Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين

Published: November 6, 2014 doi: 10.3791/52021
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

Abstract

تدهور البروتين من قبل النظام اليوبيكويتين-بروتوزوم (UPS) هو آلية تنظيمية رئيسية لتوازن بروتين في جميع حقيقيات النوى. المنهج المعياري لتحديد تدهور البروتين داخل الخلايا يعتمد على فحوصات البيوكيميائية لمتابعة حركية انخفاض البروتين. مثل هذه الأساليب غالبا ما تكون شاقة وتستغرق وقتا طويلا وبالتالي غير قابلة للتجارب تهدف إلى تقييم ركائز متعددة، وتدهور الأوضاع. كبديل، تم إعداد المقايسات المعتمدة على نمو الخلايا، التي هي، في الشكل التقليدي، المقايسات نقطة النهاية التي لا يمكن تحديد كميا التغيرات النسبية في مستويات البروتين.

نحن هنا تصف طريقة التي يحدد بأمانة التغيرات في معدلات تدهور البروتين اقتران لهم الخميرة خلية حركية النمو. وتستند هذه الطريقة على نظام اختيار أنشئت حيث -deleted اليوراسيل auxotrophy من URA3 هو انقاذ خلايا الخميرة عن طريق البروتين مراسل أعرب خارجيا، تتألف من مزيج بين الجينات URA3 أساسيا ومحددا تدهور (degron). تم تصميم هذا البروتين مراسل بحيث معدل تخليق لها هو ثابت في حين يتم تحديد معدل التدهور من قبل degron. كما نمو الخلايا في واليوراسيل نقص المتوسطة يتناسب مع المستويات النسبية للUra3، حركية النمو تعتمد كليا على تدهور البروتين المراسل.

هذه الطريقة يقيس بدقة التغيرات في الخلايا الحركية تدهور البروتين. تم تطبيقه على: (أ) تقييم المساهمة النسبية للعوامل التصريف اليوبيكويتين المعروف أن التحلل البروتيني (ب) E2 انزيم التصريف هيكل وظيفة تحليلات (ج) تحديد وتوصيف degrons الرواية. تطبيق نظام URA3 المستندة degron- يتجاوز مجال تدهور البروتين، كما يمكن أيضا أن تتكيف مع التغييرات رصد مستويات البروتين المرتبط ظائف مسارات الخلوية الأخرى.

Introduction

نظام تدهور اليوبيكويتين-بروتوزوم هو آلة التنظيمية الرئيسية، والتي تورطت في الحفاظ على توازن بروتين في جميع حقيقيات النوى. يو بي إس تقارن البداية جزيئات اليوبيكويتين متعددة لبروتين بعد الهدف الذي تتدهور البروتين بولي اليوبيكويتين الموسومة من قبل بروتوزوم 26S. في معظم الحالات، فإن معدل الحد خطوة لاليوبيكويتين بوساطة التحلل هو الركيزة ubiquitylation بوساطة E2 التصريف الإنزيمات والإنزيمات E3 ligating (E3 Ligases) 1. بالتالي، الاستقرار داخل الخلايا بروتينات معينة تعكس قابليتها للاليوبيكويتين-الاقتران ونشاط الانزيمات وما شابه ذلك ubiquitylation بهم.

ligases E3 هي مكونات التعرف على الركيزة الرئيسية لشركة يو بي إس. على هذا النحو، وهذه الانزيمات تعترف degrons ضمن الركائز التي هي إما غائبة أو لم تتعرض في نظرائهم مستقرة 2. على سبيل المثال، العديد من المنظمين دورة الخلية مأوست يتم توليفها وتدهورت بطريقة محددة زمنيا من أجل الحفاظ على تقدم دورة الخلية في النظام. وغالبا ما تسيطر على تدهور هذه البروتينات من خلال الفسفرة، بوساطة الخلايا، مما يشير إلى تحركات التنظيم 3،4. من ناحية أخرى، يتم التعرف على البروتينات مطوية aberrantly من خلال degrons خفي. وهذه هي المناطق التي تكون مخفية عادة في البنية الأصلية ويتعرضون على هيكل الاضطراب. وتشمل مجالات مثل degrons مسعور 5-7 وشرائح المختلين جوهريا 8.

منذ اكتشاف المنوي للنظام اليوبيكويتين لتدهور البروتين وتوصيف العوامل الأساسية في الخلايا الشبكية 9 لست]، وكانت الوراثة الخميرة مفيدة في اكتشاف العديد من مكونات النظام اليوبيكويتين 10. هو نجاح الخميرة كما كائن نموذج لتحليل منهجي من تدهور البروتين من قبل شركة يو بي إس يرجع ذلك أساسا إلى كون يو بي إس هي عاليةلاي المحفوظة في جميع حقيقيات النوى 4، إلى جانب قابليته على كنظام تجريبي. في الواقع، وتستخدم النظم القائمة على الخميرة عادة إلى فك آليات عمل آلية ubiquitylation.

