Summary
Модуль для одной плоскости освещения микроскопии (SPIM) описывается который легко адаптируется к перевернутой широкого поля микроскопа и оптимизирован для культур 3-мерных клеток. Образец находится в пределах прямоугольного капилляра, а также через микрожидком красителей системы люминесцентных, фармацевтические агенты или лекарственные средства могут быть применены в небольших количествах.
Abstract
Модуль для легкой листа или одной плоскости освещения микроскопии (SPIM) описывается который легко адаптируется к перевернутой широкого поля микроскопа и оптимизирован для культур 3-мерных клеток, например, многоклеточные опухолевых сфероидов (MCTS). Модуль возбуждения SPIM формы и отклоняет свет таким образом, что образец облучается световым листа, перпендикулярном пути обнаружения микроскопа. Система характеризуется использованием прямоугольной капилляра для проведения (и в расширенной версии также микро-капиллярной подхода для вращения) образцов, с помощью синхронного регулировки освещающего света листом и линзы объектива, используемого для обнаружения флуоресценции, а также путем адаптации микрожидком системы для применения флуоресцентных красителей, фармацевтических препаратов или препаратов в небольших количествах. Протокол для работы с этой системой дается, и некоторые технические детали, как сообщается. Представитель результаты включают (1) измерения допринимают из цитостатического препарата (доксорубицин) и его частичного преобразования к деградации продукта, (2) измерение окислительно-восстановительные с использованием генетически закодированного датчика глутатиона при добавлении окислителем, и (3) инициирование и маркировка некроза клеток на ингибирование дыхательной цепи митохондрий. Обсуждаются различия и преимущества настоящего SPIM модуля по сравнению с существующими системами.
Introduction
В дополнение к хорошо известными способами (конфокальной или многофотонное лазерная микроскопия 1-4, структурированы освещение микроскопии 5,6) свет листовых или одиночный самолет освещение микроскопии (SPIM) оказалась ценным методом 3D визуализации 7,8, 9. Особый интерес представляет его применение к 3-мерных клеточных культурах, например, многоклеточных опухолевых сфероидов (MCTS), которые используются чаще для исследования по поиску новых лекарств 10,11. Кроме того, SPIM льготная метод, когда даже при длительном воздействии или повторных измерений низкие световых дозах необходимы для поддержания жизнеспособности сэмпла, так как для измерения каждой плоскости образца только этот самолет подвергается воздействию света. Это в отличие от других методов микроскопии, где для обнаружения каждой фокальной плоскости освещенных весь образец, так что при записи многочисленных самолетов суммы свет дозы и может привести к повреждению образца 12. Свет листа микроскопии или SPIM основан на освещении образца в перпендикулярном направлении к пути наблюдения или при использовании цилиндрической линзы или путем сканирования возбуждающего лазерного луча (для обзора см. 8). Это часто требует особого образца камеры 13,14 или матрицы, например, агарозном 7,15, реализованы в специальных дорогостоящих микроскопов. В качестве альтернативы этих систем сравнительно просто Осветительное устройство по SPIM была разработана и адаптирована к обычным инвертированным микроскопом (16 рисунок 1). Он состоит из лазерного луча расширенной до диаметра 8 мм и фокусируется цилиндрической линзой (фокусное расстояние: 50 мм, с числовой апертурой 0.08) до светло-листа 6-10 толщиной мкм над глубиной резкости около 100 мкм . Образцы расположены в прямоугольном капилляр с внутренним диаметром 600-900 мкм, помещенной в передней части объектива микроскопа Lenс регистрации флуоресценции. Эти основные особенности в настоящее время завершена, и оптимизирована за счет использования передовых микро-капиллярных подходов для проведения и возможность вращения образцов, синхронную регулировку освещающего света листа (в осевом направлении) и объектива, используемые для обнаружения флуоресценции (идентичны оптического пути длины перемещения требуют коррекции механической подачей), и адаптацию микрофлюидном системы для применения флуоресцентных красителей, фармацевтических препаратов или препаратов, тем самым сводя к минимуму необходимых количествах и расходы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Сотовый Сфероид Выращивание и Инкубационный
- Эксперимент 1: Сотовые сфероиды инкубировали с химиотерапевтическим препаратом
- Подготовить агарозный 1,5% в культуральной среде, добавив 0,45 г агарозы до 30 мл культуральной среды (достаточной для 6 пластин).
