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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

L'induction de la protéine de suppression Grâce Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/51983
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

Abstract

Deletion génétique en utilisant le système Cre-Lox dans des lignées de souris transgéniques est un outil puissant utilisé pour étudier la fonction des protéines. Cependant, à l'exception des modèles Cre très spécifiques, la deletion d'une protéine dans l'ensemble d'une population de tissus ou de cellules conduit souvent à des phénotypes complexes résultant de l'interaction de plusieurs mécanismes. Déterminer si un phénotype résultats de perturbation d'un mécanisme autonome de la cellule, qui est intrinsèque à la cellule en question, ou d'un mécanisme autonome non-cellulaire, qui résulterait de la dépréciation de l'environnement de cette cellule, peuvent être difficiles à discerner. Pour mieux comprendre la fonction des protéines dans un contexte in vivo, in utero électroporation (IUE) permet la suppression de gène dans un petit sous-ensemble de cellules dans le cortex développement ou une autre région du cerveau sélectionné. IUE peut être utilisé pour cibler des zones spécifiques du cerveau, y compris le télencéphale dorsal, télencéphale médial, hippocampe, ou éminence ganglionnaire. Ceci facilite l'observation of les conséquences de cellule autonome deletion des gènes dans le contexte d'un environnement sain. L'objectif de ce protocole est de montrer comment IUE peut être utilisé pour analyser un défaut dans la migration radiale dans une lignée de souris transgéniques floxé, en mettant l'accent sur la distinction entre les effets cellulaires autonomes autonomes et non-cellulaire de la protéine suppression. En comparant le phénotype résultant de la délétion des gènes dans l'ensemble du cortex par rapport à deletion de gène à médiation par IUE dans une population de cellules limité, mieux comprendre la fonction des protéines dans le développement du cerveau peuvent être obtenus qu'en utilisant soit la technique de façon isolée.

Introduction

La migration radiale est un processus au cœur du développement cortical précoce. Il dépend de divers facteurs autonomes portables, tels que sortie correct mitotique et la différenciation neuronale, la polarité cellulaire, régulation de la dynamique du cytosquelette et l'expression de récepteurs transmembranaires, ainsi que des facteurs autonomes non cellulaires, tels que la formation de l'échafaudage gliale radial et la sécrétion d'orientation migratoire molécules 1-3. Depuis la perturbation de l'un de ces mécanismes peut nuire à la migration neuronale dans un modèle de souris transgénique 4-8, déterminer la cause sous-jacente d'un défaut dans la migration peut être un processus complexe et difficile. In utero électroporation (IUE) peut être utilisé pour compléter et simplifier interprétation du phénotype d'un modèle knock-out génétique et donc à élucider les mécanismes importants nécessaires pour la migration radiale 7,9-11.

In utero électroporation (IUE) est le processus par lequel un plasmide carryi ng à la fois un gène d'intérêt et un rapporteur est injectée dans le ventricule du cerveau d'un embryon de souris ou de rat, puis aspiré dans les cellules qui tapissent le ventricule par l'utilisation d'un courant électrique 14.12. Cela permet à l'enquêteur d'analyser l'effet de haut ou le bas régulation d'un gène d'intérêt dans le développement ou la fonction des neurones électroporation. Après IUE, cerveaux peuvent être traitées pour l'immunohistochimie 7,9-11, électrophysiologie 15 ou culture cellulaire 16,17. L'avantage majeur de l'IUE est qui est permet une manipulation très spécifique de l'expression génique. En outre, IUE peut être utilisé pour cibler une région spécifique du cerveau en développement à travers un courant dirigé (Figure 2). IUE peut également être utilisé pour cibler un type cellulaire particulier par l'injection des plasmides portant des gènes sous le contrôle de différents promoteurs ou des systèmes d'activation de plasmide (tetracycline induit l'expression du gène est un exemple) 10,18-21.

