित लागू होता हैजन्म से पहले दिमाग को इकट्ठा करने के लिए। पिल्ले पैदा होते हैं, एक बार गर्भाशय के भीतर आदेश कूड़े में हर पिल्ला या तो एक ही प्लाज्मिड इंजेक्शन के साथ किया जाना चाहिए ताकि, खो दिया है, या नियंत्रण और प्रायोगिक पशुओं के बीच फर्क का एक और तरीका तैयार किया जाना चाहिए कि ध्यान दें।

  1. ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) तैयार करें, महिला euthanizing करने से पहले 4% paraformaldehyde (पीएफए) फ़िल्टर्ड।
  2. सोडियम pentobarbital (100 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के एक घातक खुराक की intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग कर महिला euthanize और खुला पेट काटा। गर्भाशय के दोनों पक्षों के बाहर खींचो और पिल्ले शुरू में इंजेक्शन थे जब के रूप में बाहर रखना।
    1. सभी पिल्ले इस तरह के एक ट्रांसजेनिक कूड़े में रचनात्मक इंजेक्शन लगाने के रूप में जब एक ही प्लाज्मिड, प्राप्त जहां मामले में, भ्रूण आदेश इसलिए पीबीएस में महिला और जगह से बाहर गर्भाशय में कटौती, महत्वपूर्ण नहीं है।
    2. पिल्ले अलग plasmids के साथ इंजेक्शन थे, तो किसी भी मर पिल्ले टिप्पण, प्रत्येक पिल्ला का पता लगाने के लिए सुनिश्चित हो, और नियंत्रण और experimen इंजेक्शन के साथ थे जो लोगों का निर्धारणमहिला से गर्भाशय निकालने से पहले ताल प्लास्मिड। पिल्ला गर्भाशय पीबीएस में है जो समूह के बाद अंतर्गत आता है जो का ट्रैक रखने के लिए सावधान रहें।
  3. व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक पिल्ला निकालें तेज कैंची या एक धार के साथ सिर काटना और पीबीएस में सिर जगह है। ट्रांसजेनिक चूहों के मामले में, जीनोटाइपिंग के लिए ऊतकों के नमूनों को इकट्ठा करने और इस तरह के एक 12 अच्छी तरह से थाली में के रूप में, अलग प्रत्येक सिर रखने के लिए।
  4. एक विदारक गुंजाइश के तहत, नहीं निक के लिए सावधान किया जा रहा, खोपड़ी से कोर्टेक्स मस्तिष्क हटाने या midline के आंसू। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, वे सफलतापूर्वक electroporated गया यह दर्शाता है कि दिमाग के एक GFP + पैच है देखने के लिए जाँच करें।
  5. रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर पीएफए ​​में विसर्जन से दिमाग को ठीक करें।
    नोट: पीएफए ​​अक्सर संकेत quenches के बाद से पूर्व निर्धारण करने के लिए GFP की अभिव्यक्ति के लिए दिमाग की जाँच करें।
  6. पूर्व ठंड के लिए कम से कम तीन दिनों के लिए 20% sucrose में विसर्जन के माध्यम से Cryoprotect दिमाग। टी एक सूक्रोज 10% की ढाल, 15% और 20% (प्रत्येक समाधान में 24 घंटा) का प्रयोग करेंओ आसमाटिक दबाव की वजह से ऊतकों को नुकसान को रोकने के। -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए दिमाग की दुकान और 10-14 माइक्रोन मोटी वर्गों में एक cryostat पर काटा।

विरोधी GFP साथ 6. सह-धुंधला

नोट: प्रतिजन पुनर्प्राप्ति सह-दाग को विरोधी GFP के साथ क्रम में आवश्यक है, यह GFP संकेत समझौता नहीं करता है कि एक सज्जन प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल (यहां तक ​​कि GFP के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ) GFP के धुंधला के साथ संयोजन के रूप में उपयोग करने के लिए भी कठोर कर रहे हैं। पूर्व प्राथमिक एंटीबॉडी के आवेदन के लिए एक बुनियादी साइट्रिक एसिड पूर्व उपचार सबसे epitopes 24 के लिए सफल रहा है।

  1. DDH 2 ओ में साइट्रिक एसिड की एक 0.01 एम समाधान करें एक calibrated पीएच मीटर का उपयोग करने के लिए 6 पीएच।
  2. साइट्रिक एसिड होता है, जब तक माइक्रोवेव या नहाने के पानी में धुंधला चैम्बर में हीट साइट्रिक एसिड 75-80 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है। 10-15 मिनट के लिए धुंधला चैम्बर में स्लाइड्स रखो। संभव के रूप में स्थिर के रूप में तापमान बनाए।
  3. पीबीएस में स्लाइड्स धो लें3x कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए। प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करें और एक मानक प्रोटोकॉल के अनुसार immunostaining के साथ आगे बढ़ना।
  4. (चित्रा 3A) नीचे दस्तक पुष्टि करने के लिए GFP के लिए सह-लेबलिंग और ब्याज की जीन द्वारा रचनात्मक मध्यस्थता छांटना मान्य है।

