Abstract
La dégradation des protéines par le système ubiquitine-protéasome (UPS) est un mécanisme majeur de la protéine de régulation de l'homéostasie dans tous les eucaryotes. L'approche standard pour déterminer la dégradation des protéines intracellulaires repose sur des tests biochimiques pour suivre la cinétique de la baisse de la protéine. Ces méthodes sont souvent laborieux et fastidieux et donc ne se prêtent pas à des expériences visant à évaluer plusieurs substrats et conditions de dégradation. Comme alternative, les dosages en fonction de la croissance de cellules ont été développés, qui sont, dans leur format classique, point final des analyses qui ne peuvent pas déterminer quantitativement les variations relatives des niveaux de protéines.
Nous décrivons ici une méthode qui détermine fidèlement l'évolution des taux de dégradation des protéines en les couplant à levure cinétique de croissance des cellules. La méthode est basée sur un système de sélection mis en place où l'uracile auxotrophic de URA3 Supprimé par les cellules de levure est sauvé par une protéine rapporteur exogène exprimée, Composé d'une fusion entre le gène URA3 et un déterminant essentiel de la dégradation (de degron). La protéine rapporteur est conçu de telle sorte que sa vitesse de synthèse est constant tandis que le taux de dégradation est déterminé par le degron. Comme la croissance de la cellule dans un milieu déficient en uracile est proportionnelle aux niveaux relatifs de Ura3, la cinétique de croissance dépendent entièrement de la dégradation de la protéine rapporteur.
Cette méthode permet de mesurer avec précision les changements dans la cinétique de dégradation intracellulaire des protéines. Il a été appliqué à: (a) L'évaluation de la contribution relative des facteurs de l'ubiquitine conjugaison connus à la protéolyse (b) E2 enzyme conjuguant structure-fonction des analyses (c) Identification et caractérisation de nouveaux degrons. Application du système à base de URA3 degron- dépasse le domaine de la dégradation des protéines, comme il peut également être adapté à la surveillance des changements de niveaux de protéines associées à d'autres fonctions des voies cellulaires.
Introduction
Le système de dégradation ubiquitine-protéasome est un appareil de régulation principal, qui a été impliquée dans le maintien de l'homéostasie des protéines dans tous les eucaryotes. L'onduleur conjugue initialement plusieurs molécules d'ubiquitine à une protéine cible, après quoi la protéine de poly-ubiquitine marqué est dégradée par le protéasome 26S. Dans la plupart des cas, le taux étape pour l'ubiquitine médiation dégradation limitant est ubiquitylation substrat, médiée par la conjugaison d'enzymes E2 et E3 ligature enzymes (E3 ligases) 1. Par conséquent, la stabilité intracellulaire de protéines spécifiques reflète leur sensibilité à la conjugaison à l'ubiquitine et l'activité de leurs enzymes ubiquitylation apparentées.
Ligases E3 sont les principaux composants de reconnaissance de substrat de l'onduleur. En tant que tels, ces enzymes reconnaissent degrons au sein de leurs substrats qui sont absents ou ne sont pas exposés à leurs isotopes stables 2. Par exemple, de nombreux régulateurs du cycle cellulaire must être synthétisé et dégradé de façon spécifique dans le temps afin de maintenir la progression du cycle cellulaire dans l'ordre. La dégradation de ces protéines est souvent contrôlée par la phosphorylation médiée par les kinases régulées de signalisation cellulaire 3,4. D'autre part, les protéines aberrante-croisés sont reconnus par degrons cryptiques. Ce sont des régions qui sont normalement cachés dans la structure native et sont exposés à la structure perturbation. Ces degrons comprennent des domaines hydrophobes et 5-7 segments intrinsèquement désordonnées 8.
Depuis la découverte de la charnière, le système de l'ubiquitine de la dégradation des protéines et de la caractérisation des bases dans des lysats de réticulocytes 9, la génétique des levures a joué un rôle dans la découverte de plusieurs des composants du système 10 de l'ubiquitine. Le succès de la levure comme organisme modèle pour l'analyse systématique de la dégradation des protéines par l'onduleur est principalement dû au fait que l'onduleur est élevément conservé chez tous les eucaryotes 4, couplée à leur susceptibilité comme un système expérimental. En effet, les systèmes à base de levure sont couramment utilisés pour déchiffrer les mécanismes d'action de l'appareil d'ubiquitination.