دراسة تحلل البروتين عن طريق البيوكيميائية وعادة ما يتطلب إعداد مقتطفات الخلية. بينما بروتينات الخلية الحيوانية يمكن استخراجه تحت ظروف معتدلة نسبيا التي تحافظ على تفاعلات البروتين وظيفة، وجود جدار الخلية قوية في الخميرة 11 يتطلب أقسى بكثير الظروف التي قد تؤثر على تعطيل الانتعاش البروتين. في الواقع، وإجراءات مختلفة لتعطيل خلية الخميرة تختلف اختلافا كبيرا في قدرتها على استعادة بروتينات سليمة في المبالغ التي تمثل الوفرة النسبية الخلوية الخاصة بهم بشكل صحيح. مزيد من الدقة متأصلة في الطرق المختلفة المستخدمة لتحديد معدلات تدهور للبروتينات محددة: تجارب "نبض مطاردة" الاستقلابية القائم على العلامات تليها ايمmunoprecipitation، لعزل بروتينات معينة 12، في كثير من الأحيان لا الكمية بدقة. وبالتالي، عندما تتم مقارنة تدهور البروتين بواسطة هذه الطريقة، ينبغي توخي الحذر في تفسير النتائج. للتحايل على هذا العيب، وهو سيكلوهيكسيميد البديل (فروج) مطاردة الفحص ويمكن استخدام 12. في هذا الاختبار، يتم إضافة مثبط الترجمة إلى مزارع الخلايا والتغيرات الزمانية في مستويات بروتين ثابت للدولة يتم رصدها في وقت لاحق. ومع ذلك، فإن استخدام فروج يقتصر على البروتينات مع عمر نصف قصيرة نسبيا (<90 دقيقة)، وكبت طويل الأجل لتخليق البروتين السامة للخلايا. والجدير بالذكر أن كلا من المقايسات المذكورة أعلاه تتطلب استخدام الأجسام المضادة بروتين معين، والتي ليست متاحة دائما.

للتغلب على هذه القيود التقنية، فقد طور الباحثون العديد من الأساليب التي لا تتطلب استخراج الخلايا والبروتين التعامل المباشر. ويستند نهج واحد بشأن إنشاء نعم العوز الغذائيسلالات الواحد، التي حصلت عليها حذف الجينات التي تكود الإنزيمات الأيضية الأساسية. وتشمل هذه الجينات HIS3، LEU2، LYS2 وTRP1، ترميز الإنزيمات اللازمة لالحيوي من الأحماض الأمينية، فضلا عن URA3 أن يشفر المرصد المغربي للسجون كربوكسيل (Ura3)، وهو إنزيم أساسي من البيريميدين ريبونوكليوتيد الحيوي. وقد Ura3 تستخدم على نطاق واسع في الدراسات تدهور البروتين. في هذه المقايسات والتعبير التأسيسية للUra3 ينقذ نمو الخلايا ura3 في واليوراسيل نقص المتوسطة 13. بالتالي زعزعة استقرار Ura3 من خلال الانصهار من degron يمكن أن يقلل من نمو الخلايا في الحد الأدنى من المتوسط ​​تفتقر اليوراسيل. وقد استخدم هذا الأسلوب في مختلف الدراسات تدهور البروتين، بما في ذلك تحديد تدهور محددات 5، E3 ligases 14 و 15 مساعد عوامل ubiquitylation واكتشاف UPS رواية degrons 16. كل من هذه الأساليب المستخدمة نمو الخلايا على لوحات أجار كما فحص قراءات. ومع ذلك، رانه معيار النمو (الإيجابي / النمو السلبي)، في حين قوية وفعالة، هي في معظمها النوعية وليس الكمية توفير المعلومات التي من المهم لتقييم فعالية وdegron أو المساهمة النسبية لمختلف العوامل تدهور المساعدة.

لذا قمنا بتطوير وتستخدم ناقلات الخميرة وطرق الفحص تمكين التحليل المنهجي والكمي للتدهور البروتين بواسطة URA3 -degron نظام الانصهار. ويستند البروتوكول على الفحص سهلة لمقبض الذي يقيس حركية النمو في الثقافة السائلة في ظل ظروف الانتقائية (GiLS) وعلى الجيل من منحنيات النمو القياسية. وتتميز حركية نمو الخميرة قبل ثلاث مراحل رئيسية - تأخر والأسي (سجل) ومرحلة ثابتة. حساب حركية تكرار الخميرة خلال مرحلة السجل ظل ظروف انتقائية، والتي يتم تحديدها من خلال مستويات التعبير عن Ura3-degron، يوفر متحيز قياس الكمي سو تدهور البروتين. هذه الطريقة يمكن تطبيقها على قياس ومقارنة معدلات تدهور ركائز UPS متعددة في وقت واحد في سلالات متعددة وتحت ظروف مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلية ثقافة

  1. تحويل خلايا الخميرة بعامل نمائي المناسبة، مثل Try467 (الجدول 2)، مع البلازميد التي تحتوي على (أ) URA3 -degron الانصهار و (ب) علامة الأيض إضافية لاختيار البلازميد والصيانة.
    ملاحظة: مثال على البلازميد هو مناسبة YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) وهذا هو الخميرة بلازميد التكاملي تحتوي على البروتين الانصهار تتألف من Deg1 - وهو degron المستمدة من النسخ الخميرة. عامل Mat2 17، حاتمة FLAG - للكشف من قبل immunoblotting، Vma12 - بروتين ER مستقر، وUra3 15،18 (الشكل 3A). (انظر الجدول 3 لالبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة وللحصول على أمثلة إضافية من البلازميدات مناسبة).
  2. لاختيار البلازميد والصيانة، والحفاظ على الخلايا في لوحات أجار تحت الاصطناعية مناسبة معينة (SD) المتوسطة تفتقر علامات اختيار الأحماض الأمينية Deg1 -UV وحافظت تحت SD-LYS سائل الإعلام الانتقائي).
  3. زراعة خلايا O / N عند 30 درجة مئوية في المتوسط ​​SD انتقائية مناسبة لصيانة بلازميد حتى يتم التوصل إلى مرحلة ثابتة. تنمو الخلايا في أنابيب اختبار أو في لوحة 96-جيدا، اعتمادا على عدد من العينات المراد فحصها (القسم 2).

