Abstract
유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)에 의한 단백질 분해는 모든 진핵 생물의 단백질 항상성의 주요 규제 메커니즘입니다. 세포 내 단백질 분해를 결정하는 표준 접근 방식은 단백질 감소의 반응 속도를 다음과 같은 사항에 대해 생화학 적 분석에 의존합니다. 이러한 방법은 종종 시간과 노력이 소요되고 여러 기판 및 분해 조건을 평가하기위한 실험을하는 것이 의무가 없습니다. 대안으로, 세포 성장 기반 분석은 정량적 단백질 수준에서의 상대적인 변화를 결정할 수있는 그들의 종래의 형식, 종점 분석법이다이 개발되고있다.
여기에서 우리는 충실하게 효모 세포 성장 속도론에 결합하여 단백질 분해 속도의 변화를 결정하는 방법을 설명합니다. 방법은 URA3의 우라실 영양 요구 효모 세포 외 인적으로 발현 리포터 단백질에 의해 구출 -deleted 확립 선택 시스템에 기초, 필수적인 URA3 유전자 및 열화 행렬식 (degron) 간의 융합 구성. 리포터 단백질의 분해 속도가 degron 의해 결정되는 반면 그 합성 속도가 일정하게되도록 설계된다. 우라실이 결핍 된 배지에서 세포 성장이 URA3의 상대적 수준에 비례하기 때문에, 성장 속도론은 리포터 단백질 분해에 전적으로 의존한다.
이 방법은 정확하게 세포 내 단백질 분해 반응 속도의 변화를 측정한다. (a) E2 효소 컨쥬 게이트 구조 - 기능 (c) 식별 및 신규 degrons의 특성을 분석하여 단백질 분해 (b)에 공지 유비퀴틴 공역 요인의 상대적 기여도를 평가 : 그것은 적용 하였다. 그것은 또한 다른 세포질 통로의 기능과 연관된 단백질 수준의 변화를 모니터링하도록 구성 될 수 degron- URA3 기반 시스템의 적용은, 단백질 분해 필드를 초월.
Introduction
유비퀴틴 - 프로 테아 분해 시스템은 모든 진핵 세포에서 단백질의 항상성 유지에 관여한다 주요 조절 시스템이다. UPS는 처음에 폴리 - 유비퀴틴 태그 단백질 26S 프로 테아 좀에 의해 분해 된 후, 표적 단백질에 여러 유비퀴틴 분자 공액. 대부분의 경우, 유비퀴틴 매개 된 분해에 대한 속도 제한 단계가 E2 효소 컨쥬 게이트 및 E3 효소 결찰에 의해 매개되는 기판 ubiquitylation (E3 리가 제) 1이다. 결과적으로, 특정 단백질의 세포 내 안정성은 유비퀴틴 접합 감수성과 동족 ubiquitylation 효소의 활성을 반영한다.
E3 리가 제는 UPS의 주요 기판 인식 구성 요소입니다. 따라서,이 효소가 없거나 자신의 안정적인 대응이 노출되지 중 하나 그들의 기판 내 degrons을 인식하고 있습니다. 세포주기 m의 예를 들면, 많은 레귤레이터UST 합성 순서 세포주기 진행을 유지하기 위해 시간적으로 특이 적으로 분해 될 수있다. 이러한 단백질의 분해는 종종 세포 시그널링 조절 키나아제에 의해 매개되는 3,4-, 인산화에 의해 제어된다. 반면에, 비정상적으로 접힌 단백질 애매한 degrons 통해 인식된다. 이들은 일반적으로 기본 구조에 숨겨진 구조의 교란에 노출되는 지역이다. 이러한 degrons 소수성 도메인 5-7과 본질적으로 무질서 세그먼트 (8)을 포함한다.
망상 적혈구 용 해물 (9)에서 단백질 분해 및 펀더멘털 특성화 유비퀴틴 시스템의 정액 발견 이래, 효모는 유전학 유비퀴틴 시스템 (10)의 많은 구성 요소를 발견하는 수단이되었다. UPS에 의한 단백질 분해에 대한 체계적인 분석 모델 생물로서 효모의 성공은 UPS가 높다는 사실에 주로 기인LY는 실험 시스템으로 그들의 복종 할 의무와 결합, 모든 진핵 생물 4 보존. 실제로, 효모 기반 시스템은 일반적으로 ubiquitylation 기계의 작용 메커니즘을 해독하기 위해 사용된다.