jove_content "> IUE peut être utilisé en conjonction avec le système d'excision à médiation par le gène Cre-Lox 7-9,11,22. Un plasmide contenant un gène codant pour la transmission pour la protéine Cre peut être une électroporation dans des embryons homozygotes pour l'allèle floxé ( dans lequel les régions de gènes ou d'ADN spécifique sont flanquées par deux sites loxP pour la Cre médiation par recombinaison de l'ADN). Cre alors induire une recombinaison du gène d'intérêt spécifiquement dans des précurseurs neuraux électroporation, la génération d'un knock-out de la floxée allele.The effet de protéines knockdown sur la migration neuronale et le développement dans les neurones individuels peut alors être étudié. électroporation de Cre induit recombinaison que dans une petite population de cellules touchées, laissant l'environnement soutien intact. En revanche, expression tissulaire spécifique de Cre sous le contrôle d'un type spécifique de cellules promoteur, se produit tout au long de l'ensemble du tissu de sorte que les deux neuroblastes en migration et le milieu environnant pourraient être affectées. Ainsi, juxtaposition de ces deux approches peut déterminer si un défaut de migration donné est due à la cellule mécanismes non autonomes ou autonomes cellulaires. Migration défectueux dans les deux systèmes expérimentaux suggèrent que les résultats de phénotype observé à partir d'un mécanisme autonome de cellules; migration normale après électroporation avec Cre de migration défectueux dans un modèle Cre spécifique des tissus indique que le gène d'intérêt agit par l'intermédiaire d'un mécanisme autonome non-cellulaire.

IUE peut également être utilisé pour effectuer des expériences de sauvetage par électroporation gènes interagissent potentiels en assommer les animaux 7,9,10. Par exemple, un enquêteur pourrait tenter de sauver un phénotype de migration dans un modèle transgénique par électroporation d'une cible en aval et de déterminer si le défaut de migration est corrigé dans les neurones électroporation. Ceci présente l'avantage supplémentaire que un sauvetage réussi indique que la migration normale peut être restaurée en manipulant l'expression des protéines dans une SPEneurone cifique, bien que le milieu environnant est encore déficiente pour le gène ciblé. Encore une fois, cette approche est plus de temps et plus rentable que de traverser ou de générer des lignées transgéniques, avec l'avantage supplémentaire de déterminer si le mécanisme défectueux est une cellule autonome.

IUE peut être utilisé pour suivre la migration des neurones par électroporation d'un plasmide rapporteur dans assommer embryons (Figure 4C). Comme seuls les neurones qui tapissent le ventricule au moment de la chirurgie sont électroporées 17, IUE peut être utilisé pour suivre les neurones nées à un moment précis avec l'avantage de la visualisation de la morphologie in vivo.

Enfin, il est possible d'utiliser IUE pour cibler des régions cérébrales telles que le télencéphale dorsal medial ou, de l'hippocampe ou de l'éminence ganglionnaire (figure 2). Cela donne chercheurs le pouvoir d'enquêter fonction du gène dans une zone spécifique indépendant de complications Résultattion de protéine knockdown dans des structures voisines.

protéine du rétinoblastome (PRB), p107 et p130 comprennent la famille des protéines de poche et sont des régulateurs de la sortie du cycle cellulaire bien établie. Cependant, il ya plus de preuves que ces protéines régulent également cycle cellulaire aspects indépendants du développement neuronal. Comme nous l'avons montré précédemment, PRB et p107 jouent un rôle crucial à la fois tangentielle 4,23 et la migration radiale 6. Ici, nous démontrons le rôle des protéines de poche membres de la famille pRb et p107 sur la migration neuronale 6 pour illustrer l'utilisation de électroporation in utero de Cre dans un modèle transgénique. En résumé, IUE fournit un moyen puissant d'analyse des effets de cellules autonomes de délétion du gène (ou la surexpression). Lorsqu'il est combiné avec tissu spécifique assommer modèles, IUE peut fournir des informations supplémentaires concernant les mécanismes de contrôle de la migration neuronale.

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Protocol

NOTE: Toutes les expériences ont été approuvés par l'Université du comité d'éthique le soin des animaux d'Ottawa, en respectant les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux.