2. إعداد الخلايا لتحليل

  1. عندما يتم يعاير عدد قليل من عينات (N≤15)، وتمييع الخلايا واستبدال المتوسطة على النحو التالي:
    1. تمييع 50 ميكرولتر من الخلايا من O / N ثقافة مع 150 ميكرولتر من SD المتوسطة لكل بئر في 96-جيدا لوحة (قاع واضح). ملاحظة، يتم تعيين العينة الأولى كما يحتوي فارغا المتوسطة فقط.
    2. تحديد القيم OD 600 من العينات في 96 لوحة جيدا باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
    3. حساب OD الفعلي 600 في كل بئر بضرب القراءة OD 600 من قبل عامل التخفيف (X4)، من ذوي الخوذات البيضاءICH قيمة القراءة فارغة يتم طرح. تطبيع القيم الناتجة بتقسيم بنسبة 0.55 في الحصول على احتساب مسار بطول 1 سم وفقا للقانون بير لامبرت. ملاحظة هذه القيمة ثابتة عند قياس OD 600 من 200 ميكرولتر من الخلايا في القياسية لوحة 96-جيدا.
    4. حساب حجم الذي تحتاجه للحصول على خلايا الخميرة بمبلغ يعادل 600 OD 0.25 وتحويلها إلى أنبوب إيبندورف.
    5. تدور أسفل الخلايا بسرعة عالية (12،000 x ج) لمدة 1 دقيقة.
    6. إزالة طاف و resuspend الخلايا في 1 مل من المتوسط ​​انتقائية المناسب (انظر القسم 3.1) للحصول على OD 600 0.25.
    7. نقل 200 ميكرولتر من سلالات المخفف لبئر جديد في لوحة 96-جيدا.
  2. عندما يتم اختبار عدد كبير من العينات (ن> 15)، وتمييع الخلايا واستبدال وسيط وبدون سابق قياس OD 600، على النحو التالي:
    1. نقل 10 ميكرولتر من خلايا ثابتةنمت O / N في لوحة 96-جيدا في لوحة 96 بئر جديدة تحتوي على 190 ميكرولتر (تخفيف 1:20) من وسائل الإعلام انتقائية مناسبة (انظر القسم 3.1).

3. حركية النمو في الثقافة السائل تحت شروط انتقائية (GiLS)

  1. استخدام وسائل الإعلام التالية لقياس النمو باستخدام مراسل Ura3-degron:
    1. عن الضوابط الإيجابية للنمو الخميرة تحت ظروف غير مقيدة، واستخدام البلازميد وسائل الإعلام الانتقائي SD (انظر القسم 1.2). إذا كان مطلوبا أي اختيار البلازميد، على سبيل المثال، عند استخدام البلازميد التكاملي مثل Deg1 -UV، SD متوسطة تحتوي على جميع الأحماض الأمينية الضرورية (SD الكامل) يمكن استخدامها.
    2. لعينات تجريبية قياس النمو في ظل ظروف مقيدة، استخدم SD-URA المتوسطة.
  2. وضع القارئ المتعدد صفيحة ميكروسكوبية ل: درجة حرارة الحضانة من 30 درجة مئوية، OD 600 فترات قياس 15 دقيقة، ودورات المدارية والخطية تهتز من 1 دقيقة كل سبع دقائق <ر /> ملاحظة: هذا الوضع المزدوج تم تحسين يهز الحصول على توزيع متجانس للخلايا. ومع ذلك، وسائط اهتزاز أخرى أو حتى أي اهتزاز قد تعمل أيضا.
  3. احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية في قارئ صفيحة ميكروسكوبية O / N أو حتى وصلت إلى مرحلة خلايا ثابتة (12-24 ساعة).
  4. تصدير البيانات الخام إلى ملف جدول البيانات.
  5. تحديد حركية نمو الخميرة باستخدام MDTcalc، وهو برنامج مخصص تقوم بحساب الوقت الحد الأدنى (في ساعة) للخلايا لمضاعفة حجم سكانها (الحد الأدنى مضاعفة الوقت (MDT)؛ لمزيد من التفاصيل انظر القسم 4).

4. احتساب الحد الأدنى مضاعفة الوقت (MDT): مبادئ MDTcalc خوارزمية

ملاحظة: مبادئ خوارزمية MDTcalc، وذلك باستخدام عينة من خلايا الخميرة Try467 (الجدول 2) نمت في SD وسائل الإعلام كاملة، ويوضح الجدول (1) والشكل (1)، مما يدل على جداول البيانات والنمو المؤامرات، respecنسبيا.