- Смесь нагревают с шага 1.1.1, по крайней мере, 80 ° С при перемешивании его с течением времени.
- Заполните 50 мкл нагретой смеси со стадии 1.1.2 в каждую лунку 96-луночного планшета и дать ему затвердеть в течение 1-2 часов. Храните пластины не закрыты и покрыты в холодильнике при 5 ° С до использования.
- Семя около 150 MCF-7 клеток рака молочной железы в каждую лунку, полученного 96-луночного планшета в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) с F-12 культуральной среде Хэма, дополненной 10% телячьей эмбриональной сыворотки (FCS) и 1% пенициллина / стрептомицина .
- Вырастить сфероидов в течение 5-7 дней до диаметром около 200-300 мкм в инкубаторе при 5% CO 2 и 3776 С.
- Выдержите клеточных сфероидов с антрациклиновый антибиотик доксорубицин гидрохлорид в течение 6 ч при концентрации в диапазоне от 2 до 8 мкм, (в культуральной среде) в инкубаторе при 5% CO 2 и 37 ° С.
- Вымойте клеток сфероидов с культуральной среды или сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS) предварительного микроскопии.
- Эксперимент 2: процесс окисления в сфероидов, выражающих датчик окислительно-восстановительного
- Семя около 400 U251-MG-L106 клетки глиобластомы, постоянно трансфицированных глутатиона чувствителен датчик окислительно-восстановительного потенциала зеленый флуоресцентный Grx1-roGFP2 в агарозном геле лунок (процедура описана в пунктах 1.1.1-1.1.3) 96-луночный планшет в среде DMEM культуральную среду с добавлением 10% FCS, 1% пенициллина / стрептомицина и гигромицину B (150 мкг / мл).
- Вырастить сфероидов в течение 5-7 дней до диаметром около 200-300 мкм в инкубаторе при 5% CO 2 и 37 ° С.
- Добавить 10 & #181; л раствора перекиси водорода (purum PA, ≥ 30%) в 990 мкл бидистиллированной воды, чтобы создать мМ маточного раствора 100, чтобы использовать в течение 12 часов.
- Разбавьте исходный раствор с шага 1.2.3 до 50 мкм EBSS прямо перед экспериментом.
- Выдержите клеточных сфероидов через микрожидкостной системы во время измерения с перекисью водорода 50 мкм EBSS для окисления датчика окислительно-восстановительной.
- Эксперимент 3: Инициирование и маркировка сотовой некроза в сфероидов
- Семенной около 400 клетки (например, U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 клеток глиобластомы) в агарозном геле лунок (процедурой, описанной в шагах 1.1.1-1.1.3) из 96-луночного планшета в DMEM культуральной среде, содержащей 10% FCS, 1% пенициллина / стрептомицина и гигромицину B (150 мг / мл).
- Вырастить сфероидов в течение 5-7 дней до диаметром около 200-300 мкм в инкубаторе при 5% CO 2 и 37 ° С.
- Выдержите ячейкусфероиды с митохондриальной транспорта электронов ингибитора ротеноном в течение 3 ч при концентрации 1 мкМ в культуральную среду, чтобы вызвать клеточный некроз. Кроме того, совместно инкубируют с зеленым красителем цитотоксичности в течение 3 ч при концентрации 1 мкл в 1 мл культуральной среды для обозначения некротические клетки.
- Вымойте клеток сфероидов культуральной средой или EBSS до микроскопии.
2 Свет Регулировка Лист
Примечание: Для достижения наилучших результатов, что должно быть обеспечено, что луч талии светового листа в фокальной плоскости объектива. Положение талии пучка может быть выровнен только при наблюдении света листа в вертикальном положении по отношению к капилляра (см шаги 2,5 - 2,8).
- С помощью инвертированного микроскопа и монтировать модуль возбуждения SPIM, как описано в работе. 16, на опорной плите стола позиционирования (рисунок 1А).
- Одета микроскоп с 10X / или 20X 0,3 / 0,5 объектив микроскопа линзы и соответствующей длиной-фильтр (например, λ ≥ 515 нм) на пути обнаружения микроскопа.
- Установите интегрирующую камеру к порту обнаружения микроскопа.
- Используйте параллельный коллимированный пучок лазера или лазерного диода с длиной волны возбуждения преимущественно 470 нм и применить его к модулю SPIM.