L'étude de la dégradation des protéines par des moyens biochimiques nécessite généralement la préparation d'extraits cellulaires. Bien que les protéines de cellules animales peuvent être extraites dans des conditions relativement douces qui préservent les interactions et la fonction des protéines, la présence d'une paroi cellulaire robuste dans la levure 11 exige des conditions de perturbation considérablement plus sévères qui peuvent affecter la récupération des protéines. En effet, différentes procédures de rupture des cellules de levure varient considérablement dans leur capacité à récupérer les protéines intactes dans les montants qui représentent correctement leur abondance cellulaire relative. En outre imprécision est inhérente aux différentes méthodes utilisées pour déterminer les taux de protéines spécifiques de dégradation: expériences métaboliques base étiquetage-pulse-chase '' suivi par immunoprecipitation, pour isoler des protéines spécifiques 12, est souvent pas strictement quantitative. Ainsi, lorsque la dégradation des protéines est comparée par cette méthode, des précautions particulières doivent être prises dans l'interprétation des résultats. Pour contourner cet inconvénient, une solution de rechange cycloheximide (CHX) essai de chasse peut être utilisé 12. Dans cet essai, l'inhibiteur de la traduction est ajouté à des cultures de cellules et des variations temporelles du niveau d'état stable de protéines sont ensuite surveillés. Néanmoins, l'utilisation de CHX est limitée à des protéines relativement courte demi-vie (<90 min), que l'inhibition à long terme de la synthèse de protéine est cytotoxique. En particulier, à la fois des dosages mentionnés ci-dessus nécessitent l'utilisation d'anticorps spécifiques de la protéine, qui ne sont pas toujours disponibles.
Pour surmonter ces limitations techniques, les chercheurs ont développé plusieurs approches qui ne nécessitent pas l'extraction de cellule et de la manipulation directe de la protéine. Une approche est basée sur la mise en place de oui auxotrophiquest souches, obtenues par la délétion des gènes codant pour des enzymes métaboliques essentielles. De tels gènes comprennent HIS3, LEU2, LYS2 et TRP1, codant pour des enzymes nécessaires à la biosynthèse d'acides aminés, ainsi que URA3 qui code pour l'OMP décarboxylase (Ura3), une enzyme essentielle de la biosynthèse de la pyrimidine ribonucléotide. Ura3 a été largement utilisé dans les études de dégradation des protéines. Dans ces essais, l'expression constitutive de Ura3 sauve la croissance des cellules dans un milieu de ura3 déficient en uracile 13. Par conséquent, la déstabilisation Ura3 par la fusion d'une degron peut diminuer la croissance des cellules sur milieu minimum dépourvu d'uracile. Cette méthode a été utilisée dans plusieurs études de dégradation des protéines, y compris l'identification des déterminants de la dégradation 5, E3 ligases 14 et facteurs ubiquitylation auxiliaire 15 et la découverte de nouveaux UPS degrons 16. Toutes ces méthodes employées croissance des cellules sur des plaques de gélose que l'essai de lecture. Cependant, le til critère de croissance (croissance positive / négative), tandis que robuste et efficace, est surtout qualitative et ne fournit pas d'information quantitative qui est important pour l'évaluation de la puissance d'un degron ou la contribution relative des différents facteurs de dégradation auxiliaires.
Nous avons donc mis au point et utilisé des vecteurs de levure et les méthodes de criblage permettant une analyse systématique et quantitative de la dégradation des protéines par le URA3 -degron système de fusion. Le protocole est basé sur un test-à-poignée facile qui mesure la cinétique de la croissance en culture liquide dans des conditions sélectives (SLIG) et sur la génération de courbes de croissance standard. cinétique de croissance de la levure sont caractérisées par trois phases principales - le décalage, l'exponentielle (LOG) et la phase stationnaire. Le calcul de la cinétique de réplication de levure au cours de la phase logarithmique dans des conditions sélectives, qui est déterminée par les niveaux d'expression de la Ura3-degron, fournit une mesure quantitative non biaisée of dégradation des protéines. Ce procédé peut être appliqué à la mesure et la comparaison des taux de plusieurs substrats de l'onduleur de dégradation simultanément dans de multiples souches et dans diverses conditions.
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Protocol
1. Culture cellulaire
- Transformer des cellules de levure auxotrophes appropriés, tels que Try467 (tableau 2), avec un plasmide contenant (a) un URA3 -degron fusion et (b) un marqueur métabolique supplémentaire pour la sélection de plasmide et d'entretien.
REMARQUE: Un exemple d'un plasmide approprié est YDpK-MET25p-DEG1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Ceci est un plasmide intégratif de levure contenant une protéine de fusion comprenant de DEG1 - un degron dérivé de la transcription de levure. mat2 facteur 17, épitope FLAG - pour la détection par immuno-empreinte, Vma12 - une protéine ER stables, et Ura3 15,18 (figure 3A). (Voir le tableau 3 pour les plasmides utilisés dans cette étude et pour d'autres exemples de plasmides appropriés.) - Pour la sélection du plasmide et la maintenance, conserver les cellules dans des plaques d'agar sous un synthétique appropriée (SD) définis milieu dépourvu de marqueurs de sélection d'acides aminés
- Cultiver les cellules O / N à 30 ° C dans un milieu sélectif SD approprié pour le maintien du plasmide jusqu'à ce que la phase stationnaire est atteinte. Cultiver les cellules dans des tubes à essai ou dans une plaque à 96 puits, en fonction du nombre d'échantillons à analyser (section 2).
2. Préparation des cellules pour l'analyse
- Quand un petit nombre d'échantillons (N≤15) sont à doser, de diluer les cellules et remplacer le milieu comme suit:
- Diluer 50 pi de cellules à partir d'une culture O / N avec 150 pi de milieu SD par puits dans une plaque de 96 puits (fond clair). A noter, le premier échantillon est désigné comme milieu ne contient vide.
- Déterminer les OD 600 valeurs des échantillons dans la plaque de 96 puits en utilisant un lecteur de microplaques.
- Calculer le diamètre extérieur réel 600 dans chaque puits en multipliant la lecture DO 600 par le facteur de dilution (x4), à partir de which la valeur de la lecture à blanc est soustraite. Normaliser les valeurs obtenues en divisant par 0,55 pour obtenir une longueur de trajet de 1 cm calculée selon la loi de Beer-Lambert. Notez que cette valeur est constante en mesurant la DO600 de 200 ul de cellules dans une plaque à 96 puits standard.
- Calculer le volume exact nécessaire à l'obtention des cellules de levure à un montant équivalent à DO600 de 0,25 et le transférer dans un tube Eppendorf.
- Isoler les cellules à grande vitesse (12 000 xg) pendant 1 min.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu sélectif approprié (voir la section 3.1) pour obtenir DO600 de 0,25.
- Transférer 200 ul des souches dilué à un nouveau puits dans une plaque de 96 puits.
- Quand un grand nombre d'échantillons (N> 15) sont à tester, diluer les cellules et remplacer le milieu sans préalable mesure OD 600, comme suit:
- Transférer 10 ul de cellules stationnairesadulte O / N dans une plaque de 96 puits dans une nouvelle plaque de 96 puits contenant 190 pi (dilution 1:20) des milieux sélectifs appropriés (voir section 3.1).
3. cinétique de croissance en culture liquide dans des conditions sélectives (Gils)
- Les supports suivants sont pour des mesures de croissance à l'aide de la journaliste Ura3-degron:
- Pour les contrôles positifs de la croissance de la levure dans des conditions non restrictives, utilisation plasmide médias SD sélectif (voir section 1.2). Si aucune sélection de plasmide est requise, par exemple, lors de l'utilisation d'un plasmide intégratif comme DEG1 -UV, milieu SD contenant tous les acides aminés nécessaires (SD complète) peut être utilisé.
- Pour les échantillons expérimentaux mesure de la croissance dans des conditions restrictives, utilisez milieu SD-URA.
- Fixer un lecteur de microplaques multimode à:. Une température d'incubation de 30 ° C, OD 600 intervalles de mesure de 15 min, et un cycle d'orbite linéaire et agitation de 1 minute toutes les sept minutes <br /> NOTE: Ce double mode secousse a été optimisé pour obtenir une répartition homogène de cellules; Cependant, d'autres modes de secouer ou même sans agitation peuvent fonctionner aussi bien.
- Incuber les cellules à 30 ° C dans un lecteur de microplaques O / N ou jusqu'à ce que les cellules ont atteint la phase stationnaire (12 à 24 h).
- Exporter les données brutes dans un fichier tableur.
- Déterminer la cinétique de croissance de levure en utilisant MDTcalc, un logiciel personnalisé qui calcule le temps minimum (en h) pour les cellules de doubler la taille de leur population (Minimal Doublement du temps (MDT); pour plus de détails, voir la section 4).
4. Calcul de Minimal temps de doublement (MDT): Principes de l'algorithme MDTcalc
NOTE: Les principes de l'algorithme MDTcalc, en utilisant un échantillon représentatif de cellules de levure Try467 (tableau 2) cultivées dans des milieux complets SD, sont illustrés dans le Tableau 1 et la Figure 1, montrant une feuille de données et de croissance parcelles, respecment.
- Soustraire OD 600 valeurs à blanc, obtenu dans le puits respectif, à partir de chacune des valeurs obtenues dans le puits d'échantillon. Diviser les différences résultant par 0,55 (pour des plaques à 96 puits) pour corriger la longueur du trajet de la lumière. Tracer les valeurs finales (tableau 1, Trans.) Contre le temps pour produire la courbe de croissance de la levure réelle (DO600 / h) (figure 1A).
- Calculer log 2 (OD 600) pour chacune des valeurs transformées pour convertir la phase de croissance logarithmique dans une courbe linéaire (figure 1B).
- Calculer la pente d'un intervalle de 10 points dans le temps (N = 10) à partir de l'instant 0 et déplacement d'un point dans le temps à la fois jusqu'à ce que N <10 (tableau 1, la pente, la figure 1C).
- Calculer la valeur inverse de la pente de chaque obtenir le temps nécessaire pour que la population de cellules de doubler (tableau 1, 1 / pente, la figure 1C). Calculer le minimum1 / valeur de la pente pour déterminer le MDT (tableau 1, rectangle noir; figure 1C). Extrait MDT calculé pour les cellules de l'échantillon (tableau 1, 1 / pente, rectangle noir) de l'intervalle de temps choisi (tableau 1, délimitée par le rectangle rouge, les figures 1B, 1D).
NOTE: Le taux de croissance des cellules sur milieu SD-URA est inversement proportionnelle à la MDT.
5. Utilisation MDTcalc
- Copiez les fichiers du programme complété dans un dossier désigné sur l'ordinateur.
- Assurez-vous que le fichier de feuille de calcul contenant les données de croissance est enregistré et fermé. Ouvrez le programme d'application MDTcalc pour voir le début apparaît.
- Insérez les informations nécessaires, comme le montre la figure 2:
- Sous "Chemin du fichier", cliquez sur le rectangle sur la droite pour localiser le fichier de feuille de calcul.
- Sous "Nom de la feuille», écrire le nom de la feuille de calcul où til est situé données brutes.
- Sous la rubrique «Position de départ», insérer la feuille de calcul de coordonnées de temps 0 du premier échantillon.
- Sous «colonne Time», insérer la lettre définissant l'emplacement de la colonne de point de temps (temps devrait être fournie en secondes).
- Sous «colonne vide», insérer la lettre définissant l'emplacement de la colonne vide (généralement, mais pas nécessairement dans le puits A1 de la plaque de 96 puits).
- Sous «valeur de DO ', choisissez l'transformé DO600 valeur minimale requise pour l'initiation de calcul MDT (généralement 0,15-0,25). La définition de cette valeur empêche les calculs de la PCT pour les cultures en phase de latence due à une dilution excessive de sorte que la PCT est calculée uniquement pour les échantillons qui atteignent la valeur DO 600 ou plus défini.
- Une fois la dernière valeur a été saisi, appuyez sur le bouton 'Calculer' au bas de l'écran. Assurez-vous que la barre de progression sur la droite se transforme progressivement en green. Ne pas ouvrir le fichier de feuille de calcul au cours du processus de calcul.
- Exportez les deux ensembles de données qui apparaissent automatiquement à l'écran à la fin du calcul MDT dans un tableur. Veiller à ce que les données comprennent: (a) la valeur MDT pour chaque bien qui passe le test de valeur de DO minimal (tel que défini à la section 5.2.1.6) et (b) le point de temps initial de l'intervalle à partir de laquelle le PCT a été calculé (Démarrer temps).
- Insérez les informations nécessaires, comme le montre la figure 2:
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Representative Results
Etude du rôle des enzymes de la voie Doa10 dans la dégradation d'un substrat reporter
Pour tester la validité de la méthode SLIG il a été comparé à un essai de dégradation traditionnel. Cette expérience évalue la contribution relative des composantes de l'ER-membrane localisée Doa10 E3 ligase complexe 20,21 à la dégradation du substrat rapporteur de contrôle de la qualité des protéines Deg1- VU (figure 3A). Le plasmide Deg1- VU a été intégré dans les cellules de type sauvage ou dans des cellules dépourvues du gène de l'enzyme de conjugaison E2, UBC7 (ubc7) et la stabilité de la protéine a ensuite été déterminée par un dosage de chasse de 6 CHX. Immunoblot anti-FLAG a révélé une bande de protéine DEG1 -vu stable dans des cellules ubc7 qui était absente dans les cellules de type sauvage (figure 3B). L'absence de DEG1 -vu dans les cellules de type sauvage est attribuTed à sa dégradation continue qui a été aboli dans les cellules ubc7, indiquant que la stabilité DEG1 -vU est fortement dépendante de Ubc7.
Il est évident que la dégradation de Deg1- VU est rapide. Cependant, la vitesse relative de dégradation ne peut être déterminée par un essai de CHX puisque la protéine est indétectable dans les cellules de type sauvage à partir de l'origine. Par conséquent, la méthode de dosage Gils nouvellement développé a été utilisé, afin de comparer les différences relatives à la cinétique de la dégradation des protéines entre type sauvage et diverses souches mutantes (figure 3C). Initialement, les cellules de type, ubc6, ubc7 ou doa10 sauvages exprimant DEG1 -vU ont été cultivées sur milieu complet SD. Pour mesurer Gils, les cellules ont été lavées et incubées dans SD-URA. Calcul MDT a été exécuté comme illustré dans le protocole. Figures 3C, 3D montrent des courbes de croissance similaires et calculé MDT (~ 2,5 h) pour toutes les souches cultivées en SD complète, excluding de la possibilité que la suppression de l'un quelconque des gènes examinés affecte la croissance cellulaire. En revanche, l'incubation dans SD-URA a donné lieu à une faible croissance de cellules de type sauvage (MDT = 6.34), alors que seulement un défaut de croissance mineure a été observée dans les souches mutantes (MDT ~ 3 h).
Examiner l'effet des différents mutants de l'enzyme de conjugaison E2 Ubc7 sur la dégradation de Deg1- VU
Le fait que Ubc7 est absolument indispensable à la dégradation Deg1- VU permet une évaluation précise de même des effets partiels de différents mutants de E2, puisque la gamme expérimentale du système est très large. En conséquence, des plasmides contenant de type sauvage ou mutant UBC7 ont été intégrés dans les cellules exprimant Ubc7 DEG1 -vU et leur contribution à la dégradation a été déterminée par Gils. Comme on s'y attendait, la cinétique de croissance rapide ont été observés dans des cellules exprimant Ubc7 avec le site actif mutants C89S et N81A 22 (Figure 4). En outre, les deux mutants prédits pour empêcher la dégradation indirectement DEG1 -vu (V25G et H94K) ont été testés. Ces mutations ont également amélioré la croissance des cellules, par rapport au type sauvage Ubc7, quoique à un degré moindre que les mutants du site actif (EMD moyenne de 3,4 heures pour V25G et H94K par rapport à EMD moyenne de 2,7 heures pour C89S et N81K) (Figure 4 ). Ainsi, le procédé SLIG peut être utilisé pour une mesure précise de la contribution relative des différents facteurs de dégradation de la stabilité d'un substrat reporter.
L'isolement et l'évaluation de nouveaux degrons
Le système Gils a également été employé dans un format d'écran à haut débit pour identifier de nouveaux degrons et quantifier leur puissance relative, à savoir, le degré par lequel ils induisent la dégradation (Figure 5). Afin d'optimiser l'identification des degrons de bonne foi, un montant supplémentaire del'étape de sélection, qui est la croissance en présence de l'acide fluoroorotique (5-FOA), a été ajouté. Ura3 convertit 5-FOA efficace en un composé toxique (5-fluoro-uracile) qui peuvent servir de sélection positive pour l'isolement des souches de levure où Ura3 est déstabilisée 16,23. Pour identifier de nouveaux degrons, une bibliothèque de plasmides rapporteurs a été généré par fusion de fragments aléatoires issus d'une banque d'ADNc de levure Ura3 plasmide GFP-24 (figure 5A). La fraction de la GFP a été ajouté afin de permettre un écran secondaire et fournir des informations sur la localisation de la degron de fusion (voir la discussion). La bibliothèque a été transformé dans la levure, puis sélectionné, en présence de 5-FOA (figure 5B) et les clones positifs ont été isolés et re-ensemencées sur des plaques de gélose dans un format de plaque à 96 puits. Chaque colonie a été transféré en plaque de 96 puits, incuber O / N, et dilué dans une nouvelle plaque de 96 puits comme décrit dans la section 2.2. Il est prévu que la croissance des cellules en milieu SD-URAsera en corrélation avec le degré d'expression Ura3, qui est le résultat de la puissance de la degron pour induire la dégradation. Cela a été confirmé par la suite par l'application Gils (figure 5C). Nous avons confirmé que toutes les colonies pris au hasard, qui ont été pré-sélectionnée avec 5-FOA ont montré des valeurs similaires MDT, sur support SD-LEU (figure 5C, barres vides). En revanche, tous les clones ont montré des taux de croissance variables sur SD-URA, qui étaient significativement plus lent que les cellules exprimant contrôle Ura3-GFP (données non présentées). Comme indiqué, il existe une relation inverse entre le taux de croissance sur SD-URA et MDT. Ainsi, plus le PCT, le plus puissant est le degron. En effet, tous les EMD dérivés de clones sélectionnés positivement étaient plus élevées que celle du témoin (au-dessus de la ligne rouge) (Figure 5C, barres pleines).
<strong> Tableau 1. Illustration du calcul des unités levure MDT. Temps sont heures (h). Blank et l'échantillon sont de 600 OD lit. Transformation (Trans.) est la valeur OD 600 après soustraction blanc et correction de longueur de chemin. Connexion 2 est calculée à partir des données transformées. La pente est le 2 Log (OD 600) Les valeurs au sein consécutive d'intervalles de 10 points de temps divisé par le temps. 1 / pente est le temps nécessaire pour la population de cellules à se reproduire. rectangle noir marque le MDT valeur. rectangle rouge marque l'intervalle de temps à partir de laquelle le PCT a été calculé.
| Levure | Génotype | Source |
| TRy467 | α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ; 0 | EUROSCARF |
| TRy508 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: SA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-DEG1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2 | Cette étude |
| TRy528 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: SA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-DEG1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Cette étude |
| TRy530 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: SA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-DEG1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Cette étude |
| TRy532 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: SA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-DEG1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Cette étude |
| TRy556 | α, his3-Δ200 :: :: pRS303 SA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-DEG1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7Δ :: LEU2 | Cette étude |
| TRy563 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: SA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-DEG1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2, ubc6Δ :: KanMX | Cette étude |
| TRy633 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: SA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-DEG1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Cette étude |
| TRy786 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: SA, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-DEG1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 :: LEU, doa10Δ :: HIS3 | Cette étude |
Tableau 2. Liste des souches de levure utilisées dans cette étude.
| Les plasmides utilisés dans cette étude | ||
| Plasmide | Marqueurs pertinents | Source |
| pTR717 | YDpK-MET25p-DEG1-Flag-Vma12-Ura3 (intégration plasmide contenant LYS1) | Cette étude |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (UFE) | Cette étude |
| D'autres plasmides rapporteurs appropriés | ||
| Plasmide | Marqueurs pertinents | Source |
| pOC9-CL1 | pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) | (17) |
| URA3-2 (GFP) | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | Lewis et Pelham |
Tableau 3. Liste des plasmides utilisés dans cette étude de référence:.. Lewis, MJ et Pelham, RH inefficace contrôle de la qualité des protéines thermosensibles sur la membrane plasmique PLoS One 4, e5038, doi: 10.1371 / journal.pone.0005038 (2009).
Figure 1. Principes de calcul de la PCT. Des cellules de levure Try467 à DO600 de 0,22, ont été incubées dans un milieu complet SD pour la période de temps indiquée. OD 600 mesures ont été prises chaque ~ 15 min et les données ont été recueillies dans une feuille de calcul. (A) transformées OD 600 valeurs du tableau 1 en fonction du temps. (B)Connectez-2 de 600 OD en fonction du temps Ligne rouge:. Marque l'intervalle de temps à partir de laquelle le PCT a été calculée (D). Taux de croissance (C) de levure (pente) a été calculé en mesurant les variations de DO 600 de 10 points consécutifs de temps (en supposant la linéarité) plus de temps Heure de début:. Le temps de calcul qui a été lancé. (D) Le temps nécessaire pour la levure de doubler est l'inverse de la pente de (C) (1 / pente) MDT. Le temps de doublement minimum calculé (en heures).
Figure 2. MDTcalc écran de démarrage: section 5.1 Protocole. Valeurs d'entrée typiques pour être entrés sont affichés.
Figure 4. Mesurer le taux relatif de dégradation de DEG1 -vU dans Ubc7 souches mutantes. A gauche: Terrain des transformées OD 600 valeurs, mesurée lors de la réplication de type ILD w, ubc7 Δ et les mutants Ubc7 indiquées, en fonction du temps. Les cellules exprimant DEG1 -vU ont été cultivées sur milieu SD-URA et DO600 a été mesurée chaque ~ 15 min. A droite: Le MDT pour chaque souche a été calculée à l'aide MDTcalc.
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Figure 5. Une analyse à haut débit pour l'identification et l'isolement de nouveaux degrons. (A) Représentation schématique des caractéristiques de la reporter Ura3-GFP-ADNc. (B) Un organigramme décrivant les étapes expérimentales pour l'isolement des souches de levure portant un degron. La banque de plasmides décrits dans A a été transformé dans des cellules Try467, suivie d'une sélection sur des plaques de SD-Leu. Les colonies ont été reproduites sur des plaques SD-Leu contenant du 5-FOA et les colonies à croissance rapide ont été collectées et organisées sur des plaques dans un ensemble ordonné. (C) Les colonies exprimant Ura3-GFP-ADNc qui a grandi sur des plaques contenant du 5-FOA ont été incubés dans les deux médias pendant 20 heures SD ou SD-LEU-URA. DO600 a été mesurée tous les ~ 15 min et le temps minimal de levure de doublement (PCT) a été calculé en utilisant le logiciel MDTcalc n degron:. Un plasmide exprimant la GFP-Ura3 sans degron, sert de témoin positif pour growth ligne rouge:. seuil déterminé par la valeur de la commande MDT.
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Discussion
Nous décrivons ici un essai basé sur la croissance des cellules pour déterminer le taux relatif de dégradation des protéines, appelée «cinétique de croissance en culture liquide dans des conditions sélectives de (Gils). Le test Gils a plusieurs avantages: Il est simple à mettre en place, l'acquisition et l'analyse des données est simple et il est extrêmement modulaire. Par conséquent, Gils peut être appliquée simultanément à plusieurs échantillons dans un format de plaque conviviale multi-puits qui peut être adapté à l'automatisation pour les applications à haut débit. Plus important encore, Gils fournit des données hautement reproductibles, quantitatives et robustes et est plus souple que l'agar-plaque tests de croissance qui sélectionnent sur la base d'une croissance positive / négative. En outre, Gils est très sensible en ce qu'elle permet de détecter de petites variations dans les taux de dégradation des protéines ou l'état d'équilibre, ce qui reflète l'activité des composants de l'onduleur pertinentes ou degrons. Enfin, les essais Gils nécessitent des périodes de croissance nettement plus courts (<12 h) par rapport à growth tests sur gélose (généralement 2-4 jours).
Bien que le dosage Gils est très utile pour étudier la dégradation des protéines, plusieurs considérations importantes doivent être prises en compte. Par exemple, il est essentiel d'utiliser un isogéniques souche de levure fond en raison des caractéristiques de croissance spécifiques à la souche. En outre, de vérifier validité de l'essai, chaque test doit être répété au moins trois fois dans des conditions identiques, le plus important, la densité initiale de la cellule (OD 600), la température de croissance, et de la culture de cellules intensité du tremblement doivent pas être modifiées. Il est donc recommandé que le protocole de dosage spécifique est stocké dans le logiciel du lecteur de microplaques pour des utilisations répétées. Une variable supplémentaire qui doit être considéré est l'endroit où la degron est positionné dans Ura3. Comme la position de degron peut déterminer sa fonction, le positionnement au niveau des régions, soit le C 'N ou' doit être testée empiriquement.