Préparation 1. Pré-chirurgical et Matériaux

  1. Plasmide Préparation:
    1. Préparation des plasmides en utilisant le Qiagen Megaprep selon le protocole du fabricant. Inoculer au moins 400 ml de bouillon LB avec des bactéries transformées pour assurer un rendement élevé d'ADN et incuber pendant une nuit.
    2. Remettre en suspension dans le plasmide de 100 à 200 ul de TE jusqu'à une concentration finale d'au moins 5 ug / ul. ADN Aliquoter et conserver à -20 ° C. Si la concentration est trop faible, ne pas précipiter et remettre en suspension comme cela peut ajouter impuretés. Recommencer avec une nouvelle préparation.
    3. Avant la chirurgie, diluer un seul plasmide (Cre-GFP par exemple) à 2 ug / ul dans de l'eau stérile avec 1 ul de 0,1% (p / v) colorant vert Fast-10 ou par 20 pi de solution de plasmide dilué. Si GFPet le gène d'intérêt sont à co-électroporation sur des plasmides séparés, injecter le plasmide GFP et le plasmide portant le gène d'intérêt à un ratio de 1: 4 à maximiser la probabilité que toutes les cellules marquées à la GFP sont co-électroporation à la fois plasmides.
  2. Tirez tubes microcapillaires de verre (diamètre extérieur de 1 mm - ci-après dénommé aiguilles) sur un extracteur de aiguille standard, en utilisant une seule étape de traction à 62 ° C.
  3. Autoclave un pack contenant les chirurgicale suivante: porte-aiguilles, écarteur de plaie, pinces, ciseaux pour la chirurgie, ciseaux pour aiguilles, agrafeuse, agrafes, de la gaze, des couvertures de plaies, champs opératoires (figure 1A, B; Tableau Matériaux).
  4. Recueillir d'autres outils nécessaires: électroporateur, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 ou 7 mm), une solution saline, suture, 5 ml seringue (Tableau Matériaux).

2. Préparer la souris pour la chirurgie

  1. Pour la gestion de la douleur, injecter un p-chronométrérégnante souris avec la buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) une heure avant la chirurgie. Appliquer ce protocole à des souris chronométrés ne importe où de jour embryonnaire 12,5 (E12.5) E17.5 à.
  2. Utilisez microloader embouts de pipette pour sauvegarder charge tiré aiguilles avec la solution de plasmide. Ne remplissez pas tout le chemin dans la pointe de l'aiguille encore car cela provoquerait l'aiguille à se obstruer.
  3. Anesthésier la souris en utilisant 2-5% de gaz isoflurane avec 1 L / min O 2. Une fois immobile, placer dans masque et appliquer une pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement. Injecter avec 1 ml de solution saline (NaCl 0,9%) sous-cutanée dans le dos.
    REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec le gaz isoflurane, utiliser un piégeur de gaz pour reprendre le gaz en excès et l'empêcher de se échapper dans la pièce.
  4. Rasez abdomen. Laver abdomen avec Chlorohexadine gommage, rincer à l'eau, et appliquer une solution de préparation finale de chlorohexadine et 70% d'éthanol. Couverture souris avec drap stérile ou de gaze pour couvrir la fourrure, tout en laissant exposée abdomen (figure 1C, D).