생화학 적 수단에 의한 단백질 분해를 공부하는 것은 일반적으로 세포 추출물의 준비가 필요합니다. 동물 세포 단백질 단백질 상호 작용 및 기능을 보존 비교적 온화한 조건에서 추출 될 수있는 반면, 효모 11 튼튼한 세포벽의 존재는 단백질의 복구에 영향을 미칠 수있는 붕괴 상당히 엄격한 조건이 필요하다. 실제로, 효모 세포 파괴에 대해 서로 다른 절차가 제대로 상대적인 세포 풍부을 나타내는 양 그대로 단백질을 복구하는 능력에 상당히 다릅니다. 또한 부정확 특정 단백질의 분해 속도를 결정하기 위해 사용되는 다양한 방법에 내재 : IM 다음 대사 라벨 기반의 '펄스 체이스'실험munoprecipitation, 특정 단백질 (12)을 분리, 자주 엄격하게 정량적 없습니다. 단백질 분해가이 방법에 의해 비교 될 때 따라서, 특별한주의는 결과를 해석에서 수행되어야한다. 이러한 결점을 회피하기 위해, 대안 사이클로 헥시 미드 (CHX) 체이스 분석은 (12)를 채용 할 수있다. 이 분석에서, 번역 억제제는 이후 모니터되는 세포 배양 및 단백질 정상 상태 수준의 시간 변화에 첨가된다. 그럼에도 불구하고, CHX의 사용은 비교적 짧은 반감기 (<90 분), 단백질 합성의 장기 억제 세포 독성 인 단백질로 한정한다. 특히, 상술 한 분석법 둘 항상 사용할 수없는 단백질 - 특이 적 항체의 사용을 필요로한다.
이러한 기술적 한계를 극복하기 위해, 연구자들은 세포 추출 및 직접 단백질 처리를 필요로하지 않는 여러 가지 방법을 개발했다. 하나의 접근법은 영양 요 참의 확립에 기초필수적인 대사 효소를 코딩하는 유전자의 결실에 의해 얻어진 세인트 균주. 이러한 유전자는 OMP 디카 르 복실 라제를 코딩 HIS3,는 Leu2, LYS2 및 TRP1, 아미노산 생합성에 필요한 효소 부호화뿐만 아니라 URA3 (URA3), 피리 미딘 리보 뉴클레오티드 생합성 필수적인 효소를 포함한다. URA3 광범위 단백질 분해 연구에서 사용되어왔다. 상기 분석에서, URA3의 구성 적 발현이 우라실 - 결핍 배지 13 URA3 세포의 성장을 구출. 따라서, degron의 융합을 통해 URA3를 불안정화하는 최소 배지에 우라실 결핍 세포의 성장을 감소시킬 수있다. 이 방법은 성능 저하의 식별을 포함하여 다양한 단백질 분해 연구에서 5 결정 사용되고, E3는 14 리가 및 보조 ubiquitylation 15 요인과 새로운 UPS의 degrons (16)의 발견. 이 모든 방법은 분석 판독 등의 한천 플레이트에 세포 성장을 고용했다. 그러나, t그 성장 조건 (양 / 음의 성장), 견고하고 효율적인 주로 질적이며 degron의 효능 또는 다양한 보조 열화 요인의 상대적 기여도를 평가하는 것이 중요하다 정량적 정보를 제공하지 않고있다.
따라서 우리는 개발 및 융합 시스템 -degron URA3에 의해 단백질 분해 체계적이고 정량적 인 분석을 가능하게 효모 벡터 및 심사 방법을 활용했다. 프로토콜은 선택적 조건 하에서 액체 배양 (GILS)과 표준 성장 곡선의 생성에 성장 동역학을 측정하기 쉬운 핸들 분석에 기초한다. 지연, 지수 (로그)과 정지상 - 효모 성장 속도론은 세 가지 주요 단계를 특징으로한다. URA3-degron의 발현의 수준에 의해 결정되는 조건 하에서 선택적 로그 단계 동안 효모 복제 동력학 계산, 공평 정량적 측정을 제공 오F 단백질 분해. 이 방법은 측정하고 동시에 다수의 변형 및 다양한 조건 하에서 여러 UPS 기판의 분해율을 비교에 적용될 수있다.
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Protocol
1. 세포 배양
- 플라스미드의 선택 및 유지를위한 융합 및 (b) 추가의 대사 마커 -degron (a) URA3을 함유하는 플라스미드, 예컨대 Try467 (표 2)와 같은 적절한 영양 요 구성 효모 세포를 변형.