- Поверните цилиндрическую линзу на 90 градусов, который передает свет лист в вертикальном положении для осевого регулировки пучка талии светового листа.
- Поместите капилляр, содержащий жидкость с флуоресцентным красителем в держателе образца.
- Присоединить держатель образца с капилляром в таблице позиционирования микроскопа и выравнивать положение капилляра таким образом, чтобы он находился по центру и луч талии светового листа находится в фокусе.
- Отрегулируйте перетяжки путем изменения осевого положения самой цилиндрической линзы. Вернитесь объектив после объявленияровки.
3 Cell Сфероид Применение и микроскоп поток Синхронизация
- Поместите клеток сфероидов по отдельности или в группах в пределах прямоугольного боросиликатного стекла капилляров 16 с внутренним сечением 600 мкм х 600 мкм и толщиной стенки 120 мкм. Два метода для применения в клеточной сфероида оказались успешными.
- Возьмите пустую капилляр вертикально с большим и средним пальцем и запечатать верхнее отверстие с указательным пальцем. Принесите нижнее отверстие рядом с клеточной сфероида в окружающей его жидкости (EBSS или культуральной среды). Отпустите палец от верхнего отверстия. Жидкость с клеточной сфероида в нем будет замачивают в сразу капиллярных сил. Отрегулируйте положение сфероида в заполненной капилляра гравитации в соответствующем вертикальном положении капилляра.
- С другой стороны, применять сотовый сфероид в капилляр через пипетки. Берегите тхат открытие кончика пипетки, с одной стороны, достаточно большой для размера сфероида, а с другой стороны, меньше или равны по размеру к внутреннему диаметру капилляра.
- Поместите капилляр с сфероида в нем в специальном держателе образца для микроскопии.
- Прикрепите держатель образца с капилляра к столу позиционирования микроскопа и выровняйте положение клеточной сфероида такова, что она устанавливается по центру и сосредоточены.
- Установите соответствие между легкой листом и фокальной плоскости объектива микроскопа линзы в пути обнаружения, регулируя положение отражающего зеркала и цилиндрическую линзу (см регулировочный винт в рисунке 1b).
- Регулировка микрометрического винта (рисунок 1b) в соответствии с показателями преломления и числовой апертуры линзы объектива, чтобы компенсировать эффект Fishtank.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные показатели преломления образца и СМИ окружающие тОн объектива приводит к разности между смещением объектива и смещения фокальной плоскости. Поскольку свет лист перемещается по объективным башне, несоответствие между сдвига светового листа (что соответствует сдвигу объектива) и сдвига фокальной плоскости компенсируется рычага (рисунок 1b). Микрометрический винт используется для адаптации расстояние между верхней и нижней штифта для регулировки сдвига светового листа в соответствии с числовой апертурой линзы объектива и показателей преломления.
Рисунок 1 (А) Изображение одного модуля самолет освещения, установленного на опорной плите стола позиционирования инвертированного микроскопа, (B) образование единого освещения плоскостиМодуль и синхронизация микроскоп корма для компенсации подъемного несоответствие (Fishtank эффект) между фокальной плоскостью и освещения плоскости. Δz о указывает на сдвиг объектива и Δz ф сдвига фокальной плоскости и светового листа. Декор показаны сечения сфероидных содержащий капилляров. Слева: прямоугольная капилляр с внутренним диаметром 600 мкм (стена 120 мкм). Справа: Setup используется для вращения. Внутренний круглый капиллярной (внутренний диаметр 400 мкм, наружный диаметр 550 мкм) вращается внутри внешней прямоугольной капилляра. Пространство между двумя капиллярами заполнено иммерсионной жидкости.
4 Измерение в Dynamic жидкой среде
Примечание: В предыдущем протокол используется для статического инкубации до начала измерения, где клетка сфероид ранее, а затем инкубировали удерживается на месте в капилляре простым гравитации. Там нет необходимости для дальнейших fixatiна. Тем не менее, для измерений в сыпучих сред, где динамический инкубации и, следовательно, динамичной среде желательно измерить поглощение кинетики, можно выполнить эту суб-протокол. Шаги 4,5-4,9 имеют решающее значение, чтобы избежать воздушных пузырей идущие образца.
- Заполните капилляр с FCS в течение 30 мин, чтобы поддержать позже клеточную адгезию клетки сфероида к внутренней поверхности стекла.
- Пусть остальные FCS покрытие в обедненного капилляра высохнуть в течение не менее 12 часов.