In utero électroporation

  1. Faire une incision dans la peau sur l'abdomen entre les tétines inférieurs. Tirez la peau loin de la couche de muscle sous-jacent en déchirant le tissu conjonctif, puis couper à travers le péritoine dans la cavité abdominale le long de la ligne blanche. Insérez l'écarteur de plaie de tirer les bords de la plaie de l'autre.
  2. Enlever l'utérus de la cavité abdominale et l'étendre comme illustré (Figure 1E).
    1. Si différents chiots doivent être injectés avec différents plasmides (telles que GFP vs GFP avec le gène d'intérêt), compter les petits de chaque côté et décider lesquels et combien d'injecter avec chaque plasmide. Remplacer un côté de l'utérus dans l'abdomen de conserver les embryons tiède et lubrifié. Immédiatement humidifier l'utérus exposé avec une solution saline (de préférence chauffé à la température du corps).
    2. Si l'injection de tous les petits avec le même plasmide (comme lors de l'injection Cre-GFP dans des embryons transgéniques) ONLy retirer une corne de l'utérus à la fois.
  3. Mettez une aiguille chargée dans la tête de préhension de la baguette d'injection et soigneusement couper la pointe avec une paire de petits ciseaux chirurgicaux ou pinces fines. Couper l'extrémité sorte que l'aiguille reste le plus longtemps possible tout en permettant au fluide de passer à travers (Figure 1Ji-iv).
    1. Ajuster la longueur de l'injection (en secondes) et la pression d'injection sur le micro-injecteur de sorte qu'une petite goutte encore bien visible de de 0,1 à 0,2 pi apparaît sur la pointe de l'aiguille lorsque la palette de pied est pressé. Gardez le volume de cette goutte aussi cohérentes que possible entre les différentes aiguilles.
      REMARQUE: cette étape est cruciale pour la survie de l'embryon (voir la discussion).
    2. Utilisez les paramètres d'injection suivantes pour la FemtoJet: injecter la pression (pi) = 250-300 hPa; temps d'injection (ti) = 0,8-1,2 sec; pression de compensation = 10-50 hPa. Si nécessaire, ajuster ces paramètres pour accueillir la variation entre les aiguilles.
  4. Sélire un embryon et positionner doucement sur ​​le dos, la tête inclinée vers le haut (figure 1F).
    NOTE: Cela peut nécessiter de tourner ou de déplacer l'embryon; attention à ne pas appliquer trop de pression et d'éviter la rupture du sac amniotique lors de la manipulation de l'embryon.
  5. Une fois que l'embryon est en place, recherchez le ventricule, qui présente comme une ombre en forme de croissant parallèlement à la sinus longitudinal. Touchez la pointe de l'aiguille dans l'utérus au-dessus du ventricule à un léger angle et de guider l'aiguille à travers la paroi utérine. La quantité de pression requise dépend de la finesse de l'aiguille. Poussez l'aiguille à travers le cortex dans le ventricule.
    REMARQUE: Bien qu'il y ait rarement une résistance détectable supplémentaire, la tête de l'embryon est souvent repoussé légèrement puis recule que l'aiguille traverse le cortex dans le ventricule.
  6. Pomper le paddle pieds pour injecter la solution de plasmide. Continuez à pomper jusqu'à ce qu'un espace vert est visible et est conforme à laforme d'arc du ventricule (figure 1G). Chez les jeunes embryons (E12.5 à E14.5) le colorant sera souvent diffuser dans le ventricule controlatéral.
    NOTE: Le nombre de pompes est fonction du diamètre de la pointe d'aiguille, l'âge de l'embryon (taille et résultant du ventricule) et le volume d'injection souhaitée. Gardez le volume injecté aussi cohérentes que possible entre les embryons.
  7. Injecter trois ou quatre embryons. Conservez tous les embryons exposés humides avec une solution saline long de la procédure.
  8. Retour aux premiers embryons injectés et placer les palettes de telle sorte que l'électrode positive tirera le plasmide dans la région désirée du cerveau (figure 1H). Angle de l'électrode négative de sorte que le chemin le plus court entre les électrodes passe directement à travers la structure ciblée pour l'électroporation (figure 2).
  9. Une fois que les palettes sont en place, appliquer le choc. Selon l'âge et la taille des embryons, utiliser cinq impulsions de 35 à 50 V (voir Tmesure 1). Utilisez les paramètres d'électroporation suivants: durée de l'impulsion de 5 ms avec un intervalle de 950 ms d'impulsion. Répéter l'opération avec tous les embryons injectés.
  10. Couper l'extrémité de la nouvelle aiguille de pré-chargée comme dans l'étape 3.3 comme la dernière aiguille susceptibles séché et obstrué lors de l'étape 3.9. Injecter la prochaine série de trois ou quatre embryons avec soit le même plasmide ou un plasmide différent et puis appliquer le choc comme dans l'étape 3.9. Lorsque tous les chiots dans un côté de l'utérus sont injectés, retirez le deuxième côté de l'utérus de l'abdomen de la femelle et puis remplacez le côté rempli à garder au chaud.
  11. Retour des deux côtés de l'utérus à la femelle en faisant attention de garder la surface humide avec une solution saline et de ne pas appliquer trop de pression pour éviter le traumatisme des sacs amniotiques. Suturer la couche musculaire fermé en utilisant un point simple et continu. Staple la peau fermé. Si les agrafes ne sont pas disponibles, suturer la peau avec un point interrompu simple. (Figure 1I)
  12. Alors que suturing, tourner progressivement jusqu'à l'isoflurane pour permettre l'anesthésie de la femme enceinte pour éclaircir.
    NOTE: Ce sera d'accélérer l'excitation du barrage après la chirurgie est terminée; garder la femelle anesthésié pour une durée aussi courte que possible permettra d'améliorer la survie de l'embryon. Temps de la chirurgie totale, à partir de quand la femelle est d'abord anesthésié, doit être d'environ 30 min.