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Discussion

गर्भाशय electroporations में प्रदर्शन में प्राथमिक चुनौतियों में से दो भ्रूण मारक और 2) electroporations के बीच परिवर्तनशीलता घटते रोकने) एक कर रहे हैं। कुंद सुई भ्रूण को और अधिक नुकसान दण्ड के रूप में मारक को रोकने में सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक, सुई गुणवत्ता है। सुई काटने जब ​​अभी भी पैर पैडल (चित्रा 1J) के एक पंप निम्नलिखित प्रकट करने के लिए तरल पदार्थ के 0.1-0.2 μl के एक दृश्य छोटी बूंद के लिए अनुमति देता है, जबकि लंबे समय के रूप में संभव के रूप टिप रहते हैं। सुई भी सुस्त है या शाफ्ट भी कम हैं, जिसके परिणामस्वरूप ऊतकों को नुकसान भ्रूण को मार सकता है। सुई की नोक भी ठीक है अगर इसके विपरीत, यह पर्याप्त प्लाज्मिड मात्रा इंजेक्षन करने के लिए भी लंबे समय ले जाएगा; कारण अन्वेषक के हाथों की अपरिहार्य कंपन और भ्रूण की मामूली rotations करने के लिए भी लंबे समय के कारणों की क्षति के लिए मस्तिष्क में सुई जा रही है। इसके अलावा, युवा में इंजेक्शन की अनुमति के लिए एक तेज, beveled सुझावों के साथ सुई बनाने के लिए एक microbeveler उपयोग, और अधिक नाजुक भ्रूण, इस भ्रूण E13.5 और पुराने के लिए आवश्यक नहीं होना चाहिए, हालांकि।

गर्भवती महिला के तनाव के स्तर भ्रूण अस्तित्व को प्रभावित करने वाले एक अन्य महत्वपूर्ण कारक है। उच्च बांध के तनाव का स्तर, अधिक संभावना है कि वह कूड़े को रद्द कर देगा। इस कारण यह संज्ञाहरण समय को कम करने और पहले और सर्जरी के बाद संभव के रूप में छोटे रूप में आवास बदलने के लिए महत्वपूर्ण है। पृष्ठभूमि तनाव भी तनाव के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं और यह जांच के तहत फेनोटाइप अलग पृष्ठभूमि उपभेदों भर में बनाए रखा है यह सोचते हैं कि इस तरह के CD1 के रूप में एक तनाव पर चिंता करने के लिए प्रवण outcross कालोनियों के लिए आवश्यक हो सकता है।

IUE के लिए एक सबसे बड़ी सीमा electroporations के बीच निहित परिवर्तनशीलता है। प्रत्येक electroporated मस्तिष्क की वजह से इंजेक्शन की मात्रा, चप्पू स्थान, चप्पू से संपर्क करें और भ्रूण उम्र में बदलाव करने के लिए अलग है। सुइयों चर रहे हैं, यह एक निश्चित मात्रा इंजेक्षन करने के लिए संभव नहीं है - बल्कि जांचtigator सभी भ्रूण को समान मात्रा में वितरित करने के लिए हरे रंग पैच का आकार लगभग चाहिए। भ्रूण एक तरल पदार्थ भरा थैली में तैर रही है क्योंकि स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के लिए किया जाता है के रूप में इसी तरह, यह व्यवस्थित भ्रूण के सिर पर paddles के स्थान और अभिविन्यास को मापने के लिए संभव नहीं है। अंत में, भ्रूण उम्र में मामूली अंतर प्रयोगात्मक परिणामों पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है। इस कारण से, littermates के बीच तुलना की सिफारिश की है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Square Wave Electroporator BTX Harvard Apparatus 45-0052 Electroporator only – buy cables separately (45-0204)
1250FS Footswitch for ECM 830 BTX Harvard Apparatus 45-0211 Foot paddle is necessary for hands-free electroporation
Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0489 (5mm)         45-0488 (7mm) Platinum forcep style electrodes
Femtojet Eppendorf 920010504 Microinjector
Griphead 0 Eppendorf 920007414 Holds the pulled needle
Universal Capillary Holder Eppendorf 920007392 Connects griphead to tube
Injection Tube Eppendorf 920007431 Connects capillary holder to Femtojet
Foot Control Eppendorf 920005098 Foot paddle for hands-free injection
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Tips for loading the pulled capillary tubes
Plasmid Mega Kit Qiagen 12181 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252-5G Non-toxic dye
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 For trimming the needles
Bonn Strabismus Scissors Fine Science Tools 14084-09
Graefe Forceps Fine Science Tools 11050-10 Straight
Colibri Retractors Fine Science Tools 17000-03
Stapler Fine Science Tools 12031-07 For 7mm clips
Castroviejo Needle Holder Medical Tools SNH-6737 Straight, with lock
Needle Puller Narishige PC-10 For pulling microcappillaries
Microcapillaries Drummond 1-000-800 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 95, मस्तिष्क के विकास तंत्रिका प्रवास ट्रांसजेनिक स्वायत्त सेल माउस मॉडल
प्रोटीन विलोपन के प्रेरण के माध्यम से<em&gt; Utero में</em&gt; Electroporation ट्रांसजेनिक मॉडल में neuronal प्रवास में घाटे को परिभाषित करने के लिए
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Svoboda, D. S., Clark, A., Park, D.… More

Svoboda, D. S., Clark, A., Park, D. S., Slack, R. S. Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models. J. Vis. Exp. (95), e51983, doi:10.3791/51983 (2015).

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