- Введем клеток сфероид в капилляре FCS с покрытием, как описано в шаге 3.2.
- Оставьте капилляр в инкубаторе при 5% CO 2 и 37 ° С в течение дополнительных 2-4 часа, чтобы вызвать клеточную адгезию сфероида.
- Настройте прилив часть микрожидкостной системы (рисунок 2). Используйте перистальтического насоса для заполнения прилив в насосно-компрессорных труб (внутренний диаметр 0,89 мм) с культуральной среде, содержащей флуоресцентный краситель, лекарство или агент.
- ConneКТ в притоке части микрофлюидного системы к пузырьковой ловушку (Рисунок 2).
- Первый зажим капилляр без пузырьков в трубке подпора, а затем зажать другую сторону капилляра с трубкой слива.
- Настройтесь жидкость Температура воды в ванне воды до желаемой величины (например, 37 ° C).
- Регулировка перистальтического насоса до требуемой скорости насоса (например, скорость потока: 9 мкл / мин; скорость насоса в капилляре: 25 мм / мин).
- Соберите перекачиваемой жидкости либо в получателе (установки разомкнутой), кормить его к своему источнику (настройки обратной связью) или кормить его прямо в трубки перистальтического насоса (установки жесткой обратной связью).
Рисунок 2 Микрожидкостных установки (без обратной связи и плотно с обратной связью); декор: Освещение в SPHeroid в микро-капилляр с помощью света листового основе флуоресцентной микроскопии, соединенный с помощью инвертированного микроскопа.
5 сбора и анализа данных
- Установите мощность лазера и время интегрирования для получения изображения.
- Позаботьтесь о том, что параметры, определенные в пункте 5.1 не превышают значений доз легкие около 50-100 Дж / см 2 для нативных клетках или 10-20 Дж / см 2 для клеток, инкубированных с флуоресцентным красителем или трансфектированных люминесцентные кодирования белка плазмиды к избежать фототоксичность (подробнее см. 12).
- Установите приращение для Z-стека Δz = 5-10 мкм, которые предпочтительнее для 3-мерного анализа данных, как свет толщина листа составляет около 10 мкм.
- Выполните измерения отдельных изображений или Z-стеки вариацией фокальной плоскости в пределах клеток сфероида.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эксперимент 1: Сотовые сфероиды инкубировали с химиотерапевтическим препаратом
Г-стек сканирование ранее инкубированной MCF-7 клеток сфероида (8 мкМ доксорубицина, 6 ч) изображен на рисунке 3. Это дает подробную информацию о клеточного поглощения и распределения доксорубицина 17 и его продукта разложения 18,19. В наружном слое клеток сфероида красного флуоресцентного доксорубицина в основном локализованы в ядре, тогда как во внутренних районах сфероида зеленая флуоресценция, испускаемый продукта разложения становится доминирующим в клеточной мембране 19.
Рис.3 Флуоресцентные изображения из разных слоев (Δz = 10 мкм) в MCF-7 молочной SPH карциномыeroid инкубировали с доксорубицина (8 мкМ, 6 ч), записанного одной плоскости освещения микроскопии; 3-мерное реконструкция с использованием Z-проекции (возбуждение: λ = 470 нм; оценки флуоресценции: λ ≥ 515 нм; микроскоп объектив: 10X / 0.30 План Neofluar).
Поглощение химиотерапевтического доксорубицина наркотиков в родных MCF-7 молочной железы человека сфероидов раковых клеток изображен на рисунке 4 для одного слоя клеток, выбранного SPIM. При приложении 2 мкм в культуральной среде в рамках системы поток красной и зеленой флуоресценции доксорубицина и его увеличение продукта разложения непрерывно (изображения и спектр изображен).
Рисунок 4 Время курс клеточному поглощению 2 мкМ доксорубицинав культуральной среде через микрожидкостных системы. Флуоресцентные изображения из одного слоя MCF-7 молочной сфероида карциномы, записанной на одной плоскости освещения микроскопии на расстоянии 80 мкм от ее края с дополнительным флуоресценции спектра излучения (возбуждение: λ = 470 нм; обнаружение флуоресценции: λ ≥ 515 нм ; микроскоп объектив: 10X / 0,3 План Neofluar).