4. Entretien

  1. Placez la femelle suturé dans un incubateur ou sur un coussin chauffant pour remettre de l'anesthésie. Son lit sur la literie propre et placer un gel de récupération standard dans la cage à maintenir l'hydratation. Pour la gestion de la douleur après la chirurgie, donner les trois femmes doses de buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) à des intervalles de 8 h après la chirurgie, puis quatre doses supplémentaires à intervalles de 12 h.

5. Brains de récolte

NOTE: Brains peuvent être récoltées à tout âge jusqu'à l'âge adulte. Ce qui suit se appliquepour la collecte cerveaux avant la naissance. Notez qu'une fois chiots sont nés, l'ordre dans l'utérus est perdu, donc soit chaque chiot dans la litière doit être injecté avec le même plasmide, ou une autre méthode de différencier entre le contrôle et les animaux de laboratoire doit être conçu.

  1. Préparer froid (4 ° C), on filtre 4% de paraformaldehyde (PFA) avant l'euthanasie femelle.
  2. Euthanasier la femelle en utilisant une injection intraperitoneale d'une dose létale de pentobarbital de sodium (100 mg / kg de poids corporel) et couper abdomen ouvert. Tirez sur les deux côtés de l'utérus et de jeter départ comme à chiots ont d'abord été injectés.
    1. Dans le cas où tous les chiots ont reçu le même plasmide, comme lors de l'injection Cre dans une litière transgénique, afin d'embryons ne est pas important, donc coupé l'utérus de la femme et sa place dans PBS.
    2. Si les chiots ont été injectés avec des plasmides différents, veillez à placer chaque chiot, en notant les petits morts, et de déterminer quels sont ceux qui ont été injectés avec le contrôle et expériplasmides Tal avant de retirer l'utérus de la femelle. Soyez prudent de garder une trace des chiot appartient à quel groupe après l'utérus est en PBS.
  3. Retirez chaque chiot individuellement, décapiter avec des ciseaux pointus ou une lame de rasoir et placez la tête dans du PBS. Dans le cas des souris transgéniques, prélever des échantillons de tissus pour le génotypage et de garder chaque tête séparée, comme dans une plaque de 12 puits.
  4. Sous un microscope à dissection, retirez le cerveau du crâne, en faisant attention de ne pas entailler le cortex ou déchirer la ligne médiane. En utilisant un microscope à fluorescence, vérifier pour voir si cerveaux ont une GFP + patch, ce qui indique qu'ils ont été électroporées avec succès.
  5. Fixer cerveau par immersion dans PFA à 4 ° C jusqu'au lendemain.
    REMARQUE: Vérifiez cerveaux pour l'expression de la GFP avant la fixation depuis PFA désaltère souvent le signal.
  6. Cryoprotect cerveau par immersion dans 20% de saccharose pendant au moins trois jours avant la congélation. Utiliser un gradient de saccharose de 10%, 15% et 20% (24 h dans chaque solution) to éviter d'endommager les tissus en raison de la pression osmotique. Rangez cerveaux congelés à -80 ° C et couper sur un cryostat à 10-14 um sections épaisses.

6. Co-coloration anti-GFP

REMARQUE: si la récupération de l'antigène est nécessaire de co-tache avec des anticorps anti-GFP, il est important d'utiliser un protocole de récupération antigène doux qui ne compromet pas le signal de la GFP. Certains protocoles de recherche d'antigène sont trop dures à utiliser en conjonction avec la GFP coloration (même avec un anticorps contre GFP). Un acide citrique de base pré-traitement avant l'application de l'anticorps primaire est couronnée de succès pour la plupart des epitopes 24.

  1. Préparer une solution 0,01 M d'acide citrique dans ddH 2 O. pH 6 à l'aide d'un pH-mètre étalonné.
  2. La chaleur de l'acide citrique dans la chambre à micro-ondes ou coloration bain d'eau jusqu'à ce que l'acide citrique atteint 75 à 80 ° C. Mettez les diapositives dans la chambre coloration pendant 10-15 min. Maintenir la température la plus stable possible.
  3. Laver les lames dans du PBS3x pendant 3 min à température ambiante. Appliquer l'anticorps primaire et procéder à immunocoloration selon un protocole standard.
  4. Validate excision médiée par Cre par co-marquage pour la GFP et le gène d'intérêt afin de confirmer abattre (figure 3A).