Calibration de journaliste protniveau d'expression ein est également essentiel pour une bonne application de Gils. Un journaliste optimal est celui qui est efficacement dégradée par le système étudié et confère ainsi uracile auxotrophic. Cependant, les variations de auxotrophic devraient également refléter fidèlement la stabilité de journaliste. Ceci peut être déterminé empiriquement par des essais préalables de la corrélation entre les taux de protéine rapporteur de la dégradation, déterminée par des méthodes biochimiques supplémentaires, et les valeurs, déterminées par la PCT SLIG (figure 3B). Un problème commun se pose lorsque l'expression à l'état stable de base d'un journaliste ne parvient pas à un niveau de seuil et est donc trop faible pour permettre une croissance sur SD-URA même quand il est complètement stabilisé. Un tel problème peut être surmonté en plaçant l'expression de rapporteur sous le contrôle d'un promoteur inductible qui augmente l'expression des protéines de base sans affecter la dégradation. L'activité du promoteur dans de tels systèmes doit être finement calibrée pour éviter une croissance permanente sur SD-URA en raison de high taux de protéines et l'activité enzymatique de journaliste, même quand il est partiellement dégradé. Les promoteurs et les conditions d'expression décrits dans cette étude ont été choisis parce qu'ils permettent une régulation sensible de l'expression des protéines: MET25p et CUP1 p sont des promoteurs induite métabolites-dont l'activité peut être finement ajustée par le contrôle de la méthionine et de cuivre, respectivement (tableau 3).
Qualité des substrats rapporteurs de contrôle (que ceux décrits dans cette étude) peuvent former des agrégats intracellulaires qui pourraient piéger Ura3 et prévenir sa fonction. Dans un tel cas auxotrophie d'uracile peut être interprété à tort comme le résultat de la dégradation des protéines. Pour tester la tendance des différents degrons d'agréger, un journaliste supplémentaire devrait être utilisé. Par exemple, le rapporteur GFP-Ura3 conçu pour l'écran de degron (figure 5A), permet la visualisation des agrégats intracellulaires en microscopie à fluorescence de cellules en croissance dans le presence de 5-FOA. Ces agrégats apparaissent comme dense GFP foyers qui se distinguent clairement de l'aspect diffus de la protéine soluble (données non présentées). Le reporter Ura3-GFP-degron peut être utilisé de manière similaire pour déterminer l'effet de la protéine sur degron co-localisation et la distribution sous-cellulaire. Il peut également être utilisé pour la suite de la dégradation de substrats choisis par cytométrie de flux, comme un écran secondaire 25.
Un avantage majeur de la méthode SLIG est qu'il est suffisamment souple et peut donc facilement être adapté à une variété d'applications, en plus de ceux décrits dans le présent mémoire. Par exemple, le procédé peut également être utilisé pour l'examen de l'aptitude du protéasome dans diverses conditions. Dans ce cas, un substrat non-ubiquitylé protéasome tel que l'ornithine décarboxylase (ODC) est fusionnée à Ura3. Le procédé peut également tester la dégradation des protéines intracellulaires dans des compartiments distincts, si un signal de localisation spécifique qui est employé.Dans cette étude Vma12 ancré au journaliste de l'ER-membrane (figures 3, 4). De même, un signal de localisation nucléaire (NLS), un signal de rétention ER (KDEL) ou cytosol (absence d'un signal spécifique) peut être utilisée. Un système permettant l'analyse simultanée de la dégradation des protéines dans différents compartiments intracellulaires pourrait avoir un impact profond sur notre compréhension de la façon dont les réseaux de dégradation des protéines fonctionnent. Enfin, les principes de la méthode de sélection peut être appliqué pour la recherche de la dégradation des protéines dans d'autres systèmes à base de cellules modèles, des bactéries aux cellules humaines, qui exigent tous le produit du gène URA3 pour la survie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A.
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