  1. طرح OD 600 القيم الفارغة، التي تم الحصول عليها في البئر المعنية، من كل من القراءات التي تم الحصول عليها في العينة جيدا. تقسيم الفروق الناتجة بنسبة 0.55 (لوحات 96-جيدا) لتصحيح طول مسار الضوء. رسم القيم النهائية (الجدول 1، العابرة.) مع الزمن لإنتاج منحنى نمو الخميرة الفعلي (OD 600 / ساعة) (الشكل 1A).
  2. سجل حساب 2 (OD 600) لكل من القيم تحولت إلى تحويل مرحلة النمو اللوغاريتمي في منحنى خطي (الشكل 1B).
  3. حساب المنحدر من فاصل 10 نقطة زمنية (N = 10) ابتداء من الساعة 0 وتتحرك مرة واحدة نقطة في كل مرة إلى N <10 (الجدول 1، المنحدر، الشكل 1C).
  4. حساب قيمة معكوس كل منحدر من الحصول على الوقت اللازم للسكان الخلية لمضاعفة (الجدول 1، 1 / المنحدر، الشكل 1C). حساب الحد الأدنى1 / القيمة المنحدر لتحديد MDT (الجدول 1، المستطيل الأسود، الشكل 1C). استخراج MDT يحسب للخلايا في العينة (الجدول 1، 1 / المنحدر، مستطيل أسود) من الفاصل الزمني المحدد (الجدول رقم 1، التي حددها مستطيل أحمر، أرقام 1B، 1D).
    ملاحظة: معدل نمو الخلايا في SD-URA المتوسطة يتناسب عكسيا مع هذا الدواء.

5. باستخدام MDTcalc

  1. نسخ ملفات البرنامج تستكمل في مجلد معين في الكمبيوتر.
  2. تأكد من حفظ ملف جدول البيانات التي تحتوي على بيانات النمو ومغلقة. فتح برنامج تطبيق MDTcalc أن نرى بداية ظهور الشاشة.
    1. إدراج المعلومات المطلوبة، كما هو موضح في الشكل رقم 2:
      1. تحت عنوان "مسار الملف"، انقر فوق مستطيل على اليمين لتحديد موقع ملف جدول البيانات.
      2. تحت "اسم ورقة"، وكتابة اسم جدول حيث tانه يقع البيانات الخام.
      3. تحت عنوان "وضع البداية، إدراج جدول تنسيق الوقت 0 من العينة الأولى.
      4. تحت عنوان "عمود الوقت، إدراج الرسالة تحديد موقع العمود نقطة زمنية (ينبغي توفير الوقت بالثواني).
      5. تحت عنوان "عمود فارغ، إدراج الرسالة تحديد موقع العمود فارغة (عادة ولكن ليس بالضرورة في بئر A1 من لوحة 96-جيدا).
      6. تحت عنوان "قيمة OD"، اختر الحد الأدنى تحولت OD 600 القيمة المطلوبة لبدء MDT حساب (عادة 0،15-0،25). تعيين هذه القيمة يمنع حسابات MDT للثقافات في مرحلة متخلفة بسبب التخفيف المفرط بحيث يتم احتساب هذا الدواء فقط للعينات التي تصل إلى 600 OD محددة القيمة أو أعلى.
    2. مرة واحدة تم إدخال القيمة الأخيرة، اضغط على زر "حساب" في الجزء السفلي من الشاشة. تأكد من أن شريط التقدم على اليمين يتغير تدريجيا إلى زreen. لا فتح ملف جدول البيانات أثناء عملية حسابية.
    3. تصدير مجموعتين من البيانات التي تظهر تلقائيا على الشاشة عند الانتهاء من حساب MDT في جدول بيانات. تأكد من أن البيانات تشمل ما يلي: (أ) قيمة MDT لكل بئر يمر اختبار الحد الأدنى من قيمة OD (كما هو مبين في القسم 5.2.1.6) و (ب) نقطة زمنية الأولية للفترة التي تم احتساب مليون دينار تونسي (البداية الوقت).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التحقيق في دور الانزيمات من المسار Doa10 في تدهور ركيزة مراسل

لاختبار صحة طريقة GiLS تم مقارنته مقايسة تدهور التقليدي. هذه التجربة تقيم المساهمة النسبية لمكونات غشاء ER محلية Doa10-E3 يغاز مجمع 20،21 إلى تدهور مراقبة الجودة البروتين مراسل الركيزة Deg1- VU (الشكل 3A). تم دمج البلازميد Deg1- VU إلى خلايا نوع البرية أو في الخلايا التي تفتقر إلى جين انزيم التصريف E2، تم تحديد UBC7 (ubc7) واستقرار البروتين في وقت لاحق من قبل مقايسة فروج مطاردة 6. كشف ومكافحة FLAG immunoblotting مستقر Deg1 -VU البروتين في الخلايا ubc7 الفرقة التي كانت غائبة في خلايا نوع البرية (الشكل 3B). غياب Deg1 -VU في الخلايا هو نوع البرية attribuتيد لتدهور المتواصل الذي ألغي في الخلايا ubc7، مشيرا إلى أن الاستقرار Deg1 -VU يعتمد بقوة على Ubc7.