. NOTE - 효모 전사로부터 유도 degron 적절한 플라스미드의 예는 YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV)이이 Deg1 구성된 융합 단백질을 함유하는 효모 통합 플라스미드이다 요인 Mat2 17 FLAG 에피토프 - 안정적인 ER 단백질 및 URA3 15,18 (그림 3A) - 면역, Vma12에 의해 감지. (본 연구에 적합한 플라스미드의 추가 예제에 사용되는 플라스미드는 표 3을 참조하십시오.) - 플라스미드의 선택과 유지 관리를 위해 정의 적절한 합성에서 한천 플레이트에 세포를 유지는 (SD) 매체는 아미노산 선택 마커 부족
- 정상기에 도달 할 때까지, 플라스미드 유지를위한 적절한 선택적 SD 배지에서 30 ° C에서 세포 O / N 성장. 샘플 수 (섹션 2) 피검에 따라 테스트 튜브 또는 96- 웰 플레이트에서 세포를 성장.
분석 2. 셀 준비
- 샘플의 소수 (N≤15)를 분석 할 때, 세포를 희석하여 다음과 같이 매체를 교체 :
- 96 웰 플레이트 (일반 아래)에서 잘 당 SD 매체의 150 μL와 O / N 문화에서 세포의 50 μl를 희석. 빈은 매체를 포함로 첫 번째 샘플이 지정되어 있습니다.
- 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 96- 웰 플레이트에 샘플의 OD 600의 값을 결정한다.
- ㅁ에서 잘 희석 계수 (X4)에 의한 600 OD 판독을 곱하여 각 실제 OD 600 계산빈 독서의 가치를 무형 문화 유산하는 뺀다. 맥주 - 램버트 법칙에 따라 1cm의 계산 된 경로 길이를 얻기 위해 0.55으로 나눈 결과 값을 정규화. 표준 96 웰 플레이트에서 세포에 OD 600 200 μl를 측정 할 때,이 값이 일정한 참고.
- 0.25 600 OD하고 에펜 도르프 튜브로 전송 상당액에서 효모 세포를 얻기 위해 필요한 정확한 부피를 계산.
- 1 분 동안 고속 (12,000 XG)에서 세포를 스핀 다운.
- 상등액을 제거하고 적절한 선택 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁 OD에게 0.25 600을 얻었다 (3.1 절 참조).
- 96 웰 플레이트에 새 우물에 희석 된 균주의 200 μl를 전송합니다.
- 샘플들의 다수 (N> 15)이 테스트 될 때, 다음과 같이, 세포를 희석 전에 OD 600 측정없이 매체를 교체 :
- 고정 된 세포의 10 μl를 전송적절한 선택 배지 190 μL (희석 1:20)를 포함하는 새로운 96 웰 플레이트에 96 웰 플레이트에서 자란 O / N (3.1 절 참조).
선택적 조건에서 액체 배양 3. 성장 속도론 (GILS)
- URA3-degron 기자를 사용하여 성장 측정을 위해 다음과 같은 용지를 사용하십시오 :
- 비 제한 조건에서 효모의 성장, 사용 플라스미드 선택적 SD 미디어의 긍정적 인 컨트롤 (1.2 절 참조). 어떠한 플라스미드의 선택이 필요하지 않은 경우, 예를 들면 Deg1-UV, 필요한 모든 아미노산 (완전한 SD)를 함유하는 SD 배지로 통합 된 플라스미드를 사용하는 경우 사용할 수있다.
- 제한적인 조건에서 성장을 측정하는 실험 샘플은, SD-URA 매체를 사용합니다.
- 멀티 마이크로 플레이트 리더로 설정 :. 15 분의 30 ° C, 600 OD 측정 간격의 배양 온도, 1 분 매 7 분의 궤도 및 선형 진탕 사이클 <BR /> 참고 :이 듀얼 모드는 세포의 균일 한 분포를 얻기 위해 최적화 된 진탕; 그러나, 다른 진동 모드 또는 어떠한 흔들림도 작동 할 수 있습니다.
- 30 ° C에서 세포를 인큐베이션 마이크로 플레이트 리더 O / N 또는 세포 정지상 (12-24 시간)에 도달 할 때까지.
- 스프레드 시트 파일에 원시 데이터를 내 보냅니다.
- (; 자세한 내용은 4 절을 참조하십시오 최소 두배 시간 (MDT)) 세포가 인구의 크기를 두 배로 할 MDTcalc, (시간에) 최소한의 시간을 계산하는 사용자 정의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 효모의 성장 속도론을 결정합니다.
