Abstract
Genetisk radering med Cre-Lox-systemet i transgena möss linjer är ett kraftfullt verktyg som används för att studera proteiners funktion. Men utom i mycket speciella Cre-modeller, leder radering av ett protein genom en vävnad eller cellpopulation ofta komplexa fenotyper följd av flera samverkande mekanismer. Fastställande av huruvida en fenotyp beror avbrott i en cell självständig mekanism, som är inneboende i cellen ifråga, eller från ett icke-cell självständig mekanism, som skulle bli följden av nedskrivning av den cellens omgivning, kan vara svåra att urskilja. För att få inblick i proteinfunktion i en in vivo sammanhang i livmodern elektroporering (IUE) möjliggör gendeletion i en liten delmängd av celler inom utvecklings cortex eller någon annan vald hjärnregion. IUE kan användas för att inrikta sig på specifika områden i hjärnan, inklusive rygg telencefalon, mediala telencephalon, hippocampus, eller ganglionär eminens. Detta underlättar observation of konsekvenserna av cell autonoma gendeletion inom ramen för en sund miljö. Målet med detta protokoll är att visa hur IUE kan användas för att analysera en defekt i radiell migration i en floxed transgen mus linje, med betoning på att skilja mellan de cell autonoma och icke-cells autonoma effekter av protein radering. Genom att jämföra fenotypen följd av gendeletion inom hela cortex kontra IUE-medierad gendeletion i en begränsad cellpopulation, större insikt i proteinfunktion i hjärnans utveckling kan uppnås än genom att använda antingen teknik i isolering.
Introduction
Radial migration är en central process för tidig kortikal utveckling. Det beror på en rad olika cell autonoma faktorer, såsom korrekt mitotiska exit och neuronal differentiering, cell polaritet, reglering av cytoskelettala dynamik och uttryck av transmembranreceptorer, såväl som icke-cell autonoma faktorer, såsom bildandet av den radiella gliaceller schavotten och utsöndring av flyttande vägledning molekyler 1-3. Eftersom avbrott i någon av dessa mekanismer kan försämra neuronal migration i en transgen musmodell 4-8, bestämma den underliggande orsaken till en defekt i migration kan vara en komplicerad och svår process. I livmodern elektroporering (IUE) kan användas för att komplettera och förenkla tolkning av fenotyp av en genetisk knock-out-modellen och därmed klarlägga viktiga mekanismer som krävs för radiell migration 7,9-11.
I livmodern elektroporering (IUE) är den process genom vilken en plasmid carryi ng både en gen av intresse och en reporter injiceras i ventrikeln i hjärnan hos en mus eller råtta embryot och sedan dras in i cellerna som bekläder ventrikeln genom användning av en elektrisk ström från 12 till 14. Detta möjliggör för forskaren att analysera effekten av upp- eller nedreglering av en gen av intresse för utveckling eller funktion av electroporated neuroner. Efter IUE kan hjärnor behandlas för immunohistokemi 7,9-11, elektrofysiologi 15 eller cellodling 16,17. Den stora fördelen med IUE är som medger högspecifik manipulering av genuttryck. Vidare kan IUE användas för att rikta en särskild region i den växande hjärnan genom en riktad ström (Figur 2). IUE kan också användas för att rikta en specifik celltyp genom injektion av plasmider som bär gener under kontroll av olika promotorer eller plasmid aktiveringssystem (tetracyklin inducerad genuttryck är ett exempel) 10,18-21.