ومن الواضح أن تدهور Deg1- VU سريع. ومع ذلك، فإن معدل نسبي من تدهور لا يمكن تحديده عن طريق فحص فروج منذ بروتين غير قابل للكشف في خلايا نوع البرية منذ البداية. ونتيجة لذلك، كان يعمل في GiLS طريقة الفحص وضعت حديثا، وذلك لمقارنة الاختلافات النسبية في حركية تدهور البروتين بين النوع البري ومختلف سلالات متحولة (الشكل 3C). في البداية، كانت تزرع نوع، ubc6، ubc7 أو doa10 خلايا البرية معربا عن Deg1 -VU على SD المتوسطة كاملة. لقياس GiLS، وكانت تغسل الخلايا والمحتضنة في SD-URA. أعدم MDT الحساب كما يتضح في البروتوكول. أرقام 3C، 3D تظهر منحنيات نمو مماثلة ويحسب مليون دينار تونسي (~ 2.5 ساعة) لجميع السلالات المزروعة في SD كاملة، excludiنانوغرام إمكانية أن حذف أي من الجينات فحص يؤثر في نمو الخلايا. في المقابل، أدت حضانة في SD-URA في النمو الضعيف للخلايا من النوع البري (MDT = 6.34)، في حين لم يلاحظ سوى وجود خلل نمو طفيف في سلالات متحولة (MDT ~ 3 ساعة).

دراسة تأثير طفرات مختلفة من E2 انزيم التصريف Ubc7 على تدهور Deg1- VU

حقيقة أن Ubc7 مطلوب للغاية لتدهور Deg1- VU يمكن تقييم دقيق للآثار حتى جزئية من مختلف المسوخ E2، حيث أن مجموعة التجريبية من نظام واسع جدا. وفقا لذلك، تم دمج البلازميدات تحتوي على النوع البري أو UBC7 متحولة إلى خلايا Ubc7 معربا عن Deg1 -VU وتم تحديد مساهمتها في التحلل بواسطة GiLS. كما هو متوقع، لوحظت حركية نمو سريع في الخلايا معربا عن Ubc7 مع موقع نشط مو-tants C89S وN81A 22 (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، توقعت اثنين من المسوخ لعرقلة غير مباشرة تم اختبار تدهور Deg1 -VU (V25G وH94K). هذه الطفرات أيضا تعزيز نمو الخلايا، مقارنة مع من النوع البري Ubc7، وإن كان بدرجة أقل من المسوخ موقع نشط (MDTs متوسط ​​3.4 ساعة لV25G وH94K مقارنة مع متوسط ​​MDTs من 2.7 ساعة للC89S وN81K) (الشكل 4 ). وبالتالي، فإن الطريقة GiLS يمكن استخدامها لقياس دقيق للالمساهمة النسبية لعوامل التدهور المختلفة لاستقرار ركيزة المراسل.

العزلة وتقييم degrons رواية

كان يعمل على نظام GiLS أيضا في شكل شاشة عالية الإنتاجية لتحديد degrons الرواية وقياس الفاعلية النسبية، أي الدرجة التي من خلالها إحداث التحلل (الشكل 5). لتحسين تحديد degrons النية الحسنة، مبلغا إضافياتمت إضافة خطوة الاختيار، وهو النمو في وجود حمض Fluoroorotic (5 FOA). Ura3 يحول بكفاءة 5 FOA الى مركب سام (5-فلورويوراسيل) التي يمكن أن تكون بمثابة اختيار إيجابية لعزل سلالات الخميرة حيث زعزعت Ura3 16،23. لتحديد degrons رواية، تم إنشاء مكتبة من البلازميدات مراسل بواسطة شظايا التفجير العشوائية المستمدة من مكتبة الخميرة [كدنا لUra3-GFP البلازميد 24 (الشكل 5A). أضيف شاردة GFP من أجل تمكين شاشة الثانوية وتوفير المعلومات حول توطين الانصهار degron (انظر المناقشة). تم تحويل المكتبة إلى الخميرة، ثم اختيار بحضور 5 FOA (الشكل 5B) واستنساخ إيجابية تم عزل وإعادة المصنفة على لوحات أجار في شكل لوحة 96-جيدا. تم نقل كل مستعمرة إلى لوحة 96-جيدا، حضنت O / N، وتضعف في لوحة 96-بئر جديد كما هو موضح في القسم 2.2. ومن المتوقع أن نمو الخلايا في SD-URA المتوسطةوترتبط درجة Ura3 التعبير، التي هي نتيجة لقوة degron للحث على تدهور. وقد تأكد هذا في وقت لاحق من خلال تطبيق GiLS (الشكل 5C). أكدنا أن جميع المستعمرات اختار عشوائيا والتي تم اختيارها مسبقا مع 5-FOA أظهرت القيم MDT مماثلة، على SD-اليورانيوم منخفض التخصيب المتوسط ​​(الشكل 5C، وأشرطة فارغة). في المقابل، أظهرت جميع الحيوانات المستنسخة معدلات نمو متفاوتة على SD-URA، التي كانت أبطأ بكثير من الخلايا معربا عن السيطرة Ura3-GFP (لا تظهر البيانات). كما هو مبين، هناك علاقة عكسية بين معدل النمو على SD-URA وMDT. وبالتالي، كلما زادت المعالجة المتعددة الأدوية، وأكثر قوة هي degron. في الواقع، كانت جميع MDTs المشتقة من الحيوانات المستنسخة المختارة بشكل إيجابي أعلى من سيطرة (فوق الخط الأحمر) (الشكل 5C، تملأ القضبان).