최소 두배 시간 4. 계산 (MDT) : MDTcalc 알고리즘의 원리
NOTE : MDTcalc 알고리즘의 원리, SD 완전 배지에서 자란 Try467 효모 세포 (표 2)의 대표 샘플을 사용하여이 데이터를 스프레드 시트 및 성장 플롯을 보여주는 표 1 및도 1에 도시되어, 스펙상대적으로.
- 웰 샘플에서 얻어진 측정 값 각각으로부터, 각 웰에서 얻어진 OD 600 블랭크 값을 차감한다. 0.55에 의해 얻어진 차이 나눈다 (96 웰 플레이트의 경우)의 광로 길이를 보정한다. 최종 값을 (표 1, 트란스.) 시간에 대하여 플롯 실제 효모 성장 곡선 (OD 600 / 시간) (도 1a)을 생성한다.
- 선형 곡선 (도 1B)으로 대수 증식기를 변환하는 변환 된 값 각각에 대한 2 로그 (OD 600)를 계산한다.
- (도 1C 표 1, 경사) 10 시간 포인트 간격 (N = 10)는 시간 0에서 시작하여 N <10까지 한 번에 하나의 시간 - 점을 이동의 기울기를 계산한다.
- 배로 세포 집단에 필요한 시간 수득 각 슬로프의 역수를 계산 (표 1, 1 / 기울기도 1C). 최소한의 계산1 / 기울기 값은 MDT (; 그림 1C 표 1, 검은 사각형)을 결정합니다. 선택한 시간 간격에서 샘플에서 세포 (표 1, 1 / 기울기, 검은 사각형)에 대한 계산 된 MDT를 추출 (빨간색 사각형으로 설명 표 1, 1B, 1D도).
NOTE : SD-URA 매체상의 세포 성장 속도는 MDT에 반비례한다.
5. MDTcalc 사용
- 컴퓨터의 지정된 폴더로 보충 프로그램 파일을 복사합니다.
- 성장 데이터가 포함 된 스프레드 시트 파일이 저장되고 폐쇄되어 있는지 확인합니다. 화면이 나타납니다 시작을 볼 수있는 MDTcalc 응용 프로그램을 엽니 다.
- 그림 2에서 입증 된 바와 같이, 필요한 정보를 삽입합니다 :
- '파일 경로'에서 스프레드 시트 파일을 찾으려면 오른쪽에있는 사각형을 클릭합니다.
- 여기서 t '시트 이름'에서 스프레드 시트 이름을 쓰기그는 원시 데이터가 있습니다.
- '시작 위치'에서 스프레드 시트가 첫 번째 샘플의 시간 0의 좌표를 삽입합니다.
- '시간 열'에서 시점 컬럼의 위치 (시간은 초 단위로 제공되어야한다) 형성 문자를 삽입한다.
- '빈 열'에서 빈 컬럼의 위치를 정의하는 문자 삽입 (보통을하지만, 96 웰 플레이트의 반드시 잘 A1).
- 'OD 값'에서 MDT 계산의 시작 (일반적으로 0.15-0.25)에 필요한 최소한의 변형 OD 600 값을 선택합니다. MDT는 정의 된 OD 600 값 이상에 도달 샘플에 대해 계산 될 수 있도록이 값을 설정하면 과도한 희석 지연 단계에서 문화에 대한 MDT의 계산을 방지 할 수 있습니다.
- 마지막 값이 입력되면, 화면 하단의 '계산'버튼을 누른다. 오른쪽에 진행 표시 줄이 점차 g로 변경되었는지 확인리엔. 계산 과정에서 스프레드 시트 파일을 열지 마십시오.
- 스프레드 시트로 MDT 계산의 완료시 자동으로 화면에 나타나는 두 세트의 데이터 내보내기. (a) 최소 OD 값 (섹션 5.2.1.6에 설정된 바와 같이) 테스트 및 (b) MDT가 산출되는 구간의 초기 시점을 통과하는 각각의 웰에 대한 MDT 값 (시작 : 데이터가 포함되어 있는지 확인 시간).
