Summary
Små intestinale krypt organoids dyrket ex vivo tilvejebringe en vævskultur, der sammenfatter vækst af krypter afhængige af stamceller og deres niche. Vi har etableret en metode til at analysere den metaboliske profil i realtid i primær mus krypt organoids. Vi fandt organoids opretholde fysiologiske egenskaber, der er defineret ved deres kilde.
Abstract
Tyndtarmens slimhinde udviser et repetitivt arkitektur organiseret i to grundlæggende strukturer: villi, som rager ind i det intestinale lumen og sammensat af modne enterocytter, bægerceller og enteroendocrine celler; og krypter, bosiddende proximalt til submucosa og muscularis, der huser voksne stamceller og progenitorceller og modne Paneth celler, samt stromale celler og immunceller i krypten mikromiljø. Indtil de sidste par år, blev in vitro studier af tyndtarmen begrænset til cellelinier afledt fra enten godartede eller ondartede svulster, og ikke repræsenterer fysiologi af normale tarm epitel og indflydelse mikromiljø, hvor de bor. Her viser vi en fremgangsmåde tilpasset fra Sato et al. (2009) til dyrkning af primære muse intestinale krypt organoids afledt fra C57BL / 6-mus. Derudover præsenterer vi brugen af krypt organoide kulturer at analysere krypten metaboliske profil i realtid ved foranstaltningenling af basal iltforbrug, glycolytisk sats, ATP-produktion og respiratorisk kapacitet. Organoids vedligeholde ejendomme defineret ved deres kilde og fastholde aspekter af deres metaboliske tilpasning afspejles af ilt forbrug og ekstracellulære forsuring satser. Realtid metaboliske studier i denne krypt organoide kultur-system er et kraftfuldt værktøj til at studere krypt organoide stofskifte energi, og hvordan den kan moduleres ved ernæringsmæssige og farmakologiske faktorer.
Introduction
Colorectal cancer (CRC) er den tredje hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald i USA. Sporadisk tyktarmskræft - nemlig at der opstår senere i livet (> 50 år), og uden klare disponerende genetiske faktorer - tegner sig for ca. 80% af alle tilfælde, med forekomsten stærkt påvirket af langsigtede kostvaner 1,2. Disse tumorer udviser en metabolisk skift i retning af afhængighed af oxidativ glycolysen, kendt som Warburg virkning, hvilket delvist kan gøre højere koncentrationer af cellulære byggesten og energi til rådighed (gennem glutaminolysis) for at tillade og måske køre høje tumorcelleproliferation 3-5 . Undersøgelser af tyktarmskræft samt andre gastrointestinale cancerformer, herunder tyndtarmen kræft giver vigtig indsigt i årsagen til tumor formation. Undersøge metaboliske forskelle mellem normale, pro-tumorigene og tumorigene tilstande af gastrointestinale organsystemer kan bistå itermination af relativ risiko for tumor udvikling samt tidlig påvisning af neoplasi. Desuden vil forstå bioenergetic metabolisme involverer mitokondrie respiration og glykolyse give grundlæggende indsigt i, hvordan celle fysiologi, aldring og sygdom tilstand forstyrrer tarm homøostase. Udnyttelse af bioenergetik assay teknologi til ekstracellulær flux analyse kan vurdere satserne for mitokondrie respiration og glykolyse samtidigt i celler, der vokser i kultur i realtid 6,7.
Indtil for nylig var in vitro studier af tyndtarmen begrænset til cellelinier afledt fra enten godartede eller ondartede svulster 8,9 og ikke repræsenterer fysiologi af normale tarm epitel og indflydelse mikromiljø, hvor de bor. I 2009 Sato et al. 10 indført en ex vivo kultur system til at vokse tre-dimensionelle (3D) mus tarmepitelceller organoids eller epithelial "mini-indvolde", der er egnede til forsøg, diagnostiske og terapeutiske undersøgelser 10,11. Desuden krypter isoleret fra calorically begrænset mus opretholde deres ændrede vækstegenskaber som organoids i sådanne kulturer 12. Sammenlignet med transformerede cellelinier kan krypt organoide kulturer anvendes til at frembringe fysiologisk relevante data, der udgør en langt bedre model for at forstå in vivo tilstand.
Vi har tilpasset bioenergetik analyse teknologi til analyse energiomsætning af intestinale krypt organoids. Mus tarm krypt organoids blev dyrket ex vivo til at udvikle de krypt organoide energi metabolismeundersøgelser præsenteret. Oxygenforbrugshastigheden (OCR) og den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) af krypt organoids blev målt i fravær og nærvær af to forskellige metaboliske inhibitorer (oligomycin, rotenon) og en ion bærer (carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Krypten organoid metaboliske reaktion på disse kemiske forbindelser lykkedes afspejlet gennem skiftende ECAR og OCR-værdier.