jove_content "> IUE kan användas tillsammans med Cre-Lox medierad gen excision systemet 7-9,11,22. En plasmid innehållande en gen som kodar meddelandet för Cre-proteinet kan elektroporation till ett embryo homozygot för floxade allelen ( , i vilken genen eller specifika DNA-regioner flankeras av två loxP-ställen för Cre-medierad DNA-rekombination). Cre kommer sedan framkalla rekombination av genen av intresse specifikt i elektroporerade neurala prekursorer, generering av en knock-out av floxed allele.The effekten av protein knockdown på neural migration och utveckling inom enskilda nervceller kan sedan studeras. Elektroporation av Cre inducerar rekombination i endast en liten population av drabbade cellerna och lämnar den stödjande miljön intakt. Däremot vävnadsspecifikt uttryck av Cre under kontroll av en celltyp specifik promotor, sker genom hela vävnaden så att både flyttande neuroblaster och omgivande miljö kan påverkas. Således Juxtaposition av dessa två metoder kan avgöra om en viss migration felet beror på cell autonoma eller cell icke-självständiga mekanismer. Defekt migration i både experimentella system tyder på att de observerade fenotyp resultaten från en cell självständig mekanism; normal migration efter elektroporering av Cre med defekt migrationen på ett vävnadsspecifikt Cre modell indikerar att genen av intresse agerar genom en icke-cell självständig mekanism.IUE kan också användas för att utföra räddningsförsök genom electroporating potentiella samverkande gener i knock out djur 7,9,10. Till exempel kan en utredare försöka rädda en migrations fenotyp i en transgen modell genom electroporating en nedströms mål och bestämma om migrations felet korrigeras i elektroporerade nervceller. Detta har den ytterligare fördelen att en framgångsrik räddnings indikerar att normal migration kan återställas genom att manipulera proteinuttryck i en specifik neuron, fastän den omgivande miljön är fortfarande bristfällig för den målsökta genen. Återigen, är detta synsätt mer tid och kostnadseffektivt än att korsa eller generera transgena linjer, med den extra fördelen att fastställa huruvida den defekta mekanismen är cell självständig.
IUE kan användas för att spåra migrera neuroner genom elektroporering av en reporter plasmid in knock out embryon (figur 4C). Eftersom endast de nervceller som kantar ventrikeln vid tiden för operationen är electroporated 17, kan IUE användas för att följa nervceller föds vid en viss tidpunkt med fördelen av visualisering av deras morfologi in vivo.
Slutligen är det möjligt att använda IUE att rikta hjärnregioner som den mediala eller rygg telencefalon, hippocampus eller ganglionär eminens (Figur 2). Detta ger forskarna befogenhet att undersöka geners funktion i ett visst område oberoende av komplikationer resultateting från protein knockdown i grann strukturer.
Retinoblastomprotein (pRb), p107 och p130 omfattar fickan protein familjen och är väl etablerade regulatorer av cellcykeln exit. Men det finns allt fler bevis för att dessa proteiner reglerar även cellcykel oberoende aspekter av neurala utveckling. Som vi tidigare har visat, pRb och p107 spelar en avgörande roll i både tangentiell 4,23 och radiell migration 6. Här visar vi rollen av fickprotein familjemedlemmar pRb och p107 på neural migration 6 för att exemplifiera användningen av i livmodern elektroporering av Cre i en transgen modell. Sammanfattningsvis ger IUE ett kraftfullt sätt att analysera cell autonoma effekter av gendeletion (eller överuttryck). I kombination med vävnadsspecifika slå ut modeller, kan IUE ge ytterligare information om de mekanismer som styr neural migration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla experiment godkändes av University of Ottawa Djurvård etiska kommitté, som ansluter sig till riktlinjerna för den kanadensiska rådet om Animal Care.
1. Förhands kirurgiska Förberedelser och Material
- Plasmidberedning:
- Förbered plasmider använder Qiagen Megaprep enligt tillverkarens protokoll. Ympa minst 400 ml LB-buljong med transformerade bakterier för att säkerställa en hög DNA-utbyte och inkubera över natten.
- Resuspendera plasmid i 100-200 ul TE till en slutlig koncentration av åtminstone 5 ug / ul. Alikvotera DNA och förvara vid -20 ° C. Om koncentrationen är alltför låg, inte utfällas och resuspendera eftersom detta kan lägga till föroreningar. Börja om med ett nytt preparat.
