Summary
Een module voor enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) beschreven die gemakkelijk wordt aangepast om een omgekeerde wide-field microscoop en geoptimaliseerd voor 3-dimensionale celculturen. Het monster is gelegen in een rechthoekige capillaire en via een microfluïdische systeem fluorescente kleurstoffen kunnen farmaceutische middelen of geneesmiddelen in kleine hoeveelheden worden toegepast.
Abstract
Een module voor lichte sheet of enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) beschreven die gemakkelijk wordt aangepast om een omgekeerde wide-field microscoop en geoptimaliseerd voor 3-dimensionale celculturen, bijvoorbeeld meercellige bolvormige tumoren (MCTS). De SPIM excitatie module vormen en buigt het licht zodanig dat het monster wordt verlicht door een lichtbron plaat loodrecht op het detectiepad van de microscoop. Het systeem wordt gekenmerkt door het gebruik van een rechthoekige capillaire voor het houden (en in een geavanceerde versie ook een micro-capillaire benadering voor het roteren) de monsters bij synchrone verstelling van de lichtdoorlatende plaat licht en de objectieflens voor fluorescentiedetectie en door aanpassing van een microfluïdische systeem voor de toepassing van fluorescente kleurstoffen, farmaceutische middelen of geneesmiddelen in kleine hoeveelheden. Een protocol voor het werken met dit systeem wordt gegeven, en enkele technische gegevens gerapporteerd. Representatieve resultaten omvatten (1) metingen van de upnemen van een cytostaticum (doxorubicine) en de gedeeltelijke omzetting in een afbraakproduct, (2) redox metingen met behulp van een genetisch gecodeerde glutathion sensor na toevoeging van een oxidatiemiddel, en (3) initiatie en etikettering van celnecrose op remming van de mitochondriale ademhalingsketen. Verschillen en voordelen van de onderhavige SPIM module ten opzichte van bestaande systemen worden besproken.
Introduction
Naast gevestigde werkwijzen (confocale of meerdere foton laser scanning microscopie 1-4, gestructureerde verlichting microscopie 5,6) lichtwaaier of enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) blijkt een waardevolle werkwijze voor 3D beeldvorming 7,8 zijn, 9. Van bijzonder belang is de toepassing ervan op 3-dimensionale celculturen, bijvoorbeeld, meercellige bolvormige tumoren (MCTS), die steeds meer worden gebruikt voor het geneesmiddelenonderzoek 10,11. Bovendien SPIM een preferentieel methode wanneer zelfs na langdurige blootstelling of herhaalde metingen lage lichtdosis moeten levensvatbaarheid van het monster te handhaven aangezien voor het meten van elk vlak van het monster enige dit vlak wordt blootgesteld aan licht. Dit in tegenstelling tot andere microscopische technieken, waarbij voor detectie van elke focal plane het gehele monster wordt verlicht, zodat bij opnamen van meerdere vlakken de lichtdosis vat en kan als monster 12 worden beschadigd. Lichtwaaier microscopie of SPIM is gebaseerd op verlichting van het monster in loodrechte richting op de waarneming pad hetzij door gebruik van een cilindrische lens of door het scannen van de spannende laserstraal (voor een overzicht zie Ref. 8). Dit vereist vaak speciale monstercompartimenten 13,14 of matrices, bijvoorbeeld agarose 7,15, in speciale high-cost microscopen geïmplementeerd. Als alternatief voor deze systemen een relatief eenvoudige verlichtingsinrichting voor SPIM ontwikkeld en aangepast om een conventionele omgekeerde microscoop 16 (zie figuur 1). Het bestaat uit een laserstraal uitgebreid tot een diameter van 8 mm en gefocusseerd door een cilindrische lens (brandpuntsafstand: 50 mm, numerieke opening: 0,08) een lichte vel van 6-10 urn dikte over een scherptediepte van ongeveer 100 urn . Monsters worden in een rechthoekige capillaire van 600-900 urn binnendiameter geplaatst voor het microscoopobjectief lens voor fluorescentiedetectie. De voornaamste kenmerken worden thans voltooid en geoptimaliseerd door het gebruik van geavanceerde micro-capillaire benaderingen voor het vasthouden en roteren van de monsters, de synchrone aanpassing van het lichtdoorlatende lichtwaaier (in axiale richting) en de objectieflens voor fluorescentiedetectie (identiek lichtweg lengten van verplaatsing vereisen een correctie van de mechanische aanvoer), en het aanpassen van een microfluïdische systeem voor de toepassing van fluorescente kleurstoffen, farmaceutische middelen of geneesmiddelen, waardoor de vereiste hoeveelheden en kosten minimaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Cel Sferoïde groeit en Incubation
- Experiment 1: Cell sferoïden geïncubeerd met een chemotherapeutisch geneesmiddel
- Bereid agarose 1,5% in kweekmedium door toevoeging van 0,45 g agarose met 30 ml kweekmedium (voldoende voor 6 platen).
- Verwarm het mengsel uit stap 1.1.1 tot ten minste 80 ° C terwijl het roeren van tijd tot tijd.
- Vul 50 ul van het verwarmde mengsel uit stap 1.1.2 in elk putje van een 96-well plaat en laten stollen in 1-2 uur. Bewaar de platen afgesloten en bedekt in de koelkast bij 5 ° C tot gebruik.
- Seed ongeveer 150 MCF-7 borstkankercellen in elke well van de bereide 96-well plaat in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) en Ham's F-12 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal kalf serum (FCS) en 1% penicilline / streptomycine .
- Groei sferoïden voor 5-7 dagen tot een diameter van ongeveer 200-300 urn in een incubator bij 5% CO2 en 3776, C.
- Incubeer de cel sferoïden met anthracycline antibiotische doxorubicine hydrochloride gedurende 6 uur bij een concentratie variërend tussen 2 pm en 8 urn (in kweekmedium) in een incubator bij 5% CO2 en 37 ° C.
- Was de cellen met kweekmedium sferoïden of Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) voor microscopie.
- Experiment 2: Oxidatie proces in bolletjes uitdrukken van een redox sensor
- Seed ongeveer 400 U251-MG-L106 glioblastoomcellen permanent getransfecteerd met het glutathion gevoelige green fluorescent redox sensor Grx1-roGFP2 in agarose-gel beklede putjes (procedure beschreven in stap 1.1.1-1.1.3) van een 96-putjesplaat in DMEM kweekmedium aangevuld met 10% FCS, 1% penicilline / streptomycine en hygromycine B (150 ug / ml).
- Groei sferoïden voor 5-7 dagen tot een diameter van ongeveer 200-300 urn in een incubator bij 5% CO2 en 37 ° C.
- Voeg 10 & #181, l waterstofperoxideoplossing (purum pa, ≥ 30%) en 990 gl bi-gedestilleerd water om een 100 mM voorraadoplossing te maken te worden gebruikt binnen 12 uur.
- Verdun de stockoplossing van stap 1.2.3 tot 50 uM in EBSS vlak voor het experiment.
- Incubeer de cel sferoïden via het microfluïdische systeem tijdens de meting met waterstofperoxide 50 uM in EBSS voor de oxidatie van de redox sensor.
- Experiment 3: Initiatie en etikettering van cellulaire necrose binnen sferoiden
- Seed ongeveer 400 cellen (bijvoorbeeld U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastoma cellen) in agarose-gel beklede putjes (procedure beschreven in stap 1.1.1-1.1.3) van een 96-wells plaat in DMEM kweekmedium aangevuld met 10% FCS, 1% penicilline / streptomycine en hygromycine B (150 mg / ml).
- Groei sferoïden voor 5-7 dagen tot een diameter van ongeveer 200-300 urn in een incubator bij 5% CO2 en 37 ° C.
- Incubeer de celsferoïden met het mitochondriale elektronentransport inhibitor rotenon gedurende 3 uur bij een concentratie van 1 uM in kweekmedium cellulaire necrose. Daarnaast co-incuberen met een groene kleurstof cytotoxiciteit voor 3 uur bij een concentratie van 1 gl in 1 ml kweekmedium necrotische cellen te labelen.
- Was de cel bolletjes met kweekmedium of EBSS voor microscopie.
2 Licht Gezinsblad Adjustment
OPMERKING: Voor het bereiken van de beste resultaten moet worden gewaarborgd dat de bundeldiameter van licht plaat in de focus vlak van de objectieflens. De positie van de bundeldiameter alleen worden aangepast door het observeren van het licht blad in verticale positie ten opzichte van het capillair (zie stap 2,5-2,8).
- Gebruik een omgekeerde microscoop en zet de SPIM excitatie module, zoals beschreven in Ref. 16, op de voetplaat van de positioneertafel (zie figuur 1A).
- Rust de microscoop met een 10X / 0.3 of 20X / 0,5 microscoop objectief en een geschikt long pass filter (bijvoorbeeld λ ≥ 515 nm) in het detectiepad van de microscoop.
- Monteer een integrerende camera aan de detectie-poort van de microscoop.
- Gebruik een parallelle gerichte lichtstraal van een laser of een laserdiode met een golflengte van 470 nm, bij voorkeur en pas het toe op de SPIM module.
- Draai de cilindrische lens 90 graden, waarbij de lichtwaaier overdraagt in een verticale positie voor een axiale aanpassing van de bundeldiameter van de lichtwaaier.
- Plaats een capillair met een vloeistof met een fluorescerende kleurstof in de monsterhouder.
- Bevestig de monsterhouder met de capillaire de positioneertafel van de microscoop en lijn de positie van de capillaire zodat deze gecentreerd en de bundeldiameter van licht vel in focus.
- Stel de bundeldiameter door variatie van de axiale positie van de cilindrische lens zelf. Terugdraaien van de lens na advertentieren.
3 Cell Sferoïde Toepassing en Microscoop Feed Synchronisatie
- Plaats de cel sferoïden afzonderlijk of in groepen in rechthoekige borosilicaatglas capillairen 16 met een inwendige dwarsdoorsnede van 600 urn x 600 urn en een wanddikte van 120 urn. Twee technieken voor het aanbrengen van een cel spheroïde hebben bewezen succesvol te zijn.
- Neem de lege capillaire rechtop, met de duim en middelvinger en sluit de bovenste opening met je wijsvinger. Breng de onderste opening dichtbij de cel sferoïde in omgeving vloeistof (EBSS of kweekmedium). Laat de wijsvinger van de bovenste opening. Vloeistof met de cel spheroïde daarin wordt meteen ondergedompeld in door capillaire krachten. Stel de positie van de sferoïde binnen de gevulde capillair door zwaartekracht in respectievelijke rechtop van de capillair.
- Ook verzoeken de cel spheroid om de capillaire via pipetteren. Verzorgen that de opening van de punt van de pipet, enerzijds, groot genoeg voor de bolvormige grootte en, anderzijds, kleiner of even groot als de binnendiameter van het capillair.
- Plaats de capillair met sferoïde daarin in een speciale monsterhouder voor microscopie.
- Bevestig de monsterhouder met de capillaire de positioneertafel van de microscoop en lijn de positie van de cel sferoïde zodat wordt gecentreerd en geconcentreerd.
- Stel de matching tussen het licht plaat en het brandvlak van de microscoop objectief lens in het detectiepad door de positie van de reflecterende spiegel en de cilindrische lens (zie stelschroef in figuur 1B).
- Stel de micrometer (zie Figuur 1B) overeenkomstig de brekingsindices en de numerieke apertuur van de objectieflens het aquarium effect te compenseren.
OPMERKING: Verschillende refractie indices van het monster en de media rondom thij objectief leiden tot een verschil tussen de verschuiving van het objectief en de verschuiving van de focal plane. Aangezien de lichtwaaier wordt bewogen door de doelstelling toren wordt de mismatch tussen de verschuiving van de lichtwaaier (overeenkomend met de verschuiving van de objectieflens) en de verschuiving van het brandvlak gecompenseerd door een hefboomarm (zie figuur 1B). De micrometer wordt gebruikt om de afstand tussen de bovenste en de onderste pen aanpassen aan de verschuiving van het licht plaat volgens de numerieke apertuur van de objectieflens en de brekingsindices passen.
Figuur 1 (A) Foto van de enkel vlak verlichting module gemonteerd op de grondplaat van de positionering tafel van een omgekeerde microscoop, (B) instellen van de enkel vlak verlichtingmodule en de microscoop voer synchronisatie met de opheffing-mismatch (aquarium effect) tussen focal plane en verlichting vliegtuig te compenseren. Az o geeft de verschuiving van de objectieflens en Az f de verschuiving van het brandpuntsvlak en de lichtwaaier. De inlay toont dwarsdoorsneden van spheroïde bevatten haarvaten. Links: rechthoekig capillair met een inwendige diameter van 600 micrometer (wand 120 micrometer). Rechts: Setup gebruikt voor afwisseling. Een rond kanaal capillair (binnendiameter 400 urn, 550 urn buitendiameter) wordt geroteerd binnen de buitenste rechthoekige capillaire. De ruimte tussen de beide capillairen is gevuld met een vloeistof ondergedompeld.
4 Meting in Dynamic Liquid Milieu
OPMERKING: De vorige protocol wordt gebruikt voor statische incubatie vóór een meting waarbij de cel bolvormige eerder geïncubeerd en vervolgens in plaats van het capillair door eenvoudige zwaartekracht. Er is geen aanvullende fixatiop. Voor metingen in stromende media waar een dynamisch incubatie en dus een dynamische omgeving wenselijk opnamekinetiek meten is, kan deze sub-protocol volbrengen. Stappen 4,5-4,9 zijn essentieel luchtbellen bereiken van het monster te voorkomen.
- Vul het capillair met FCS gedurende 30 minuten later cellulaire adhesie van een cel sferoïde het binnenste glazen oppervlak ondersteunen.
- Laat de overblijvende FCS coating in het uitgeputte capillaire drogen gedurende ten minste 12 uur.
- Breng de cel sferoïde de FCS beklede capillaire zoals beschreven in stap 3.2.
- Laat het capillair in de incubator bij 5% CO2 en 37 ° C gedurende 2-4 uur tot extra cellulaire adhesie van de sferoïde veroorzaken.
- Stel de toevloed van het microfluïdische systeem (zie figuur 2). Gebruik van een peristaltische pomp aan de toevloed van de buis vullen (binnendiameter: 0,89 mm) met kweekmedium dat de fluorescerende kleurstof, geneesmiddel of agens.
- ConneCT toevloed van het microfluïdische systeem naar een opvanginrichting (zie figuur 2).
- Klem eerst de capillaire luchtbellen de toevloed buis en klem de andere zijde van de capillaire de afvoerslangen.
- Stem de vloeistof temperatuur van het waterbad de gewenste waarde (bijvoorbeeld 37 ° C).
- Stel de peristaltische pomp naar de gewenste pomp snelheid (bijvoorbeeld, stroomsnelheid: 9 pl / min; pomp snelheid in de capillaire: 25 mm / min).
- Verzamel de te verpompen vloeistof, hetzij in een ontvanger (open-loop setup), voer het terug naar de bron (closed-loop setup) of voer deze direct in de slang van de peristaltische pomp (strakke closed-loop setup).
Figuur 2 Microfluidic setup (open-loop en strakke closed-loop); inlay: Verlichting van een spheroid binnen een micro-capillaire middels lichtwaaier gebaseerd fluorescentie microscopie gekoppeld met een omgekeerde microscoop.
5 Data Acquisition and Analysis
- Stel het laservermogen en de integratie tijd voor de afbeelding overname.
- Zorg ervoor dat de parameters gedefinieerd in stap 5.1 niet overschrijden lichte dosis waarden ongeveer 50-100 J / cm 2 voor inheemse cellen of 10-20 J / cm 2 voor de cellen geïncubeerd met een fluorescerende kleurstof of getransfecteerd met een fluorescerend eiwit coderen plasmide voorkomen fototoxiciteit (voor details zie Ref. 12).
- Stel de stapgrootte voor de z-stapel Az = 5-10 urn die voorkeur 3 dimensionale data analyse licht plaatdikte ongeveer 10 urn.
- Voeren metingen van afzonderlijke beelden of z-stacks door variatie van de focal plane in de cel spheroïde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experiment 1: Cell sferoïden geïncubeerd met een chemotherapeutisch geneesmiddel
A z-stack scan van een eerder geïncubeerd MCF-7 cellen sferoïde (8 uM doxorubicine, 6 uur) is weergegeven in figuur 3. Het geeft gedetailleerde informatie over de cellulaire opname en verdeling van doxorubicine 17 en het afbraakproduct 18,19. Binnen de buitenste cellaag van de bolvormige rode fluorescerende doxorubicine wordt hoofdzakelijk gelokaliseerd in de kern, terwijl in de binnensteden bolvormige gebieden groene fluorescentie uitgezonden door een afbraakproduct dominant wordt in de celmembraan 19.
Figuur 3 Fluorescentie beelden van verschillende lagen (Az = 10 um) van een MCF-7 borstcarcinoom cellen spheroid geïncubeerd met doxorubicine (8 uM, 6 uur) geregistreerd door enkel vlak verlichting microscopie; 3-dimensionale reconstructie met behulp van z-projectie (excitatie: λ = 470 nm; fluorescentie detectie: λ ≥ 515 nm; microscoop objectief lens: 10x / 0,30 Plan Neofluar).
De opname van het chemotherapeutische geneesmiddel doxorubicine in natieve MCF-7 menselijke borstkankercellen sferoïden is weergegeven in figuur 4 voor een enkele cellaag van SPIM geselecteerd. Bij toepassing van 2 uM in kweekmedium in het stroomsysteem rode en groene fluorescentie van doxorubicine en zijn afbraakproduct stijging continu (beelden en spectrum afgebeeld).
Figuur 4 tijdsverloop van de cellulaire opname van 2 uM doxorubicinein kweekmedium via het microfluïdische systeem. Fluorescentie afbeeldingen van een enkele laag van een MCF-7 borstcarcinoom cellen sferoïde opgenomen door enkel vlak belichting microscopie op een afstand van 80 urn van de rand met extra fluorescentie emissiespectrum (excitatie: λ = 470 nm; fluorescentiedetectie: λ ≥ 515 nm ; microscoop objectief: 10x / 0.3 Plan Neofluar).
Experiment 2: Oxidatie proces in bolletjes uitdrukken van een redox sensor
SPIM metingen van intracellulaire redox staten kunnen wat informatie over reactive oxygen species, bijvoorbeeld in tumoren geven. Hiertoe wordt een sferoïde van U251MG-L106 glioblastoomcellen permanent getransfecteerd met het glutathion gevoelige green fluorescent redox sensor Grx1-roGFP2 gebruikt. Oxidatie van glutathion werd geïnduceerd door blootstelling aan 50 uM waterstofperoxide (H 2 O 2) in zout Solut ion (EBSS) via het microfluïdische systeem en hoofdzakelijk plaats in de buitenste cellaag van de sferoïde.
Zoals eerder gerapporteerd 20 de opname van H2 O 2 resulteert in een afname van de fluorescentie-intensiteit aangeslagen bij 470 nm, overeenkomend met de gereduceerde vorm van de redox sensor. Begin incubatie H 2 O 2 grote invloed op de buitenste cellagen (dikte 50 um) van de bolvormige en dringt dieper in het binnengebied (diameter: 150 pm) van de sferoïde met toenemende incubatietijd resulteert in een langzamere afbraak fluorescentie-intensiteit. Het tijdsverloop van deze daling is weergegeven in figuur 5, waaruit de mogelijkheid van snelle geneesmiddeltoediening gecombineerd met snelle detectie door het SPIM systeem 20.
993fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 5 tijdsverloop van de fluorescentie afname bij 50 uM H 2 O 2 incubatie van een U251MG-L106 glioblastoomcellijn sferoïde permanent getransfecteerd met de glutathion gevoelige green fluorescent redox sensor Grx1-roGFP2. De intracellulaire redox state kinetiek voor de buitenlagen en het binnengebied van een cel sferoïde werd verkregen door de gemiddelde intensiteitswaarde van fluorescentie beelden die met enkel vlak verlichting microscopie (enkele laag van de bolvormige cel onder stroming).
Experiment 3: Initiatie en etikettering van cellulaire necrose binnen sferoiden
Cellulaire necrose starten een U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastoomcellijn spheroïde werd geïncubeerd met 1 uM rotenone gedurende 3 uur. De neurotoxische stof rotenon is een remmer van het mitochondriale elektronentransport keten en leidt tot een verlies van celmembraanintegriteit. Om Visualize de necrotische zin sferoïde werd gezamenlijk geïncubeerd met het green fluorescent cytotoxiciteit-labeling kleurstof (1 gl in 1 ml kweekmedium, 3 uur), die dringt in de beschadigde cel en bindt aan het DNA in de celkern (zie figuur 6A, C). Ter referentie is een helderveld beeld van de gehele sferoïde figuur 6B.
Figuur 6 (A) Fluorescentie beelden van verschillende lagen (Az = 5 um) van een U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 glioblastoomcellijn sferoïde co-geïncubeerd met rotenon (1 uM, 3 uur) en groene kleurstof cytotoxiciteit (1 gl in 1 ml kweekmedium, 3 uur) geregistreerd door enkel vlak verlichting microscopie (schaalbalk 100 urn), (B) licht fiafbeelding 3-dimensionale fluorescentie (excitatie: λ = 470 nm; fluorescentie detectie: λ ≥ 515 nm; microscoop objectief lens: 20X / 0,5 Plan Neofluar) eld verlichting van de hele spheroïde, en (C) gereconstrueerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De onderhavige manuscript beschrijft een lichtwaaier of enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) inrichting die is geoptimaliseerd voor 3-dimensionele celsystemen, bijvoorbeeld meercellige bolvormige tumoren (MCTS). Drie illustratieve toepassingen omvatten (1) opname van een cytostaticum en de gedeeltelijke omzetting in een afbraakproduct (waarvan de bijdrage aan chemotherapeutische werkzaamheid nog worden geëvalueerd), (2) metingen van de redox toestand door toepassing van een genetisch gecodeerde glutathion sensor upon toevoeging van een oxidatiemiddel, en (3) initiatie en etikettering van celnecrose op remming van de mitochondriale ademhalingsketen.
Belangrijkste voordelen van deze SPIM module ten opzichte van bestaande systemen (bijvoorbeeld die beschreven in refs. 7, 8, 9, 14, 15) is dat het gemakkelijk kan worden aangepast aan elke omgekeerde wide-field microscoop en die monsters worden in kleine meetkamers (micro-capillairen), die slechts kleine hoeveelheden nodig of fluorescente kleurstoffen, farmaceutische middelen of geneesmiddelen moeten worden toegepast verschillende soorten experimenten, waardoor de kosten, bijvoorbeeld voor farmaceutische proeven minimaliseren. Dit geldt ook, wanneer een micro-vloeibare systeem, zoals in dit manuscript wordt gebruikt. Er moet echter worden opgemerkt, dat hoewel een open-lus opstart lage stroomsnelheden zijn voordelig voor kostenefficiënt drug screening, snelheden tot 1.440 ul / min (overeenkomend met snelheden tot 4000 mm / min) toonde onder mogelijk deze experimentele omstandigheden zonder loslating van de sferoïden van de capillair. Voor een strakke gesloten-lus opstelling een minimale totale vloeibare volume van 200-300 ul nodig is, onafhankelijk van de pomp snelheid.
Elke lichtbron die kan worden gericht op een diffractie beperkte plek, bijvoorbeeld een laser of een laser diode, kan worden gebruikt voor verlichting. Toepassing van verschillende lichtbronnen vereist echter chromatische correctie hetzij van aanvullende telesomgaan systemen geplaatst voor afzonderlijke lichtbronnen 20 of door het ontwerpen van een achromatische belichtingsstelsel. Een verder probleem is ontstaan door uitgesproken voorwaartse verstrooiing, die homogeen in het monster kan worden, waardoor artefacten zoals strepen of schaduwen. Variatie van de lichtinvalshoek in een slingerende functie 21 of specifieke software algoritmen 22 echter kunnen deze artefacten te reduceren.
De huidige verlichtingssysteem omvat een telecentrische bundelexpansie en concentreren door een cilindrische lens 50 mm brandpuntsafstand en numerieke apertuur A N = 0.08. Volgens de formule d = λ / A N van Fraunhofer diffractie resulteert in een dikte van ongeveer 6 urn van de lichtwaaier (afhankelijk van de excitatie golflengte λ), die ruwweg overeenkomt met de dikte van een cellaag en lijkt te zijn ideaal voor observatie van afzonderlijke lagen. Als een hogere resolutie axiale is gewenst, kan de numerieke apertuur worden verhoogd door insertie van een additioneel microscoop objectieflens van matige of hoge numerieke apertuur in de verlichtingssterkte ray licht vel dat wordt gefocusseerd in de opening plane. Dit resulteert in een licht plaat in het vlak van het monster, die echter wordt 90 ° gedraaid (een rotatie van de cilindrische lens 90 ° kan compenseren rotatie). Sinds lange afstand microscoop lenzen numerieke aperturen tot ongeveer 0,60, kan de dikte van het licht plaat verkleind tot 1 urn of minder, waardoor de axiale resolutie verkregen confocale laser scanning microscopie naderen. Tegelijkertijd wordt de scherptediepte die evenredig is met A N -2 verlaagd van ongeveer 100 pm tot minder dan 2 urn.
Een focal shift correctie wordt gebruikt voor de zogenaamde aquarium effect te compenseren door een brekingsindex mismatch. De verschuiving van het microscoopobjectief lens langs de optische as afwijkt van de brandpuntverschuiving in het monster. Afhankelijk van de verhouding van de brekingsindices tussen lucht en het medium rond het monster de objecthoogte verschijnt pakte met een factor van ongeveer 1,35 en leidt tot een opheffing mismatch met dezelfde factor tussen het brandpuntsvlak en de belichtingsvlak in SPIM voor het opnemen z -stacks (voor referentie zie figuur 1B).
Multi-cellulaire bolvormige tumoren (MCTS) behoorlijk symmetrisch monsters die worden belicht vanuit elke richting. Voor meer symmetrische monsters of kleine organismen verlichting van verschillende kanten gewenst zijn. Daarom hebben wij onlangs een opstelling 23, waarbij de monsters in een micro-capillaire cilindrische vorm (inwendige diameter 400 urn, 550 urn buitendiameter) die binnen de rechthoekige capillaire gedraaid kan worden ontwikkeld (inwendige diameter van 600 urn, wanddikte 120 urn), zoals afgebeeld in the inlay van figuur 1B. Door bijna perfect optische koppeling van de twee capillairen lichtwaaier gebaseerd microscopie te combineren met rotatie van het specimen zonder enige beperking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door de deelstaat Baden-Württemberg, alsmede door de Europese Unie, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. De auteurs danken Rainer Wittig (ILM Ulm) voor het verstrekken van de U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 cellijn en Claudia Hintze voor bekwame technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | For cell spheroid growing |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | For cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | Cell line |
| U251-MG-L106 cell line | Cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | Culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | Culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | Cell culture supplement |
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | Antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | Cell culture supplement |
| Doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| Green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox - fluorescent cytotoxicity dye |
| Rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| Capillary | VitroCom | 8260-050 | Sample preparation |
| Microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| Laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | Used with driver PDL800-B |
| Peristaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| Silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Plenum Press. New York. (1990).
- Webb, R. H.
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K.
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. Lippert, H., Wald, M., Radt, B. , 7,787,179 B2 (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. , EP 13 184 931.7 (2013).