Эксперимент 2: процесс окисления в сфероидов, выражающих датчик окислительно-восстановительного
Измерения SPIM внутриклеточных окислительно-восстановительных состояний может дать некоторую информацию о реактивных форм кислорода, например, при опухолях. Для этого сфероидом из U251MG-L106 клеток глиобластомы постоянно трансфектировали глутатиона был использован чувствительный зеленый датчик флуоресцентного окислительно-восстановительный Grx1-roGFP2. Окисление глутатиона было вызвано воздействием 50 мкМ перекиси водорода (H 2 O 2) в соленой Solut ион (EBSS) через микрожидкостной системы и преимущественно произошло во внешних слоях клеток сфероида.
Как сообщалось ранее 20 поглощение H 2 O 2 приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции возбужденного в 470 нм, что соответствует восстановленной формы датчика окислительно-восстановительной. В начале инкубации H 2 O 2 сильно влияет на внешние слои клеток (толщина: 50 мкм) сфероида, а затем проникает вглубь внутренней области (диаметр 150 мкм) сфероида с увеличением времени инкубации в результате чего более медленному разложению интенсивности флуоресценции. Временной ход этого снижения изображен на рисунке 5, демонстрируя возможность быстрого применения препарата в сочетании с быстрого обнаружения системой SPIM 20.
993fig5highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 5 Время курс флуоресценции снижения на 50 мкМ H 2 O 2 инкубационного из U251MG-L106 сфероида клеток глиобластомы постоянно трансфектировали глутатиона чувствительны датчик зеленый флуоресцентный окислительно-восстановительный Grx1-roGFP2. Внутриклеточные редокс кинетики для наружных слоев и внутренней области клеточной сфероида был получен средних значений интенсивности флуоресценции изображений, записанных на одной плоскости освещения микроскопии (один слой клеток сфероида в потоке).
Эксперимент 3: Инициирование и маркировка сотовой некроза в сфероидов
Чтобы инициировать клеточный некроз U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 клеток глиобластомы сфероида, инкубировали с 1 мкМ ротеноном в течение 3 часов. Нейротоксическое агент ротенон является ингибитором митохондриальной цепи транспорта электронов и приводит к потере целостности клеточных мембран. Для visuaЛизе некротических эффект, сфероид был совместно инкубировали с зеленого флуоресцентного цитотоксичность-маркировки красителя (1 мкл в 1 мл культуральной среды, 3 ч), который проникает в поврежденной клетки и связывается с ДНК в ядре клетки (рисунок 6A, С). Для справки, светлое поле освещение образ всей сфероида показан на рисунке 6B.
Рисунок 6. (A) Флуоресцентные изображения из разных слоев (Δz = 5 мкм) U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 клеток глиобластомы сфероид совместно инкубировали с ротенона (1 мкМ, 3 ч) и зеленым цитотоксичности красителя (1 мкл в 1 мл культуральной среды, 3 ч), записанные с помощью одной плоскости освещения микроскопии (масштабную линейку 100 мкм), (б) ярко-Fiполе освещение всей сфероида, и (С) реконструирован 3-мерное изображение флуоресценции (возбуждение: λ = 470 нм; обнаружение флуоресценции: λ ≥ 515 нм; микроскопа объектив: 20X / 0,5 План Neofluar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий рукопись описывает легкий лист или один самолет освещение микроскопия (SPIM) устройство, которое оптимизировано для систем 3-мерных клеток, например, многоклеточных опухолевых сфероидов (MCTS). Три примерные области применения включают (1) поглощение цитостатического препарата и его частичное превращение в продукт разложения (чей вклад в химиотерапевтического эффективности еще предстоит оценивать), (2) измерения окислительно-восстановительного состояния от использования генетически кодируемой датчика глутатиона при Добавление окислительного агента, и (3) инициирование и маркировка некроза клеток на ингибирование митохондриальной дыхательной цепи.
Основные преимущества этой SPIM модуля по сравнению с существующими системами (например, те, в работах. 7, 8, 9, 14, 15) в том, что она может быть легко адаптирована к любой перевернутой широкого поля микроскопа, и что образцы находятся в небольшие измерительные камеры (микро-капилляры), которые нуждаются только в небольших количествах уплотнительныеF флуоресцентные красители, фармацевтические агенты или препараты, которые должны применяться для различных видов экспериментов, таким образом минимизируя затраты, например, для фармацевтических испытаний. Это справедливо также, если микро-жидкостный система, как сообщается в этой рукописи, используется. Следует, однако, отметить, что, хотя для разомкнутого контура установки низкие скорости потока выгодно экономически эффективным скрининга лекарственных средств, скоростью до 1440 мкл / мин (что соответствует скорости до 4000 мм / мин) показал, что возможно при нынешние условия эксперимента без отрыва сфероидов из капилляра. Для жесткой установки с замкнутым циклом Минимальная общая объем жидкости 200-300 мкл требуется, независимо от скорости насоса.