Cellular bioenergetic studier vil belyse de gensidige interaktioner mellem metabolisk tilstand og risiko for sygdom og fænotype i kræft, fedme, diabetes, stofskiftesygdomme og mitokondriesygdomme og hjælpe forskud screeningsmetoder med direkte følger for translationel medicin. Her beskriver vi en detaljeret protokol til at isolere tyndtarmens krypter og kultur krypt organoids. Derudover introducerer vi en ny metode til at bruge krypt organoide kulturer for metaboliske assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen til pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget om den etiske dyreforsøg af Albert Einstein College of Medicine.
1. Crypt Isolering og Kultur
- Isolering af Cryptocoryner fra tyndtarmen:
- Isoler tarm krypter fra enhver mus model af interesse. Aflive mus med CO 2 efterfulgt af cervikal dislokation.
- Åbne maven langs og fylde tyndtarmen (SI) med iskold phosphatbufret saltvand, PBS (-CA 2+; -Mg 2+) med 2x antibiotikum-antimykotikum (anti-anti). Hurtigt isolere tyndtarmen.
- Grundigt dissekere fri for mesenteriske fedt ved hjælp af en skalpel. Pas på ikke at perforere vævet - på alle tidspunkter at holde væv fugtig med iskold PBS. Åbne op intestine langs og vask grundigt med iskold PBS.
- Skær tyndtarmen i to dele, og flade ud med en våd vatpind, forsigtigt skrabe villi ved hjælp af en pre-afkølet dias. Vask kraftigt i iskoldt PBS flere gange.
- Inkuber 3 min i 20 ml 1x PBS pr 3 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 0,5 mM dithiothreitol (DTT) for ikke-enzymatisk dissociation af vævet.
- Skæres væv i små stykker (2-4 mm) under anvendelse af et barberblad på en forafkølet slide. Overføre stykkerne i et 50 ml-rør indeholdende 20 ml iskold PBS.
- Pipette op og ned forsigtigt 10x ved hjælp af en 10 ml steril engangs pipette. Lad vævsfragmenter sedimenterer ved hjælp af tyngdekraften. Fjern supernatanten med en pipette. Gentag yderligere tre gange; Sørg supernatant er klar.
- Der tilsættes 20 ml PBS per 2 mM EDTA. Swirl og inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter under forsigtig vipning.
- Lad væv sediment og kassér supernatanten. Der tilsættes 15 ml iskold PBS og pipetteop og ned 5x med en 10 ml pipette. Lad vævsfragmenterne sediment og indsamle supernatanten som Fraktion 1 (F1). Gentag indsamling F2-F5, hver fraktion opretholdes separat.
- Der tilsættes 15 ml iskold PBS og denne gang omrystes kraftigt med hånden for 15 sek. Saml F6 og gentag for F7, F8. Hvis vævsstykkerne begynder at flyde, skal du trykke for at hjælpe dem bosætte.
- Inspicere en portion af hver fraktion under mikroskopet. Pool disse fraktioner indeholdende krypter.
- Passere sammenblandede fraktioner gennem en 70 um nylon cellefilter, indsamling krypter i et 50 ml rør.
- Centrifuger ved 100 xg i 5 min ved 4 ° C, supernatanten og resuspender pellet i 10 ml iskold PBS med 2x anti-anti og overføre krypter til et 15 ml rør. Gentag vask en gang mere.
- Vask krypter gang med 10 ml iskold ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco "s Modified Eagle Medium / Ham" s F-12) - 2x anti-anti.
- Vask krypter gang med 10 ml ADF - 1x anti-anti.
- Tæl krypter hjælp af et hæmocytometer. Justere opløsningens rumfang krypten og overføres til et 1,5 ml rør, således at den endelige koncentration krypt når resuspenderet vil være 100-500 krypter pr 50 pi gelatinøse proteinblanding (Matrigel). Centrifugeres ved 100 xg i 5 min ved 4 ° C og resuspender krypter i den gelatinøse proteinblanding.
- Plade 50 pi krypt - gelatinøse proteinblanding suspension per brønd i en 24-brønds plade (vækstområde: 2 cm 2), omhyggeligt at placere suspension dråbe i midten af hver brønd. Fastholde pladen i en CO 2, 37 ° C inkubator i ~ 30 min, indtil suspensionen størkner.
- Tilføj 500 pi iskold komplet dyrkningsmedium (Advanced DMEM / F12 med 1x anti - anti, 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 Supplement, 1x N2 Supplement, 1 mM N-acetyl-L-cystein (NAC), 50 ng / ml epidermal vækstfaktor (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R-Spondin).
- Rekonstituere vækstfaktorer i 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS.
- Crypt organoide Kultur og Passage:
- Passage krypt organoids 14-21 dage efter podning (eller efter behov) som følger:
- Skift medier hver fredag og mandag. Om onsdagen, udskifte halvdelen af medier med friske medier.
- Fjerne dyrkningsmediet. Vask prøven to gange med 500 pi PBS ved 5 minutters intervaller.
- Fjern PBS og forsigtigt bryde op gelatinøse protein ved anvendelse af en steril P1000 micro pipettespids.
- Tilsæt 1 ml komplet dyrkningsmedium til en enkelt brønd, og resuspender organoids i 1 ml medier.
- Forstyrre forsigtigt organoids bruger P1000 ved pipettering op og ned 20-30x (tjek under mikroskop for korrekt organoide dissociation med en god krypt udbytte indtil en ensartet teknik er udviklet).
- Overfør krypter til et 1,5 ml mikrocentrifugerør;centrifugeres ved 100 xg ved 4 ° C, 5 min.
- Vask pellet to gange med 1 ml komplet dyrkningsmedium.
- Split i et forhold på 1: 3 eller 1: 6 som er nødvendige, resuspenderes krypter i 50 pi Matrigel per brønd. Fortsæt som beskrevet ovenfor (afsnit 1.1.16-18).
- Passage krypt organoids 14-21 dage efter podning (eller efter behov) som følger:
- Crypt organoide Nedfrysning:
- Fjerne dyrkningsmediet. Vask prøven i 500 pi PBS.
- Dispergere gelatinøse protein ved anvendelse af en P1000 pipettespids.
- Tilsæt 1 ml medier til en enkelt brønd, og resuspender organoids i 1 ml medier.
- Forsigtigt opbryde organoids bruger P1000 ved pipettering op og ned 20-30x.
- Overfør organoids til et 1,5 ml rør. Centrifugeres ved 100 xg ved 4 ° C, 5 min.
- Vask pellet to gange med 1 ml komplet dyrkningsmedium.
- Resuspender krypter i 500 pi indefrysning medier.
- Overfør krypter til en kryorør placere røret i en indefrysning beholder og opbevares i en -80 ° C fryser overniGHT.
- Overfør krypter til flydende N2 tank.
- Recover frosne krypt organoids ved hurtigt optøning i et 37 ° C vandbad. Vask med 500 ul komplet dyrkningsmedier gang, centrifugeres ved 100 xg 5 min og resuspender i gelatinøse proteinblandingen og kultur som beskrevet ovenfor. For bedre opsving, tilføje ROCK inhibitor (Y-27632) til frysning medier.
2. Crypt organoide Metabolisme Assay
- 24-brønds plade Fremstilling:
- Isoler og tælle krypter i overensstemmelse med protokollen (se afsnit 1.1 for krypt isolation og afsnit 1.2 for krypt passage).
- Resuspender krypter i gelatinøse proteinblanding (100-200 krypter pr 20 pi).
- Plate krypt-gelatinøse proteinblanding suspension i en 24-brønds assayplade (sørg for at der er mindst tre eksemplarer for hver prøve), og lad suspensionen at størkne ved 37 ° C i et CO 2rugemaskine tilsæt derefter 500 pi komplet kultur medier.
- Kultur krypter (som beskrevet i afsnit 1.1), og observere under mikroskop indtil krypter vokse til fuldt udviklede organoids.
- Ekstracellulær Flux assay:
- Hydrat patron natten over i et ikke-CO 2 (0% CO 2), 37 ° C inkubator.
- Fjern kulturmediet, og vask organoids to gange med 500 pi DMEM (uden glucose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumhydrogencarbonat og med: phenolrødt). Vent 5 min.
- Tilføj 675 pi per brønd assay-medium (DMEM med 2 mM L-glutamin og 5 mM D-glucose) til hver brønd.
- Tjek krypt organoids mikroskopisk morfologi at sikre, at organoids og gelatinøse protein blanding er intakt efter vaskene. Inkuber i 1 time i en ikke-CO 2, 37 ° C inkubator.
- Forbered 10 uM injicerbare forbindelser (oligomycin, carbonyl cyanid-p-trifluor-methoxy-phenyl-hydrazon (FCCP), rotenone) i assaymedium.
- Opsætning patronen ved at indlæse 75 pi 10 uM injicerbare forbindelser i havnene i patronen sekventielt: Port A - oligomycin; Port B - FCCP; og Port C - Rotenon (Slutkoncentrationerne løbet af analysen vil være 1 uM).
- Inkuber patron 30 minutter - 1 time ved 37 ° C i en ikke-CO 2-inkubator.
- Samtidig tænde XF Analyzer og skabe assayprotokollen skabelon.
- Placere patronen og nytte plade i XF Analyzer og køre "kalibrerings" patron.
- Tjek krypt organoids mikroskopisk for at sikre de er knyttet til den gelatinøse protein blanding.
- Belastning celledyrkningsplade i instrumentet og køre assayprotokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Crypt organoids blev etableret fra 8 måned gamle C57BL / 6 mus fodret renset gnaverkost American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Tarm krypt organoids kan dyrkes i kultur i længere perioder fra en enkelt krypt (figur 1A, enkelt rød pil). Organoids vokse ud krypt-lignende strukturer i 18-20 dage i kultur (figur 1B, røde pile). Cryptocoryner blev passeret hver 3. uge og organoids effektivt nyttiggøres efter hver passage.
Seahorse bioenergetik instrumentering kan vurdere satserne for mitokondrie respiration og glykolyse samtidigt i celler, der vokser i kultur i realtid. Vi har tilpasset denne teknologi til at analysere crypt organoide metabolisme. Med organoids afledt fra mus fodret AIN76A renset kost i 8 måneder, målte vi:. 1 oxygenforbrugshastighed, OCR vist i figur 2A - rød linje, der repræsenterer oxygenforbrugshastighed (pmol / min) i krypt organoids, blå er the kontrolbrønde kun med Matrigel (den gelatinøse protein blanding); 2. ekstracellulær forsuring rate (ECAR) vist i figur 2B - rød linje, der repræsenterer ekstracellulær forsuring rate (mph / min) i krypt organoids, blå er kontrolbrøndene kun med gelatinøse protein blanding.
Figur 1:. Krypt organoids afledt fra 8-måneder gamle C57BL / 6-mus krypter er (a) 2-dage eller (B) 18 dage i kultur. Scale: 100 um.
Figur 2: Bioenergetik assay under anvendelse organoids afledt fra 8-måneder gamle C57BL / 6-mus. (A) Oxygenforbrug sats (OCR) er vist;
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi testede oxygenforbrugshastigheden (OCR) og den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) af krypter isoleret fra 8-måneder gamle mus og dyrkes i organoids ex vivo. Efter måling af basal rate blev crypt metabolisme evalueret ved tilsætning oligomycin, carbonyl cyanid -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) og rotenon sekventielt.
Basal OCR og basal ECAR blev registreret 0-29 min (figur 2A og 2B). På 29. min blev oligomycin (fra port A) injiceret i hver brønd (n = 3, for både krypter og kontrolbrønde). Oligomycin er en ATP-syntese inhibitor. Det bruges til at forhindre tilstand 3 (phosphorylerende) respiration. Således oligomycin injektion resulterede i en mindre reduktion i OCR, på grund af blokade af ATP-syntese i mitokondrier, og krypter skiftede til glykolysen til at opfylde deres krav til ATP medfører en stigning i ECAR. Ved 64 th min, FCCP (from port B) blev injiceret i hver brønd. FCCP er en mobil ion bærer, transport hydrogenioner over den mitokondriske membran, hvilket fører til hurtig energiforbrug uden behov for ATP generation. OCR øget på grund af frakobling og ECAR steget siden krypter opretholdt deres energibalance ved at ansætte glykolyse at generere ATP, således at syntetisere og udskille mælkesyre. Ved 99 th min blev rotenon (fra port C) injiceret i hver brønd. Rotenon er en mitochondrial inhibitor. Således tredje injektion ført til et fald i OCR grundet nedsat mitokondriefunktionen og flyttet krypter til en mere glykolytisk tilstand holde ECAR værdier forhøjet.
Der er to hovedkonklusioner: 1) krypt organoids fra 8 måned gamle mus blev dyrket med succes gennem flere passager; 2) organoids, der var blevet passeret i kultur i 2 måneder efter afledning udviste en metabolisk respons på oligomycin, carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphen ylhydrazone og rotenon. Således glycolytisk evne organoids var stabil efter 2 måneder i kultur, i overensstemmelse med den rapport, organoids fra calorically begrænsede mus relativt permanent tilpasset forskellig vækst og metaboliske fænotyper i kultur 12.
De eksperimentelle procedurer, der er beskrevet i denne protokol vil være af stor betydning i metaboliske undersøgelser af tarm krypter. Protokollen for krypt isolation er tilpasset fra Sato et al. 10. Protokollen for at studere krypt stofskifte i tyndtarmsepitelceller krypt organoide kulturer under anvendelse bioenergetik analyse teknologi er ikke blevet rapporteret. Krypten organoide metabolismestudier kan udvides yderligere indføre forskellige variabler til dyrkningsmedier og assaybetingelser, såsom forskellige energikilder, inhibitorer og aktivatorer af signalering og metaboliske veje, og hypoxiske betingelser, der kan modulere metaboliske veje.
Indholdsproduktion "> Der er tekniske spørgsmål, der kræver særlig opmærksomhed, når de anvender disse protokoller. Crypt nummer og væksten effektivitet krypt organoide kulturer kan variere afhængigt af krypten kilde, fx krypter fra genetisk ændret vs. vildtypemus. Således krypt podningstæthed kan justeres til forsøg ved at køre en retssag. Hertil kommer, krypter og organids har en stærk tendens til at klæbe til overflader. For et bedre udbytte, alle rør (1,5 ml, 15 ml og 50 ml rør), kan pipetter og pipettespidser være overtrukket med 1% føtalt bovint serum i phosphatbufret saltvand ved 4 ° C natten over. Resultaterne kan normaliseret til total proteinkoncentration ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA) assay. Efter metabolisk assay, 24-brønds plade holdes på is, indtil BCA assay. For BCA assay krypter vaskes forsigtigt i 500 pi kold PBS tre gange og lyseret i 75 pi 0,1 N NaOH i PBS efterfulgt af kraftig omrystning i 1 time ved stuetemperatur. En P1000 pipette kananvendes til at bryde den gelatinøse proteinblandingen og pipettering op-ned fremmer lysis. Efter krypt lysis, kan standard BCA assay-protokol for celler følges. Det er vigtigt at have "kun Matrigel" kontrolbrønde hele bioenergetik analyse til måling baggrunden proteinkoncentrationen i disse brønde og dermed at vurdere koncentrationen crypt protein nøjagtigt af BCA assay.Crypt organoide metabolismestudier præsenteres kan anvendes til normale og patientens afledt epitelial mini-modet til at udforske nytte for tidlig evaluering af den relative risiko for sygdom og tilgange, der kan modulere metaboliske fænotype og dermed nedsætte risikoen. De metaboliske assays er beskrevet her introducere nye strategier for eventuel evaluering af den relative risiko for udvikling af sygdom og for tidlig påvisning af sygdom tilstand, dets biokemiske og molekylær dissektion og potentielle modulation. Sammenfattende beskriver vi en detaljeret protokol til at isolere lille intestinal krypter og kultur krypt organoids. Derudover introducerer vi en ny metode til at bruge krypten organoide kultur til bestemmelse af ekstracellulære forsuring og ilt forbrug satser for at studere krypten organoide energistofskifte. Ex vivo krypten organoide kultur stofskifteprofil undersøgelser vil definere nye strategier for at forstå tarm biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen oplysninger.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 og P3013330 fra National Institutes of Health.
Vi vil gerne takke Michele Houston, Elena Dhima og Dr. Anna Velcich for deres værdifulde kommentarer i udviklingen krypten isolation protokollen.
Vi takker også Diabetes Uddannelse og Research Center for Albert Einstein College of Medicine støttet af NIH P60DK20541, og Dr. Michael Brownlee og Dr. Xue-Liang Du, der leder og driver Seahorse facilitet hhv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1x) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml | Life Technologies | 15240-062 | Final concentration 1x or 2x |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final concentration 1x |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final concentration 1x |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final concentration 10 mM |
| N-acetyl-L-cysteine, 25 g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final concentration 1 mM |
| 100x N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final concentration 1x |
| 50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final concentration 1x |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final concentration 500 ng/ml |
| Recombinant Murine EGF, 100 μg | Peprotech | 315-09 | Final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant Murine Noggin, 20 μg | Peprotech | 250-38 | Final concentration 100 ng/ml |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final concentration 2 mM |
| Gibco® glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT (dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1% in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1% in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final concentration 10 μM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final concentration 1 μM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final concentration 1 μM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final concentration 1 μM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
References
- Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O.
- Coles, N. W., Johnstone, R. M. Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells. Biochem J. 83, 284-291 (1962).
- Medina, M. A., Castro I, N. unezde Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells. Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).
- Anso, E., et al. Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC. Cancer Metab. 1, 7 (2013).
- Malmgren, S., et al. Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity. J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).
- Whitehead, R. H., et al. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
- Roig, A. I., et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).
- Sato, T., et al. Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