- Före operation, späd en enda plasmid (Cre-GFP till exempel) till 2 ug / ul i sterilt vatten med en pl av 0,1% (vikt / volym) Fast Green färgämne per 10 eller 20 | il av utspädd plasmidlösning. Om GFPoch genen av intresse är att vara co-elektroporeras på separata plasmider, injicera GFP plasmiden och plasmiden som bär genen av intresse i förhållandet 1: 4 för att maximera sannolikheten för att alla rutor markerade med GFP är co-electroporated med både plasmider.
- Dra glas microcapillary rören (1 mm ytterdiameter - nedan kallade nålar) på en vanlig nål avdragare, med hjälp av ett enda steg pull vid 62 ° C.
- Autoklav en kirurgisk förpackning innehåller följande: nålhållare, sår upprullningsdon pincett, sax för kirurgi, sax för nålar, häftapparat, häftklamrar, gasbinda, lindade omslag, operationsdukar (Figur 1A, B; Material tabell).
- Samla andra nödvändiga verktyg: elektroporator, Femtojet Microinjecter, Tweezertrodes (5 eller 7 mm), saltlösning, sutur, 5 ml spruta (Material tabell).
2. Förbered musen för kirurgi
- För smärtlindring, injicera en tidsinställd-pregnant mus med Buprenorfin (0,05 mg / kg kroppsvikt) en timme före operationen. Applicera detta protokoll till möss tidsinställda någonstans från embryonala dag 12,5 (E12.5) till E17.5.
- Använd micro pipettspetsar att backa-last drog nålar med plasmiden lösningen. Fyll inte hela vägen in i spetsen på nålen ännu eftersom detta kommer att göra att nålen blir igensatta.
- Söva musen med 2-5% isofluran gas med 1 l / min O2. När orörliga, placera i ansiktsmask och applicera salva till ögonen för att förhindra uttorkning. Spruta med 1 ml saltlösning (0,9% NaCl) subkutant i ryggen.
OBS: När du arbetar med isofluran gas, använd en gas renhållare att återta överflödig gas och hindra den från att komma ut i rummet. - Raka buken. Tvätta buken med Chlorohexadine scrub, skölj med vatten, och tillämpa en slutlig prep lösning av chlorohexadine och 70% etanol. Täck mus med steril duk eller gasbinda för att täcka päls men lämna buken exponerade (Figur 1C, D).
I livmodern elektroporation
- Gör ett snitt i huden över buken mellan de nedre spenarna. Dra bort från det underliggande muskelskiktet huden genom att riva bindväven, skär sedan genom bukhinnan i bukhålan längs linea alba. Sätt såret sårhaken att dra kanterna av såret isär.
- Ta livmodern från bukhålan och lägg ut den så som visas (Figur 1E).
- Om olika valpar ska injiceras med olika plasmider (såsom GFP vs GFP med genen av intresse), räkna valparna på varje sida och bestämma vilka och hur många som ska injicera med varje plasmid. Ersätt en sida av livmodern tillbaka in i buken för att hålla embryona varm och smörjas. Omedelbart fukta den exponerade livmodern med saltlösning (helst värmas till kroppstemperatur).
- Om injicera alla valpar med samma plasmid (t.ex. när du injicerar Cre-GFP in i transgena embryon) only avlägsna ett horn av livmodern vid en tidpunkt.
- Sätt en laddad nål i greppet huvudet av insprutnings trollspö och försiktigt skära spetsen med ett par små kirurgiska sax eller fin pincett. Skär spetsen så att nålen stannar så länge som möjligt och samtidigt tillåta vätska att passera (Figur 1Ji-iv).
- Justera längd injektion (i sekunder) och insprutningstrycket på microinjector så att en liten men lätt synlig droppe av 0,1-0,2 pl visas på nålspetsen när foten paddel trycks. Håll volymen av denna droppe så konsekvent som möjligt mellan olika nålar.
OBS: Detta steg är avgörande för embryoöverlevnad (se diskussion). - Använd följande injektionsparametrar för Femtojet: injicera tryck (pi) = 250-300 hPa; insprutningstiden (ti) = 0,8-1,2 sek; tryckkompensation = 10-50 hPa. Om det behövs, justera dessa parametrar för att rymma variation mellan nålar.
- Justera längd injektion (i sekunder) och insprutningstrycket på microinjector så att en liten men lätt synlig droppe av 0,1-0,2 pl visas på nålspetsen när foten paddel trycks. Håll volymen av denna droppe så konsekvent som möjligt mellan olika nålar.
- Svälja ett embryo och försiktigt placera den på rygg, huvud lutas uppåt (figur 1F).
OBS: Detta kan kräva att vrida eller flytta embryot; vara noga med att inte för mycket tryck och undvika bristning av fostersäcken samtidigt manipulera embryot. - När embryot är på plats, leta ventrikeln, som presenterar som en halvmåneformade skugga parallellt med sagittal sinus. Peka på nålspetsen till livmodern ovanför ventrikeln i en liten vinkel och styra nålen genom livmoderväggen. Mängden tryck som behövs beror på skärpan i nålen. Tryck nålen genom cortex i ventrikeln.
OBS: Även om det finns sällan någon ytterligare detekterbara motstånd embryot huvud ofta knuffas bort något och sedan ryggar som nålen passerar genom cortex i ventrikeln. - Pumpa foten paddla att injicera plasmiden lösningen. Fortsätt att pumpa tills ett grönområde är synlig och överensstämmer medbågform av ventrikeln (figur 1G). I unga embryon (E12.5 till E14.5) färgämnet kommer ofta diffundera in i kontra ventrikeln.
OBS: Antalet pumpar beror på diametern hos nålspetsen, en ålder av embryot (och resulterande storleken av ventrikeln) och den önskade injektionsvolymen. Håll volymen injiceras så konsekvent som möjligt mellan embryon. - Injicera tre eller fyra embryon. Håll alla exponerade embryon fuktiga med saltlösning under hela proceduren.
- Gå tillbaka till de första embryon injicerade och placera paddlar på sådant sätt att den positiva elektroden kommer att dra plasmiden i den önskade regionen av hjärnan (figur 1 H). Vinkla den negativa elektroden så att den kortaste vägen mellan elektrod passerar direkt genom strukturen riktat för elektroporering (Figur 2).
- När paddlarna är på plats, applicera chocken. Beroende på ålder och storlek av embryona, använd 5 pulser av 35-50 V (se tkunna 1). Använd följande elektroporering parametrar: pulslängd av 5 ms med en pulsintervall på 950 ms. Upprepa med alla injicerade embryon.
- Skär toppen av nya förinstallerade nål som i steg 3.3 som den sista nålen troligen torkat och igensatt under steg 3.9. Injicera nästa uppsättning av tre eller fyra embryon med antingen samma plasmid eller en annan plasmid och sedan använda den chock som i steg 3.9. När alla valparna i den ena sidan av livmodern injiceras, ta bort den andra sidan av livmodern från honans mage och sedan ersätta den färdiga sidan för att hålla den varm.
- Återgå båda sidor av livmodern att den kvinnliga var noga med att hålla ytan fuktig med koksaltlösning och att inte för mycket tryck för att förhindra trauma fostersäckar. Sutur muskellagret stängs med en enkel kontinuerlig stygn. Staple huden stängd. Om märlor inte är tillgängliga, sutur huden med en enkel avbruten söm. (Figur 1I)
- Medan suturing, successivt dra ner isofluran att låta gravida kvinnor anestesi att lätta.
OBS: Detta kommer att påskynda upphetsning av dammen efter operationen är klar; hålla den kvinnliga sövd under en så kort tid som möjligt kommer att förbättra embryoöverlevnad. Total kirurgi tid, med början från när honan är först nedsövd, bör vara ca 30 min.
4. Eftervård
- Placera suture kvinnliga i inkubator eller på en värmedyna för att återhämta sig från anestesi. Bed henne på rena sängkläder och placera en standard återhämtning gel i buren upprätthålla hydrering. För smärtlindring efter operation, ge de kvinnliga tre doserna av Buprenorfin (0,05 mg / kg kroppsvikt) vid 8 h intervall efter operation, sedan ytterligare fyra doser med 12 timmars intervall.
5. Skörd Hjärnor
OBS: Brains kan skördas i alla åldrar upp till vuxen ålder. Följande gällerför att samla hjärnor före födseln. Observera att när valparna föds, är ordningen i livmodern förlorade, så antingen varje valp i kullen måste injiceras med samma plasmid, eller en annan metod för att skilja mellan kontroll och försöksdjur måste utformas.
- Förbered kall (4 ° C), filtrerades 4% paraformaldehyd (PFA) före euthanizing hona.
- Euthanize honan med hjälp av en intraperitoneal injektion av en dödlig dos av natriumpentobarbital (100 mg / kg kroppsvikt) och skär öppen buk. Dra ut båda sidor av livmodern och lägg ut som när valparna ursprungligen injiceras.
- I det fall där samtliga valpar erhöll samma plasmid, såsom vid injektion Cre i en transgen kull, är embryo ordning inte viktigt, därför skär livmodern ur den kvinnliga och plats i PBS.
- Om valpar injicerades med olika plasmider, se till att hitta varje valp, notera eventuella döda valpar, och avgöra vilka som injicerades med kontroll och experimental plasmider innan du tar bort livmodern från honan. Var noga med att hålla reda på vilka valpen tillhör vilken grupp efter livmodern är i PBS.
- Ta bort varje valp individuellt, halshugga med vass sax eller ett rakblad och placera huvudet i PBS. I fallet med transgena möss, ta vävnadsprover för genotypning och hålla varje huvud separat, såsom i en 12-brunnars platta.
- Enligt en dissekera omfattning, ta bort hjärnan från skallen, försiktigt så att inte nick cortex eller riva mittlinjen. Med hjälp av en fluorescerande mikroskop, kontrollera om hjärnor har en GFP + patch, vilket indikerar att de var elektro framgångsrikt.
- Fix hjärnor genom nedsänkning i PFA vid 4 ° C över natten.
OBS: Kontrollera hjärnor för uttryck av GFP före fixering sedan PFA släcker ofta signalen. - Cryoprotect hjärnor genom nedsänkning i 20% sackaros i minst tre dagar före frysning. Använd en sackarosgradient av 10%, 15% och 20% (24 h i varje lösning) to förhindra vävnadsskada på grund av osmotiska trycket. Förvara frysta hjärnor vid -80 ° C och skars på en kryostat vid 10-14 ^ m tjocka sektioner.
6. Samarbete färgning med anti-GFP
OBS: Om antigenåtervinning är nödvändigt för att samverka fläcken med anti-GFP, är det viktigt att använda en mild antigenåtervinning protokoll som inte kompromissar GFP signalen. Vissa antigen hämtning protokoll är för hårda för att använda tillsammans med GFP färgning (även med en antikropp mot GFP). En grundläggande citronsyra förbehandling före applicering av den primära antikroppen är framgångsrik för de flesta epitoper 24.
- Gör en 0,01 M lösning av citronsyra i ddHaO 2 O. pH till 6 med användning av en kalibrerad pH-mätare.
- Värme citronsyra i färgning kammare i mikrovågsugn eller vattenbad tills citronsyra når 75-80 ° C. Sätt glasen i färgning kammare för 10-15 min. Upprätt temperatur så stabil som möjligt.
- Tvätta diabilder i PBS3x under 3 min vid rumstemperatur. Applicera den primära antikroppen och fortsätta med immunfärgning enligt ett standardprotokoll.
- Validera Cre medierad excision genom samtidig märkning för GFP och genen av intresse att bekräfta slå ner (Figur 3A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Två av de viktigaste utmaningarna i att uppträda i livmodern electroporations är 1) förebygga embryoletalitet och 2) minska variationen mellan electroporations. En av de viktigaste faktorer för att förhindra dödlighet är nålen kvalitet, som trubbiga nålar fogar mer skada på embryot. Vid skärning av nålen, hålla spetsen så länge som möjligt samtidigt som man möjliggör en synlig droppe av 0,1-0,2 pl av vätska att framträda efter en pump av foten paddel (figur 1J). Om nålen är för tråkig eller axeln för kort, kan den resulterande vävnadsskada döda embryot. Omvänt, om nålspetsen är för fin, kommer det att ta för lång tid att injicera tillräckligt plasmid volym; lämnar nålen i hjärnan för länge orsakar skador på grund av oundvikliga vibrationer av utredarens händer och smärre rotationer av embryot. Dessutom använder en microbeveler att göra nålar med en skarp, avfasade tips för att tillåta injektioner i yngre, Mer ömtåliga embryon, även om detta inte skulle vara nödvändigt av embryon E13.5 och äldre.
Stressnivån hos gravida kvinnor är en annan viktig faktor som påverkar embryoöverlevnad. Ju högre dammens stressnivå, desto mer sannolikt att hon kommer att avbryta kullen. Av denna anledning är det viktigt att minimera anestesi tid och ändra bostäder så lite som möjligt före och efter operation. Bakgrunden stammen kan också påverka stress nivå och det kan vara nödvändigt att utparning kolonier benägna att ångest på en stam såsom CD1, förutsatt att fenotypen under utredning bibehålls över olika bakgrunds stammar.
Den enskilt största begränsningen till IUE är normala variationer mellan electroporations. Varje electroporated hjärnan är olika på grund av variationer i injektionsvolym, paddel placering, paddel kontakt och embryo ålder. Eftersom nålarna är variabel, är det inte möjligt att injicera en fast volym - snarare de undersöktigator måste approximera storleken på den gröna lappen att leverera liknande belopp till alla embryon. Likaså, eftersom embryot är flytande i en vätskefylld säck, är det inte möjligt att systematiskt mäta läget och riktningen för skovlarna över embryots huvudet, som är gjort för stereotaktiska injektioner. Slutligen kan små skillnader i embryonal ålder har betydande effekter på experimentella resultat. Av detta skäl är en jämförelse mellan kullsyskon rekommenderas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECM 830 Square Wave Electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | Electroporator only – buy cables separately (45-0204) |
| 1250FS Footswitch for ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0211 | Foot paddle is necessary for hands-free electroporation |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 (5mm) 45-0488 (7mm) | Platinum forcep style electrodes |
| Femtojet | Eppendorf | 920010504 | Microinjector |
| Griphead 0 | Eppendorf | 920007414 | Holds the pulled needle |
| Universal Capillary Holder | Eppendorf | 920007392 | Connects griphead to tube |
| Injection Tube | Eppendorf | 920007431 | Connects capillary holder to Femtojet |
| Foot Control | Eppendorf | 920005098 | Foot paddle for hands-free injection |
| Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Tips for loading the pulled capillary tubes |
| Plasmid Mega Kit | Qiagen | 12181 | 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Non-toxic dye |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | For trimming the needles |
| Bonn Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Straight |
| Colibri Retractors | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Stapler | Fine Science Tools | 12031-07 | For 7mm clips |
| Castroviejo Needle Holder | Medical Tools | SNH-6737 | Straight, with lock |
| Needle Puller | Narishige | PC-10 | For pulling microcappillaries |
| Microcapillaries | Drummond | 1-000-800 | 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes |
References
- Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).
- Wu, Q., et al.
- McClellan, K. A., et al. Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions. Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).
- Nguyen, L., et al. P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex. Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).
- Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis. Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex. Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).
- Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse. Neural Dev. 6, (2011).
- Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors. J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).
- Heng, J. I., et al. Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2. Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).
- Alfano, C., et al. COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression. Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Dixit, R., et al. Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).
- Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro. Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Miyagi, S., et al. The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells. Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 Forthcoming.
- Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. 19, Suppl 1. 120-125 (2009).
- Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K.
- Ferguson, K. L., et al. A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration. EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).
- Lagace, D. C., et al. Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis. J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).
- Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons. J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).
- Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression. Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 Forthcoming.
- Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).