الجدول 1
<قوي> الجدول 1. توضيحات من حساب وحدة الخميرة مليون دينار تونسي. الزمنية ساعة (ساعة). فارغا والعينة هم من OD 600 يقرأ. التحول (ترانس) هي قيمة OD 600 بعد الطرح فارغة وتصحيح مسار طول. دخول ويتم احتساب 2 من البيانات المحولة. المنحدر هو 2 سجل (OD 600) القيم في فترات متتالية من النقاط 10 مرة مقسوما الوقت. 1 / المنحدر هو الوقت اللازم للسكان الخلية لتكرار نفسها. علامات سوداء المستطيل MDT القيمة. ويمثل المستطيل الأحمر الفاصل الزمني الذي تم احتساب مليون دينار تونسي.

خميرة راثى مصدر
TRy467 α، his3Δ1، lys2Δ0، ura3Δ0، leu2Δ، 0 Euroscarf
TRy508 α، HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS، leu2-3،112، ura3-5، lys2-801 :: Met25-Deg1-العلم-Vma12-Ura3 :: LYS، trp1-1، ubc7 Δ :: LEU2 هذه الدراسة
TRy528 α، HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: HIS، leu2-3،112، ura3-5، lys2-801 :: Met25-Deg1-العلم-Vma12-Ura3 :: LYS، trp1- 1، ubc7Δ :: LEU2 هذه الدراسة
TRy530 α، HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: HIS، leu2-3،112، ura3-5، lys2-801 :: Met25-Deg1-العلم-Vma12-Ura3 :: LYS، trp1- 1، ubc7Δ :: LEU2 هذه الدراسة
TRy532 α، HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: HIS، leu2-3،112، ura3-5، lys2-801 :: Met25-Deg1-العلم-Vma12-Ura3 :: LYS، trp1- 1، ubc7Δ :: LEU2 هذه الدراسة
TRy556 α، HIS3-Δ200 :: :: pRS303 HIS، leu2-3،112، ura3-5، lys2-801 :: Met25-Deg1-العلم-Vma12-Ura3 :: LYS، trp1-1، ubc7Δ :: LEU2 هذه الدراسة
TRy563 α، HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS، leu2-3،112، ura3-5، lys2-801 :: Met25-Deg1-العلم-Vma12-Ura3 :: LYS، trp1-1، ubc7 Δ :: LEU2، ubc6Δ :: KanMX هذه الدراسة
TRy633 α، HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: HIS، leu2-3،112، ura3-5، lys2-801 :: Met25-Deg1-العلم-Vma12-Ura3 :: LYS، trp1- 1، ubc7Δ :: LEU2 هذه الدراسة
TRy786 α، HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS، leu2-3،112، ura3-5، lys2-801 :: Met25-Deg1-العلم-Vma12-Ura3 :: LYS، trp1-1، ubc7 :: اليورانيوم منخفض التخصيب، doa10Δ :: HIS3 هذه الدراسة

= "jove_content"> الجدول 2. قائمة سلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة.

البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة
بلازميد علامات ذات الصلة مصدر
pTR717 YDpK-MET25p-Deg1-العلم-Vma12-Ura3 (تكاملية بلازميد يحتوي LYS1) هذه الدراسة
pTR1412 pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (التخصيب) هذه الدراسة
البلازميدات مراسل إضافية مناسبة
بلازميد علامات ذات الصلة مصدر
pOC9-CL1 pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) (17)
URA3-2 (GFP) pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP لويس وبيلهام

الجدول 3. قائمة البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة المرجعية: لويس، MJ & بيلهام، غير الكفء للموارد البشرية لمراقبة الجودة من البروتينات حساس للحرارة على غشاء البلازما بلوس احد 4، e5038، دوى: 10.1371 / journal.pone.0005038 (2009).

الشكل 1
الشكل 1. مبادئ حساب MDT. خلايا الخميرة Try467 في OD 600 0.22، وحضنت في SD وسائل الإعلام كاملة للفترة الزمنية المشار إليها. أخذت قياسات OD 600 ~ كل 15 دقيقة وتم جمع البيانات في جدول بيانات. (A) تحولت OD 600 القيم من الجدول 1 تآمر ضد الزمن. (ب)سجل 2 من OD 600 تآمر مع الزمن خط أحمر:. يصادفك الفاصل الزمني الذي تم احتساب مليون دينار تونسي (D). تم حساب معدل النمو (C) خميرة (المنحدر) عن طريق قياس التغيرات في OD 600 من نقاط متتالية 10 مرة (على افتراض الخطي) مع مرور الوقت وقت البدء: الساعة التي بدأ الحساب. (D) والوقت اللازم لخميرة لمضاعفة هو معكوس المنحدر من (C) (1 / المنحدر) MDT: إن احتساب الوقت مضاعفة الحد الأدنى (في ساعة).

الرقم 2
الشكل 2. MDTcalc بدء الشاشة: بروتوكول القسم 5.1. قيم الإدخال النموذجية إدخالها ترد.