- 그림 2에서 입증 된 바와 같이, 필요한 정보를 삽입합니다 :
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Representative Results
리포터 기판의 열화 Doa10 경로의 효소의 역할을 조사
그것이 전통적인 분해 분석과 비교 하였다 GILS 방법의 유효성을 테스트한다. 이 실험은 ER-막의 성분의 상대적 기여도를 평가 지역화 단백질 품질 관리 리포터 기판 Deg1- VU (도 3A)의 열화에 20,21 복잡한 Doa10 E3-리가. Deg1- VU 플라스미드 야생형 세포 내로 또는 E2 공역 효소 유전자를 결핍 세포 내에 통합 된, UBC7 (ubc7)과 단백질의 안정성이어서 CHX 체이스 분석 (6)에 의해 측정 하였다. 안티 - 플래그의 면역 야생 형 세포 (그림 3B)에 결석 ubc7 세포에서 안정적인 Deg1 -VU 단백질 밴드를 한 것으로 밝혀졌습니다. 야생형 세포에서 Deg1 -VU의 부재이다 attribuDeg1 -VU 안정성이 Ubc7에 강하게 종속되어 있음을 나타내는 ubc7 세포에서 폐지 지속적인 저하 테드.
분명히, Deg1- VU의 열화가 빠르다. 그러나, 분해의 상대적인 속도는 단백질은 처음부터 야생형 세포에서 탐지 때문에 CHX 분석으로 결정될 수 없다. 따라서, 새로 개발 GILS 분석 방법은 야생형 및 다양한 변이주 (도 3c) 사이에 단백질 분해의 동력학의 상대적인 차이를 비교하기 위해 사용 하였다. 처음 Deg1 -VU을 표현 야생 유형, ubc6, ubc7 또는 doa10 세포는 SD 완전 배지에 배양 하였다. GILS를 측정하기 위해, 세포를 세척하고, SD-URA 배양 하였다. MDT 계산은 프로토콜에 예시로 실행되었다.도 3C는, 3D가 excludi, 완전한 SD에서 자란 모든 균주에 대해 유사한 성장 곡선과 계산 된 MDT (~ 2.5 시간)을 보여NG 검사 유전자 중 임의의 삭제가 세포 성장에 영향을 미치는 가능성. 단지 소량 성장 결손 변이주 (MDT ~ 3 시간)에서 관찰되었다 반면, 대조적으로, SD-URA의 배양, 야생형 세포 (MDT = 6.34)의 불량한 성장 결과.
Deg1- VU의 열화에 E2 공역 효소 Ubc7 다른 돌연변이의 효과를 검토
실험 시스템의 범위는 매우 넓다 때문에 Ubc7 절대적 Deg1- VU 열화 위해 필요하다는 사실은, 다양한 돌연변이 E2의 부분적인 효과의 정확한 평가를 가능하게한다. 따라서, 야생형 또는 돌연변이 UBC7를 함유하는 플라스미드 Deg1 -VU 열화 기여도가 GILS 따라 측정을 발현 Ubc7 세포에 통합 하였다. 예상 한 바와 같이, 빠른 성장 동역학은 활성 사이트 (μ)와 Ubc7을 발현하는 세포에서 관찰되었다tants C89S와 N81A (22) (그림 4). 또한, 두 개의 돌연변이 간접적으로 Deg1 -VU 저하 (V25G 및 H94K)를 테스트 하였다 방해 예측했다. 이러한 돌연변이는 활성 사이트 돌연변이보다 낮은 정도 (그림 4 (C89S 및 N81K 2.7 시간의 평균 MDTs에 비해 V25G 및 H94K 3.4 시간의 평균 MDTs)에 불구하고, 야생형 Ubc7에 비해 세포 성장 강화 ). 따라서, GILS 방법은 리포터 기판의 안정성 다양한 열화 요인의 상대적 기여도의 정확한 측정을 위해 사용될 수있다.
분리 및 새로운 degrons의 평가
GILS 시스템은 또한 신규 degrons를 식별하고, 즉 상대적인 효능, 그들이 분해 (도 5)을 유도하는 정도를 정량화하기 위해 높은 처리량 스크린 포맷으로 사용 하였다. , 추가를 선의의 degrons의 식별을 최적화하려면플루오로 오로 아세트산 (5-FOA)의 존재하에 성장 인 선택 단계는, 첨가 하였다. URA3 효율적 URA3는 16,23를 불안정하게되는 효모 균주의 분리에 대한 긍정적 인 선택이 될 수있는 독성 화합물 (5- 플루오로 우라실)로 5 FOA 변환합니다. 소설 degrons을 확인하려면, 기자 플라스미드의 라이브러리는 URA3-GFP 플라스미드 (24) (그림 5A)에 효모 cDNA 라이브러리에서 파생 된 임의의 조각을 융합에 의해 생성되었습니다. GFP 잔기는 (설명 참조) 융합 degron의 지역화에 대한 정보를 보조 스크린을 사용하고 제공하기 위해 첨가 하였다. 라이브러리이어서 분리 하였다 -5- FOA (도 5b) 및 양성 클론의 존재 하에서 선택 96- 웰 플레이트 형식으로 한천 플레이트 상에 재 접종, 효모에 형질 전환 하였다. 2.2 절에 설명 된대로 각 식민지는 새로운 96 웰 플레이트에서, 96 웰 플레이트에 옮겨 O / N 배양하고, 희석시켰다. 이는 SD-URA 배지에서 세포의 성장을 예상degron의 효능의 결과가 분해를 유도하는 URA3 발현의 정도와 상관 관계가된다. 이는 후속 GILS (도 5C)을 적용하여 확인 하였다. 5-FOA가 미리 선택된 모든 무작위로 고른 식민지 SD-LEU 매체 (그림 5C, 빈 막대)에, 비슷한 MDT 값을 보여 주었다 우리는 확인했다. 반대로 모든 클론 제어 URA3-GFP를 (데이터 미도시) 발현 세포보다 훨씬 느렸다 SD-URA 가변 증가율을 보였다. 나타낸 바와 같이, SD-URA와 MDT에 증가율 간의 반비례 관계가있다. 따라서, MDT가 높을수록 강력이 degron이다. 사실, 긍정적으로 선택된 클론에서 파생 된 모든 MDTs 컨트롤 (빨간 선 이상) (그림 5C, 충전 바)보다 높았다.
<효모 MDT. 시간 단위의 계산의 강한> 표 1. 그림은 시간 (시간)입니다. OD 600 읽기에서 빈 샘플은 다음과 같습니다. 변환 (트랜스는.) 빈 공제 및 경로 길이 보정 후 OD 600 값입니다. 로그인 (2)는 변환 된 데이터로부터 계산된다. 경사가 로그 2 (OD 600) 시간으로 나눈 10의 시점 간격의 연속 내의 값이다. 1 / 경사 자체 중복 세포 집단에 필요한 시간이다. 검은 사각형 MDT 마크 값. 붉은 사각형 MDT가 산출하는 시간 간격을 표시한다.
| 누룩 | 유전자형 | 출처 |
| TRy467 | α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ0 | Euroscarf |
| TRy508 | α, HIS3 - Δ200 : pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA : HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1 플래그 - Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ ::는 Leu2 | 이 연구 |
| TRy528 | α, HIS3 - Δ200 : pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1 플래그 - Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ ::는 Leu2 | 이 연구 |
| TRy530 | α, HIS3 - Δ200 : pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1 플래그 - Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ ::는 Leu2 | 이 연구 |
| TRy532 | α, HIS3 - Δ200 : pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1 플래그 - Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ ::는 Leu2 | 이 연구 |
| TRy556 | α, HIS3 - Δ200 : pRS303 :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1 플래그 - Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7Δ ::는 Leu2 | 이 연구 |
| TRy563 | α, HIS3 - Δ200 : pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA : HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1 플래그 - Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ ::는 Leu2, ubc6Δ :: KanMX | 이 연구 |
| TRy633 | α, HIS3 - Δ200 : pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1 플래그 - Vma12-URA3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ ::는 Leu2 | 이 연구 |
| TRy786 | α, HIS3 - Δ200 : pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA : HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1 플래그 - Vma12-URA3 :: LYS, trp1-1, ubc7 :: LEU, doa10Δ :: HIS3 | 이 연구 |
본 연구에 사용 된 효모 균주의 표 2. 목록.
| 본 연구에 사용 된 플라스미드 | ||
| 플라스미드 | 관련 마커 | 출처 |
| pTR717 | YDpK-MET25p-Deg1-플래그-Vma12-URA3 (통합 플라스미드 LYS1 함유) | 이 연구 |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (LEU) | 이 연구 |
| 추가 적합한 기자 플라스미드 | ||
| 플라스미드 | 관련 마커 | 출처 |
| pOC9-CL1 | pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) | (17) |
| URA3-2 (GFP) | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | 루이스와 펠햄 |
표 본 연구에 사용 된 플라스미드 3. 목록 참조 :.. 루이스, MJ & 펠햄, 세포막에 열성 단백질의 HR 비효율적 인 품질 관리 PLOS ONE 4, e5038, DOI : 10.1371 / journal.pone.0005038 (2009).
MDT의 계산 1. 원리를 그림. 0.22 OD 600에서 Try467 효모 세포, 지정된 시간 기간 동안 SD 완전 배지에서 배양 하였다. OD 600 측정은 매 ~ 15 분을 촬영하고, 데이터가 스프레드 쉬트에 수집 하였다. (A) 표 1에서 변형 된 OD 600 값은 시간이 역모를 꾸몄다. (B). OD 600의 2 시간이 역모를 꾸몄다 레드 라인 로그 : MDT 계산되었던 시간 간격 (D)를 표시합니다. (C) 효모 성장률 (경사)은 시간이 지남에 연속 10 시간 포인트 (가정 선형성)의 OD (600)의 변화를 측정하여 계산 하였다 시간을 시작합니다. 계산이 시작되었던 시간. . (시간)에서 산출 된 최소 더블링 시간 : (D) 배로 효모에 필요한 시간은 (C) (1 / 경사) MDT에서 기울기의 역수이다.
프로토콜 섹션 5.1 : 그림 2. 시작 화면 MDTcalc. 일반적인 입력 값이 표시됩니다 입력해야합니다.
Ubc7 돌연변이 균주에서 Deg1 -VU 그림 4. 측정 상대 분해율 왼쪽 :. W ILD 형, ubc7의 Δ 및 표시 Ubc7 돌연변이, 대 시간의 복제 동안 측정 변환 된 OD 600 값의 플롯. Deg1 -VU를 발현하는 세포는 SD-URA 배지상에서 성장시키고 OD 600 ~ 15 분마다 측정 하였다. 오른쪽 : 각 균주 MDT는 MDTcalc을 사용하여 계산 하였다.
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그림 5. 새로운 degrons의 식별 및 분리를위한 높은 처리량 분석. (A) URA3-GFP-의 cDNA 기자의 기능의 도식 표현. (B) degron 운반 효모 균주의 분리를위한 실험 절차를 설명하는 흐름도. 에 기술 된 플라스미드 라이브러리는 SD-LEU 판에 선택에 의해 다음 Try467 세포로 변형되었다. 식민지가 SD-LEU의 5-FOA를 포함하는 접시와 빠르게 성장하고 식민지로 복제 된 수집 및 순서 배열 판에 조직되었다. (C) 식민지는 SD-LEU 또는 SD-URA 20 시간 동안 매체를 통해 배양 된 5-FOA를 포함하는 판에 성장 URA3-GFP-cDNA를 표현. OD 600 MDTcalc 소프트웨어를 사용하여 계산 된 모든 ~ 15 분, 최소한의 효모 배가 시간 (MDT)을 측정했다 없음 degron을 :. degron없이 URA3-GFP를 발현하는 플라스미드를, GR에 대한 긍정적 인 제어 역할owth 레드 라인 :. 컨트롤의 MDT 값으로 결정 임계 값.
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Discussion
여기에서 우리는 (GILS) '선택적 조건에서 액체 배양에서 성장 속도론'라고 상대 단백질 분해 속도를 결정하는 세포의 성장을 기반으로 분석을 설명합니다. 그것은 설정하는 간단한 데이터 수집 및 분석은 간단하고 매우 모듈 형 : GILS 분석은 몇 가지 장점이 있습니다. 따라서, 높은 처리량 GILS 애플리케이션을위한 자동화하도록 적응 될 수있는 사용자 친화적 인 멀티 웰 플레이트 형식으로 여러 개의 샘플에 동시에 적용될 수있다. 가장 중요한 것은, GILS는 매우 재현 양적 및 강력한 데이터를 제공하고, 양 / 음 성장을위한 선택 한천 플레이트를 기반으로 성장 분석보다 더 유연하다. 또한, GILS 관련 UPS 성분 또는 degrons의 활성을 반영가 단백질 분해 속도 또는 정상 수준에 작은 변화를 감지 할 수 있다는 점에서 매우 민감하다. 마지막 GILS 분석법은 growt 비교 (<12 시간)이 크게 성장 짧은 기간을 필요한천 플레이트 (일반적으로 2~4일)에 시간 분석.
GILS 분석은 단백질 분해를 연구하는데 매우 유용하지만, 몇 가지 중요한 고려 사항이 고려되어야한다. 예를 들어, 인한 변형 비 성장 특성 동질 효모 균주 배경을 사용하는 것이 필수적이다. 또한, 분석 유효성을 확인하기 위해, 각각의 분석은 동일 조건 하에서 적어도 3 회 반복한다, 무엇보다도 초기의 세포 밀도 (OD 600), 성장 온도, 및 세포 배양 진탕 강도는 변경되지 않아야한다. 이는 따라서, 특정 분석 프로토콜 반복 사용을 위해 마이크로 플레이트 리더의 소프트웨어에 저장하는 것이 좋다. degron가 URA3 내에 위치되는 경우 고려되어야 추가 변수이다. degron 위치가 C '또는 N'영역 중 하나에 배치하는, 그 기능을 확인할 수있는 바와 같이 경험적 테스트되어야한다.
기자 제자의 교정EIN 발현 수준은 GILS의 성공적인 적용을위한 중요합니다. 최적 리포터 효율적 조사중인 시스템에 의해 분해되는 하나이고, 따라서 우라실 영양 요 구성을 부여한다. 그러나, 영양 요 구성의 변화도 충실하게 기자의 안정성을 반영해야한다. 이것은 GILS (도 3b)에 의해 결정된 부가적인 생화학 적 방법에 의해 결정될 리포터 단백질 분해 속도, 및 MDT 값 사이의 상관 관계의 사전 테스트에 의해 경험적으로 결정될 수있다. 하나의 일반적인 문제는 리포터의 기저 정상 발현이 임계 수준에 도달하지 않을 때 발생하고 완전히 안정화에도 SD-URA의 성장을 가능하게하는 것이 너무 낮다. 이러한 문제는 열화에 영향을주지 않고 기저 단백질 발현을 증가 유도 성 프로모터의 제어하에 리포터 발현을 배치함으로써 극복 될 수있다. 이러한 시스템에서의 프로모터 활성 미세 HIG에 의한 SD-URA에 영구적 성장을 방지하도록 조정되어야시간 단백질 수준과 부분적 열화에도 리포터 효소 활성. 그들이 단백질 발현의 중요한 조절 가능하기 때문에 본 연구에서 설명 된 프로모터 및 발현 조건 선택 하였다 : MET25p 및 CUP1의 p는 대사 - 유도 프로모터 미세 메티오닌 및 구리, 각각 (표 3)의 제어를 통해 조정될 수있는 활성이다.
(이 연구에서 기술 된 것과 같은) 품질 관리 기자 기판 URA3을 격리시키는와 그 기능을 방해 할 수 세포 응집체를 형성 할 수 있습니다. 이러한 경우 우라실 영양 요구 실수 단백질 분해의 결과로 해석 될 수있다. 집계 다른 degrons의 경향을 테스트하려면, 추가로 기자를 채용해야한다. 예를 들어, degron 화면 (도 5A)을 위해 설계 URA3-GFP 리포터는 prese에서 성장하는 세포의 형광 현미경으로 세포 응집체의 시각화를 가능하게5-FOA의 NCE. 이러한 응집체 명확 가용성 단백질의 확산 외관 구별 조밀 GFP 병소 표시 (데이터 미도시). URA3-GFP-degron 리포터 유사 단백질 공동 현지화 및 세포 내 분포 degron의 효과를 결정하기 위해 사용될 수있다. 또한, 보조 스크린 (25), 유동 세포 계측법에 의하여 선정 된 기판의 열화를 다음에 사용될 수있다.
GILS 방법의 가장 중요한 장점은 충분히 유연하며, 따라서 용이하게 본원에 기재된 것들 이외에 다양한 용도에 적응 될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 방법은 다양한 조건 하에서 테아의 적합성을 검사하는 데 사용된다. 이 경우, 비 ubiquitylated 테아 기판 오르니 틴 디카 르 복실 라 아제 (ODC)는 URA3 융합 등. 특정 이행 시그널 이용하는 경우이 방법은 또한 별개의 세포 내 구획에서 단백질 분해를 테스트 할 수있다.본 연구에서는 Vma12는 (그림 3, 4) ER-막에 기자를 고정. 유사하게, 핵 이행 시그널 (NLS), ER 체류 신호 (KDEL) 또는 세포질 (특정 신호의 유무)가 사용될 수있다. 다양한 세포 내 구획에서 단백질 분해의 동시 분석을 가능하게하는 시스템은 단백질 분해 네트워크가 어떻게 작동하는지에 대한 우리의 이해에 지대한 영향을 미칠 수 있습니다. 최종적으로, 선택 방법의 원리는 생존 URA3 유전자 산물을 필요 모두 인간 세포에 박테리아에서 다른 모델 셀 기반 시스템에서 단백질 분해 연구에 적용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
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