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Discussion

Deux des principaux défis dans l'exécution de électroporations in utero sont 1) la prévention embryocides et 2) en diminuant la variabilité entre électroporations. Un des facteurs les plus importants dans la prévention de létalité est la qualité de l'aiguille, comme aiguilles émoussées infligent plus de dommages à l'embryon. Lors de la coupe de l'aiguille, gardez la pointe le plus longtemps possible tout en permettant une gouttelette visible de 0,1 à 0,2 pi de fluide à apparaître à la suite d'une pompe de la palette de pied (figure 1J). Si l'aiguille est trop terne ou l'arbre trop court, les lésions tissulaires résultant pourrait tuer l'embryon. Inversement, si la pointe de l'aiguille est trop fine, il sera trop long pour injecter volume de plasmide suffisante; laissant l'aiguille dans le cerveau trop longtemps dommages causes à cause des vibrations inévitables des mains de l'enquêteur et de légères rotations de l'embryon. En outre, utiliser un microbeveler faire aiguilles avec une forte, des conseils biseautés pour permettre des injections en plus jeune, Les embryons les plus fragiles, bien que cela ne devrait pas être nécessaire pour les embryons E13.5 et plus.

Le niveau de la femme enceinte de stress est un autre facteur clé qui influe sur la survie de l'embryon. Le niveau de stress plus élevé de barrage, plus il est probable qu'elle annulerait la litière. Pour cette raison, il est important de minimiser le temps d'anesthésie et modifier logement le moins possible avant et après la chirurgie. La souche de fond peut également affecter le niveau de stress et il peut être nécessaire de colonies outcross sujettes à l'anxiété SUR UNE souche tels que CD1, en supposant que le phénotype sous enquête est maintenue à travers différentes souches de fond.

La principale limitation à IUE est la variabilité inhérente entre électroporations. Chaque cerveau électroporation est différente en raison de variations de volume d'injection, le placement de paddle, paddle contact et l'âge de l'embryon. Etant donné que les aiguilles sont variables, il ne est pas possible d'injecter un volume fixe - et non les Investigator doit se rapprocher de la taille de la tache verte de livrer des quantités similaires à tous les embryons. De même, parce que l'embryon est flottant dans un sac rempli de fluide, il ne est pas possible de mesurer systématiquement la position et l'orientation des pales sur la tête de l'embryon, comme cela se fait pour des injections stéréotaxiques. Enfin, quelques différences d'âge embryonnaire peuvent avoir des effets significatifs sur les résultats expérimentaux. Pour cette raison, la comparaison entre les compagnons de portée est recommandée.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Square Wave Electroporator BTX Harvard Apparatus 45-0052 Electroporator only – buy cables separately (45-0204)
1250FS Footswitch for ECM 830 BTX Harvard Apparatus 45-0211 Foot paddle is necessary for hands-free electroporation
Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0489 (5mm)         45-0488 (7mm) Platinum forcep style electrodes
Femtojet Eppendorf 920010504 Microinjector
Griphead 0 Eppendorf 920007414 Holds the pulled needle
Universal Capillary Holder Eppendorf 920007392 Connects griphead to tube
Injection Tube Eppendorf 920007431 Connects capillary holder to Femtojet
Foot Control Eppendorf 920005098 Foot paddle for hands-free injection
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Tips for loading the pulled capillary tubes
Plasmid Mega Kit Qiagen 12181 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252-5G Non-toxic dye
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 For trimming the needles
Bonn Strabismus Scissors Fine Science Tools 14084-09
Graefe Forceps Fine Science Tools 11050-10 Straight
Colibri Retractors Fine Science Tools 17000-03
Stapler Fine Science Tools 12031-07 For 7mm clips
Castroviejo Needle Holder Medical Tools SNH-6737 Straight, with lock
Needle Puller Narishige PC-10 For pulling microcappillaries
Microcapillaries Drummond 1-000-800 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes

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References

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Biologie du Développement numéro 95, le développement du cerveau la migration neuronale transgénique la cellule autonome modèle de souris
L&#39;induction de la protéine de suppression Grâce<em&gt; In Utero</em&gt; Électroporation à Définir déficits migration neuronale dans des modèles transgéniques
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Svoboda, D. S., Clark, A., Park, D.… More

Svoboda, D. S., Clark, A., Park, D. S., Slack, R. S. Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models. J. Vis. Exp. (95), e51983, doi:10.3791/51983 (2015).

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