الشكل 3. قياس تدهور Deg1 -VU. (A) عرض تخطيطي للعناصر مختلفة من البروتين Deg1 -VU وتنظيمها في الغشاء ER. (ب) تحديد تدهور Deg1 -VU بواسطة الفحص فروج في البرية نوع وubc7 الخلايا. وقد تصور خلايا جمعها في وقت الصفر أو هي lysed بعد 30 دقيقة مع فروج وتم فصل البروتينات من قبل 5-15٪ SDS PAGE. Deg1 -VU بواسطة immunoblotting باستخدام الأجسام المضادة المضادة FLAG. خدم G6PD تلطيخ كعنصر تحكم التحميل. (C) وسلالات أشار، معربا عن Deg1 -VU وحضنت في وسائل الإعلام-SD كاملة أو SD-URA لمدة 20 ساعة وقياس OD 600 كل 15 دقيقة. OD 600 هي تحويل القيم. (D) وهذا العلاج لكل سلالة تم حسابها باستخدام MDTcalc.

الرقم 4
الرقم 4. قياس معدلات تدهور النسبية Deg1 -VU في Ubc7 سلالات متحولة اليسار: مؤامرة لتحويل OD 600 القيم المقاسة خلال تكرار W-نوع ILD، ubc7 Δ والمسوخ Ubc7 المشار إليها، في مقابل الوقت. وقد نمت الخلايا معربا عن Deg1 -VU على SD-URA المتوسطة وتم قياس OD 600 ~ كل 15 دقيقة. الحق: تم احتساب MDT لكل سلالة باستخدام MDTcalc.

1 / 52021fig5highres.jpg "العرض =" 500px "/>
الرقم 5. فحص إنتاجية عالية لتحديد وعزل degrons الرواية. (أ) عرض تخطيطي من الميزات لمراسل Ura3-GFP-كدنا]. (ب) رسم بياني يصف الخطوات التجريبية لعزل سلالات الخميرة يحمل degron. تحولت المكتبة بلازميد وصف في داخل الخلايا Try467، تليها الاختيار على لوحات SD-اليورانيوم منخفض التخصيب. تم تكرارها المستعمرات لوحات SD-اليورانيوم منخفض التخصيب تحتوي على 5-FOA والمستعمرات التي تنمو بسرعة جمعت ونظمت على لوحات في صف أمر. (C) معربا عن المستعمرات Ura3-GFP-كدنا] التي نمت على لوحات تحتوي على 5-FOA حضنت في أي من اليورانيوم منخفض التخصيب أو SD-SD-URA وسائل الإعلام لمدة 20 ساعة. تم قياس OD 600 ~ كل 15 دقيقة والوقت الحد الأدنى من الخميرة مضاعفة (MDT) تم حسابها باستخدام برنامج MDTcalc لا degron: البلازميد معربا عن Ura3-GFP دون degron، بمثابة مراقبة إيجابية للغرامowth الخط الأحمر: العتبة التي تحددها قيمة MDT عنصر التحكم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن هنا تصف مقايسة على أساس نمو الخلايا لتحديد النسبية معدلات تدهور البروتين، وتسمى "حركية النمو في الثقافة السائلة في ظل ظروف الانتقائية" (GiLS). الفحص GiLS ديها العديد من المزايا: انها بسيطة لإعداد، والحصول على البيانات وتحليل واضح وصريح وهو نموذجي للغاية. وبالتالي، يمكن تطبيق GiLS في وقت واحد لعينات متعددة في مباراة ودية شكل لوحة متعددة جيدا المستخدم التي يمكن تكييفها مع التشغيل الآلي للتطبيقات إنتاجية عالية. الأهم من ذلك، GiLS توفر بيانات استنساخه للغاية، الكمية وقوية وأكثر مرونة من أجار لوحة المقايسات النمو القائم الذي حدد للالإيجابي / السلبي النمو. بالإضافة إلى ذلك، GiLS هي حساسة للغاية لأنه يمكن الكشف عن وجود اختلافات صغيرة في معدلات تدهور البروتين أو مستويات ثابتة للدولة، وهو ما يعكس نشاط المكونات أو degrons UPS ذات الصلة. أخيرا، المقايسات GiLS تتطلب فترات النمو أقصر بكثير (<12 ساعة) مقارنة growtح فحوصات على لوحات أجار (عادة 2-4 أيام).

في حين أن الفحص GiLS مفيد جدا لدراسة تدهور البروتين، ينبغي أن تؤخذ عدة اعتبارات هامة في الاعتبار. على سبيل المثال، فمن الضروري استخدام خلفية سلالة الخميرة إسوي نظرا لخصائص النمو سلالة معينة. وعلاوة على ذلك، للتأكد من صلاحية الفحص، وينبغي تكرار الفحص كل ثلاث مرات على الأقل في ظل ظروف مماثلة، الأهم من ذلك، يجب أن لا يتم تغيير كثافة الخلية الأولية (OD 600)، ودرجة الحرارة النمو، وزراعة الخلايا شدة الاهتزاز. لذا فمن المستحسن أن البروتوكول فحص معين يتم تخزينها في برنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية للاستخدامات المتكررة. متغير إضافي التي ينبغي النظر فيها هو حيث يتم وضع degron داخل Ura3. لأن الموقف degron قد تحدد وظيفتها، وتحديد المواقع في إما C "أو N 'المناطق يجب اختبارها تجريبيا.