Любой источник света, который может быть сфокусирован в ограниченном месте дифракции, например, лазерным или лазерного диода, может быть использован для освещения. Применение различных источников света, однако, требует коррекции хроматической, либо с помощью дополнительных Telesсправиться системы, размещенные в передней части отдельных источников света 20 или путем разработки ахроматический систему освещения. Еще такой задаче приводится выраженным рассеяния вперед, которые могут быть неоднородными по образцу, тем самым вызывая артефакты, вроде полос или теней. Изменение угла освещения в режиме биение 21 или конкретных программных алгоритмов 22, однако, может уменьшить эти артефакты.
Настоящий система освещения состоит из телецентрическим расширения пучка и фокусировки цилиндрической линзой 50 мм фокусного расстояния и цифровой апертурой А N = 0,08. В соответствии с формулой D = λ / N для дифракции Фраунгофера это приводит к толщиной около 6 мкм светового листа (в зависимости от длины волны возбуждения λ), что примерно соответствует толщине слоя клеток и, кажется, идеально подходит для наблюдения отдельных слоев. Если более высокой осевой Резолюция IS желании, числовая апертура может быть увеличена путем вставки дополнительного объектива микроскопа умеренной или высокой числовой апертурой в освещения луча света с листа уделяется в его плоскости диафрагмы. Это приводит к другому света листа в плоскости образца, который, однако, поворачивается на 90 ° (вращения цилиндрического объектива на 90 ° можно компенсировать это вращение). С большого расстояния микроскопа линзы имеют числовые апертуры до примерно 0,60, толщина листа света может быть уменьшена до 1 мкм или еще меньше, таким образом, приближается к осевой разрешение, полученное в конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Одновременно глубина резкости, который пропорционален П -2 уменьшается от приблизительно 100 мкм до менее чем 2 мкм.
Коррекция смещения фокуса используется для компенсации так называемого Fishtank эффект за счет преломления рассогласования. Сдвиг объектива микроскопа ленс вдоль оптической оси отличается от фокуса сдвига внутри образца. В зависимости от соотношения показателей преломления между воздухом и средой, окружающей образец высоту объекта появляется завоевал с коэффициентом примерно 1,35 и приводит к подъемному несоответствия во столько же раз между фокальной плоскостью и освещения плоскости в SPIM для записи г -stacks (для справки смотрите рисунок 1В).
Многоклеточных опухолевых сфероидов (MCTS) являются симметричными, а образцы, которые могут быть освещены в любом направлении. Тем не менее, меньше, симметричные образцы или мелких организмов освещения с разных сторон может быть желательным. Таким образом, мы недавно разработал установку 23, где образцы расположены в микро-капилляра цилиндрической формы (внутренний диаметр 400 мкм, внешний диаметр 550 мкм), что может быть повернут в прямоугольной капилляра (внутренний диаметр 600 мкм, толщина стенки 120 мкм), как показано на йэ декор из фиг.1В. В связи с почти идеальной оптической связи на основе микроскопии два капилляров света листа могут быть объединены с вращением образца без ограничений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Этот проект финансировался земли Баден-Вюртемберг, а также Европейским Союзом, Europäischer Fonds für умереть Regionale Entwicklung. Авторы благодарят Rainer Виттиг (ILM Ульм) для обеспечения клеточной линии U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 и Клаудия Hintze для умелого технической помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | For cell spheroid growing |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | For cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | Cell line |
| U251-MG-L106 cell line | Cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | Culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | Culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | Cell culture supplement |
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | Antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | Cell culture supplement |
| Doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| Green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox - fluorescent cytotoxicity dye |
| Rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| Capillary | VitroCom | 8260-050 | Sample preparation |
| Microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| Laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | Used with driver PDL800-B |
| Peristaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| Silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. (1990).
- Webb, R. H.
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K.
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. Lippert, H., Wald, M., Radt, B. , 7,787,179 B2 (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. , EP 13 184 931.7 (2013).