معايرة مراسل البروتوكول الاضافيعين مستوى التعبير هو أمر حاسم لنجاح تطبيق GiLS أيضا. مراسل الأمثل هو الذي تدهورت بشكل فعال من قبل النظام قيد التحقيق، وبالتالي يمنح اليوراسيل auxotrophy. ومع ذلك، يجب أن الاختلافات في auxotrophy أيضا تعكس بأمانة مراسل الاستقرار. هذا يمكن تحديده تجريبيا عن طريق اختبار مسبق للعلاقة بين معدلات بروتين مراسل التدهور، والتي تحددها أساليب الكيمياء الحيوية إضافية، والقيم المعالجة المتعددة الأدوية، التي يحددها GiLS (الشكل 3B). تنشأ مشكلة مشتركة واحدة عندما لا يصل إلى التعبير الحالة المستقرة القاعدية من مراسل مستوى العتبة وبالتالي هي منخفضة جدا لتمكين النمو على SD-URA حتى عندما استقرت تماما. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق وضع التعبير مراسل تحت سيطرة المروج محرض يزيد القاعدية البروتين التعبير دون أن يؤثر ذلك التدهور. النشاط المروج في مثل هذه الأنظمة يجب معايرة بدقة لتجنب نمو دائم على SD-URA بسبب HIGح مستويات البروتين ومراسل نشاط انزيم حتى عندما يكون المتدهورة جزئيا. وقد تم اختيار المروجين والظروف التعبير وصفها في هذه الدراسة لأنها تسمح تنظيم حساسية من بروتين التعبير: MET25p وCUP1 ص هم الذين يروجون الأيض الناجم عن النشاط والتي يمكن ضبطها بدقة من خلال السيطرة على الميثيونين والنحاس، على التوالي (الجدول 3).

يمكن مراقبة الجودة ركائز مراسل (مثل تلك الموضحة في هذه الدراسة) تشكل الحصى داخل الخلايا التي قد عزل Ura3 ومنع وظيفتها. في مثل هذه الحالة اليوراسيل auxotrophy يمكن تفسيره عن طريق الخطأ نتيجة لتدهور البروتين. لاختبار ميل degrons مختلفة لتجميع، ينبغي استخدام مراسل إضافية. على سبيل المثال، مراسل Ura3-GFP مصممة لشاشة degron (الشكل 5A)، يمكن تصور المجاميع داخل الخلايا بواسطة المجهر الفلورسنت الخلايا نموا في بريسيNCE من 5 FOA. هذه المجاميع تظهر كثيفة كما GFP البؤر التي يمكن تمييزها بوضوح من مظهر منتشر من البروتين للذوبان (لا تظهر البيانات). مراسل Ura3-GFP-degron يمكن استخدام مماثل لتحديد تأثير degron على البروتين شارك في التعريب والتوزيع التحت خلوية. فإنه يمكن أن تستخدم أيضا لفي أعقاب تدهور ركائز اختيارهم من قبل التدفق الخلوي، كشاشة ثانوية 25.

والميزة الأكثر أهمية من الأسلوب GiLS هي أنها مرنة بما فيه الكفاية، وبالتالي يمكن بسهولة أن تتكيف مع مجموعة متنوعة من التطبيقات، بالإضافة إلى تلك المذكورة في هذه الوثيقة. على سبيل المثال، يمكن للطريقة أن تستخدم أيضا لفحص اللياقة البدنية للبروتوزوم تحت مختلف الظروف. في هذه الحالة، بروتوزوم الركيزة غير ubiquitylated مثل تنصهر كربوكسيل الأورنيثين (شركة التنمية النفطية) لUra3. الطريقة يمكن أيضا اختبار تدهور البروتين في المقصورات داخل الخلايا متميزة عندما يعمل إشارة توطين محددة.في هذه الدراسة ترتكز Vma12 المراسل إلى غشاء ER (الشكلان 3 و 4). وبالمثل، فإن إشارة توطين النووية (NLS)، ER إشارة الاستبقاء (KDEL) أو العصارة الخلوية (عدم وجود إشارة معينة) يمكن أن تستخدم. ويمكن لنظام تحليل تمكين المتزامن لتدهور البروتين في مختلف المقصورات داخل الخلايا يكون لها تأثير عميق على فهمنا للكيفية التي تعمل على شبكات تدهور البروتين. أخيرا، مبادئ اختيار طريقة يمكن تطبيقها على بحوث من تدهور البروتين في النظم القائمة على نموذج خلية أخرى، من البكتيريا إلى الخلايا البشرية، وكلها تتطلب المنتج URA3 الجينات من أجل البقاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate BD Biosciences 233520 For yeast growth on SD minimal media.  Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan
Ammonium sulfate Sigma - Aldrich A4418
Glucose Sigma - Aldrich 16325
Adenine Sigma - Aldrich A8626
Uracil Sigma - Aldrich U0750
Amino acids Highest purity available 
96-well plates Nunc 167008 Any other compatible brand can be used
Cyclohexamide  Sigma - Aldrich C7698 Working conc. 0.5 mg/ml
Infinite 200 PRO series Tecan For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used.
MDTcalc Experimental software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  2. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
  3. Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
  4. Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
  5. Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
  6. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  7. Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
  8. Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
  9. Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
  12. Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
  13. Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
  14. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
  15. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
  16. Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
  17. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  18. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
  19. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
  20. Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
  21. Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
  22. Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
  23. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
  24. Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
  25. Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 93، تدهور البروتين، اليوبيكويتين، بروتوزوم، خميرة بيكر، حركية النمو، الوقت مضاعفة
الفحص النمو القائم على مراسل لتحليل منهجي من تدهور البروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G.,… More

Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation. J. Vis. Exp. (93), e52021, doi:10.3791/52021 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter