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Biology

में मेटाबोलिक प्रोफ़ाइल के वास्तविक समय विश्लेषण Published: November 3, 2014 doi: 10.3791/52026
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine

Summary

लघु आंत्र तहखाना organoids स्टेम कोशिकाओं और उनके आला पर निर्भर तहखाने के विकास का स्मरण दिलाता है कि एक टिशू कल्चर प्रणाली प्रदान पूर्व vivo सुसंस्कृत. हम प्राथमिक माउस तहखाना organoids में वास्तविक समय में चयापचय प्रोफाइल परख करने के लिए एक विधि की स्थापना की. हम organoids उनके स्रोत से परिभाषित शारीरिक गुणों को बनाए रखने पाया.

Abstract

छोटे आंत्र म्यूकोसा दो बुनियादी संरचनाओं में आयोजित एक दोहराव वास्तुकला दर्शाती है: विल्ली, आंतों की लुमेन में पेश और परिपक्व enterocytes, जाम कोशिकाओं और enteroendocrine कोशिकाओं से बना; और submucosa और पेशीय, शरण वयस्क स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और परिपक्व Paneth कोशिकाओं को समीपस्थ, साथ ही स्ट्रोमल और तहखाना microenvironment की प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहने वाले तहखाने,. पिछले कुछ वर्षों तक, छोटी आंत की इन विट्रो अध्ययन में सौम्य या घातक या तो ट्यूमर से व्युत्पन्न सेल लाइनों तक ही सीमित था, और सामान्य आंत्र epithelia के शरीर विज्ञान और वे रहते हैं, जिसमें microenvironment के प्रभाव का प्रतिनिधित्व नहीं था. यहाँ, हम सातो एट अल से अनुकूलित एक विधि. (2009) C57BL / 6 चूहों से ली गई प्राथमिक माउस आंतों तहखाना organoids संवर्धन के लिए प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, हम उपाय से वास्तविक समय में तहखाना चयापचय प्रोफाइल परख करने तहखाना organoid संस्कृतियों का उपयोग पेशबेसल ऑक्सीजन की खपत, ग्लाइकोलाइटिक दर, एटीपी उत्पादन और सांस की क्षमता के बयान. Organoids उनके स्रोत से परिभाषित गुणों को बनाए रखने और ऑक्सीजन की खपत और बाह्य अम्लीकरण दरों से परिलक्षित उनके चयापचय अनुकूलन के पहलुओं को बरकरार रहती है. इस तहखाना organoid संस्कृति प्रणाली में वास्तविक समय चयापचय पढ़ाई तहखाना organoid ऊर्जा चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं, और कैसे यह पोषण और औषधीय कारकों द्वारा संग्राहक जा सकता है.

Introduction

कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) संयुक्त राज्य अमेरिका में कैंसर से संबंधित मौतों का तीसरा प्रमुख कारण है. छिटपुट पेट के कैंसर - यानी कि जीवन में बाद में उत्पन्न होने वाले (> उम्र के 50 वर्ष) और कोई स्पष्ट predisposing आनुवंशिक कारकों के साथ - के लिए खातों ~ दृढ़ता से लंबी अवधि के आहार पैटर्न 1,2 से प्रभावित घटना के साथ सभी मामलों का 80%,. ये ट्यूमर ट्यूमर सेल प्रसार 3-5 की उच्च दर की अनुमति और शायद ड्राइव करने के लिए भाग में (glutaminolysis के माध्यम से) उपलब्ध सेलुलर ब्लॉकों का निर्माण और ऊर्जा की उच्च सांद्रता कर सकते हैं जो वारबर्ग प्रभाव के रूप में जाना जाता ऑक्सीडेटिव ग्लाइकोलाइसिस पर निर्भरता की दिशा में एक चयापचय पारी, प्रदर्शन . छोटी आंत के कैंसर सहित पेट के कैंसर के अध्ययन के साथ-साथ अन्य गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर ट्यूमर गठन के कारण में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं. डेट सहायता कर सकते हैं जठरांत्र अंग प्रणालियों के सामान्य समर्थक tumorigenic और tumorigenic राज्यों के बीच चयापचय मतभेद जांचट्यूमर के विकास के लिए रिश्तेदार जोखिम के साथ-साथ रसौली का जल्दी पता लगाने के ermination. इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस शामिल bioenergetic चयापचय को समझने सेल शरीर क्रिया विज्ञान, बुढ़ापे और बीमारी राज्य आंतों समस्थिति perturbs कैसे में मौलिक अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा. बाह्य प्रवाह के विश्लेषण के लिए बायोइनरजेटिक्स परख प्रौद्योगिकी के उपयोग वास्तविक समय 6,7 में संस्कृति में बढ़ कोशिकाओं में एक साथ माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस की दरों का आकलन कर सकते हैं.

अभी हाल तक, छोटी आंत की इन विट्रो अध्ययन सौम्य या घातक या तो ट्यूमर 8,9 से व्युत्पन्न सेल लाइनों तक ही सीमित थे और सामान्य आंत्र epithelia के शरीर विज्ञान और वे रहते हैं, जिसमें microenvironment के प्रभाव का प्रतिनिधित्व नहीं था. 2009 में, सातो एट अल. 10 एक पूर्व vivo संस्कृति तीन आयामी (3 डी) माउस आंतों उपकला organoids विकसित करने के लिए प्रणाली, या epith पेशप्रयोगात्मक नैदानिक ​​और चिकित्सीय जांच 10,11 के लिए उपयुक्त elial "मिनी हिम्मत". इसके अलावा, calorically प्रतिबंधित चूहों से अलग तहखाने ऐसी संस्कृतियों 12 में organoids के रूप में उनके बदल विकास गुणों को बनाए रखने. तब्दील सेल लाइनों की तुलना में, तहखाना organoid संस्कृतियों में विवो राज्य को समझने के लिए एक बहुत ही अच्छा मॉडल पेश physiologically प्रासंगिक डेटा उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

हम आंतों तहखाना organoids की ऊर्जा चयापचय परख करने बायोइनरजेटिक्स विश्लेषण प्रौद्योगिकी अनुकूलित. माउस आंतों तहखाना organoids प्रस्तुत तहखाना organoid ऊर्जा चयापचय के अध्ययन को विकसित करने के लिए पूर्व vivo सुसंस्कृत थे. ऑक्सीजन की खपत की दर (ओसीआर) और तहखाना organoids की बाह्य अम्लीकरण दर (ECAR) अभाव और दो अलग चयापचय अवरोधकों (oligomycin, rotenone) और एक आयन वाहक (कार्बोनिल साइनाइड-P-trifluoromethoxyphenylhydrazone) की उपस्थिति में मापा गया. तहखाना संगठनोंइन रासायनिक यौगिकों को noid चयापचय प्रतिक्रिया सफलतापूर्वक बदल रहा ECAR और ओसीआर मूल्यों के माध्यम से परिलक्षित किया गया.

सेलुलर bioenergetic पढ़ाई कैंसर, मोटापा, मधुमेह, चयापचय संबंधी विकार और mitochondrial रोगों में चयापचय राज्य और रोग के जोखिम और phenotype के बीच पारस्परिक बातचीत को स्पष्ट और translational चिकित्सा के लिए प्रत्यक्ष प्रभाव के साथ अग्रिम स्क्रीनिंग तरीकों में मदद मिलेगी. यहाँ, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल छोटी आंतों तहखाने अलग और संस्कृति तहखाना organoids करने के लिए का वर्णन. इसके अलावा, हम चयापचय assays के लिए तहखाना organoid संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए एक उपन्यास विधि परिचय.

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Protocol

इस अध्ययन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था. प्रोटोकॉल मेडिसिन के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज के पशु प्रयोगों की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.

1. तहखाना अलगाव और संस्कृति

  1. छोटी आंत से तहखाने का अलगाव:
    1. ब्याज की किसी भी चूहों मॉडल से आंतों तहखाने पृथक. ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 के साथ चूहों euthanize.
    2. अनुलंबीय पेट खोलो और बर्फ ठंड फॉस्फेट बफर खारा के साथ छोटी आंत (एसआई) को भरने, पीबीएस (-Ca 2 +; -Mg 2 +) 2x एंटीबायोटिक antimycotic (एंटी-विरोधी) के साथ. तेजी से छोटी आंत अलग.
    3. अच्छी तरह से एक स्केलपेल का उपयोग मेसेंतेरिक वसा से मुक्त काटना. ऊतक छेदना के लिए नहीं सावधान - हर समय बर्फ ठंड पीबीएस के साथ नम ऊतक रखने पर. बौद्धिक अत्याधुनिक खोलोStine अनुलंबीय बर्फ ठंड पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोने और.
    4. एक पूर्व ठंडा स्लाइड का उपयोग विल्ली परिमार्जन धीरे, दो खंडों में छोटी आंत कट और एक गीला कपास टिप का उपयोग कर बाहर समतल. ठंडा पीबीएस में कई बार सख्ती धो लें.
    5. ऊतक के गैर एंजाइमी हदबंदी के लिए 3 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) /0.5 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) प्रति पीबीएस 1x 20 मिलीलीटर में 3 मिनट सेते हैं.
    6. एक पूर्व ठंडा स्लाइड पर एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर छोटे टुकड़ों (2-4 मिमी) में ऊतक में कटौती. 20 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में टुकड़े स्थानांतरण.
    7. पिपेट ऊपर और नीचे धीरे 10x एक 10 मिलीलीटर बाँझ डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग. ऊतक टुकड़े गंभीरता से तलछट करते हैं. एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें. तीन अतिरिक्त बार दोहराएँ; यकीन सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट है.
    8. 2 मिमी EDTA प्रति पीबीएस के 20 मिलीलीटर जोड़ें. भंवर और कोमल कमाल के साथ 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    9. ऊतक तलछट करते हैं और सतह पर तैरनेवाला त्यागें. 15 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस और पिपेट जोड़ेंअप और एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ 5x नीचे. ऊतक टुकड़े तलछट करते हैं और अंश 1 (एफ 1) के रूप में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा. F2-F5 है, अलग से बनाए रखा प्रत्येक अंश एकत्रित दोहराएँ.
    10. 15 सेकंड के लिए हाथ से सख्ती से 15 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस और इस बार हिला जोड़ें. , F8 के लिए F6 लीजिए और F7 के लिए दोहराएँ. ऊतक टुकड़े फ्लोट करने के लिए शुरू करते हैं, तो उन्हें व्यवस्थित करने में मदद करने के लिए टैप करें.
    11. खुर्दबीन के नीचे प्रत्येक अंश की एक विभाज्य का निरीक्षण किया. तहखाने से युक्त उन अंशों पूल.
    12. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में तहखाने का संग्रह, एक 70 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से जमा भिन्न गुजरती हैं.
    13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को 2x विरोधी विरोधी और स्थानांतरण तहखाने से 10 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली त्यागें. धोने एक बार दोहराएँ.
    14. 2x विरोधी विरोधी - 10 मिलीलीटर ठंडा एडीएफ, उन्नत DMEM / एफ-12 (Dulbecco "के संशोधित ईगल मध्यम / हाम" एस एफ-12) के साथ एक बार तहखाने धो लें.
    15. एक बार तहखाने 10 मिलीलीटर एक साथ धोलोमो - विरोधी विरोधी 1x.
    16. एक hemocytometer का उपयोग तहखाने गणना. तहखाना समाधान मात्रा समायोजित करें और resuspended जब अंतिम तहखाना एकाग्रता पतला प्रोटीन मिश्रण (Matrigel) का 50 μl प्रति 100-500 तहखाने हो जाएगा तो एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण. पतला प्रोटीन मिश्रण में 4 डिग्री सेल्सियस और resuspend तहखाने में 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र.
    17. प्लेट तहखाना के 50 μl - 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति पतला प्रोटीन मिश्रण निलंबन (विकास क्षेत्र: 2 सेमी 2), ध्यान से अच्छी तरह से प्रत्येक के केंद्र में निलंबन बूंद रखकर. एक सीओ 2 में निलंबन solidifies ~ 30 मिनट तक के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर थाली बनाए रखें.
    18. 500 μl बर्फ ठंड पूरा संस्कृति मीडिया (उन्नत DMEM / 1x विरोधी के साथ F12 जोड़ें - विरोधी, 10 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 पूरक, 1x एन 2 अनुपूरक, 1 मिमी एन-एसिटाइल-एल सिस्टीन (एनएसी), 50 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक (EGF), 100 / मिलीलीटर एनजीनोगिन, 500 एनजी / एमएल आर-Spondin).
      1. पीबीएस में 0.1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) में वृद्धि कारकों पुनर्गठित.
  2. तहखाना Organoid संस्कृति और पारित:
    1. पारित होने तहखाना organoids 14-21 दिनों के बाद बोने (या जरूरत के रूप में) इस प्रकार है:
      1. बदलें मीडिया हर शुक्रवार और सोमवार. बुधवार को, ताजा मीडिया के साथ आधा मीडिया की जगह.
    2. संस्कृति के माध्यम से निकालें. 5 मिनट के अंतराल पर 500 μl पीबीएस के साथ दो बार नमूना धो लें.
    3. पीबीएस निकालें और धीरे एक बाँझ P1000 सूक्ष्म विंदुक टिप का उपयोग कर पतला प्रोटीन मिश्रण टूट गया.
    4. एक भी अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर पूरी संस्कृति मीडिया जोड़ें और 1 मिलीलीटर मीडिया में organoids resuspend.
    5. धीरे से ऊपर pipetting द्वारा और 20-30x नीचे एक P1000 उपयोग कर organoids बाधित (एक सुसंगत तकनीक जब तक एक अच्छा तहखाना उपज के साथ उचित organoid हदबंदी के लिए खुर्दबीन के नीचे की जांच विकसित की है).
    6. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब तहखाने स्थानांतरण;4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट में 100 XG पर अपकेंद्रित्र.
    7. 1 मिलीलीटर पूरी संस्कृति मीडिया के साथ दो बार गोली धो लें.
    8. अच्छी तरह से प्रति 50 μl Matrigel में जरूरत, resuspending तहखाने के रूप में 6: 3 या 1: 1 के अनुपात में विभाजित है. (धारा 1.1.16-18) ऊपर वर्णित के रूप में आगे बढ़ें.
  3. तहखाना Organoid बर्फ़ीली:
    1. संस्कृति के माध्यम से निकालें. 500 μl पीबीएस में नमूना धो लें.
    2. एक P1000 विंदुक टिप का उपयोग कर पतला प्रोटीन मिश्रण फैलाने.
    3. एक भी अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर मीडिया जोड़ें और 1 मिलीलीटर मीडिया में organoids resuspend.
    4. धीरे नीचे 20-30x ऊपर pipetting और से एक P1000 उपयोग कर organoids टूट गया.
    5. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब organoids स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट में 100 XG पर अपकेंद्रित्र.
    6. 1 मिलीलीटर पूरी संस्कृति मीडिया के साथ दो बार गोली धो लें.
    7. मीडिया ठंड 500 μl में Resuspend तहखाने.
    8. एक cryotube पर स्थानांतरण तहखाने, एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर overni में एक ठंड कंटेनर और दुकान में ट्यूब जगहght.
    9. तरल एन 2 टैंक को तहखाने स्थानांतरण.
      1. तेजी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में विगलन से जमे हुए तहखाना organoids किया. ऊपर वर्णित के रूप में 100 XG, पतला प्रोटीन मिश्रण में 5 मिनट और resuspend, और संस्कृति पर 500 μl के साथ पूरा संस्कृति एक बार मीडिया, अपकेंद्रित्र धो लें. बेहतर वसूली के लिए, ठंड मीडिया रॉक अवरोध करनेवाला (वाई 27,632) जोड़ें.

2. तहखाना Organoid चयापचय परख

  1. 24 अच्छी तरह से थाली तैयारी:
    1. पृथक और प्रोटोकॉल (तहखाना अलगाव और तहखाना पारित होने के लिए खंड 1.2 के लिए अनुभाग 1.1 देखें) के अनुसार तहखाने गिनती.
    2. पतला प्रोटीन मिश्रण में Resuspend तहखाने (20 μl प्रति 100-200 तहखाने).
    3. 24 अच्छी तरह से परख थाली में प्लेट तहखाना-पतला प्रोटीन मिश्रण निलंबन (प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम triplicates पर कर रहे हैं बनाना) और निलंबन सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर जमना करने की अनुमतिइनक्यूबेटर; तो 500 μl पूरी संस्कृति मीडिया जोड़ें.
    4. (धारा 1.1 में वर्णित के रूप में) और तहखाने पूरी तरह से विकसित organoids रूप में विकसित होने तक खुर्दबीन के नीचे का निरीक्षण संस्कृति तहखाने.
  2. कोशिकी फ्लक्स परख:
    1. रात भर एक गैर सीओ 2 में हाइड्रेट कारतूस (0% सीओ 2), 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर.
    2. संस्कृति के माध्यम से निकालें और 500 μl DMEM के साथ दो बार organoids धोने (बिना: ग्लूकोज, एल glutamine, सोडियम पाइरूवेट और सोडियम बाइकार्बोनेट, और साथ: फिनोल लाल). 5 मिनट रुको.
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से परख मध्यम प्रति (DMEM के 2 मिमी एल glutamine और 5 मिमी ग्लूकोज़) के साथ 675 μl जोड़ें.
    4. Organoids और पतला प्रोटीन मिश्रण washes के बाद बरकरार हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए तहखाना organoids सूक्ष्म आकृति विज्ञान की जाँच करें. एक गैर-सीओ 2 में 1 घंटा, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर सेते हैं.
    5. 10 माइक्रोन इंजेक्शन यौगिकों (oligomycin, कार्बोनिल साइनाइड-P-trifluoro-methoxy-फिनाइल-hydrazone (FCCP) तैयार करें, Rotenone) परख मध्यम में.
    6. सेट-अप कारतूस कारतूस क्रमिक रूप से बंदरगाहों में 10 माइक्रोन इंजेक्शन यौगिकों के 75 μl लोड करके: बंदरगाह एक - oligomycin; पोर्ट बी - FCCP; और पोर्ट सी - rotenone (परख के दौरान अंतिम सांद्रता 1 माइक्रोन) हो जाएगा.
    7. कारतूस 30 मिनट सेते हैं - 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक गैर-सीओ 2 इनक्यूबेटर में.
    8. इसके साथ ही, एक्सएफ विश्लेषक पर बारी और परख प्रोटोकॉल टेम्पलेट बनाएँ.
    9. कारतूस "जांचना" एक्सएफ विश्लेषक में कारतूस और उपयोगिता थाली प्लेस और चलाते हैं.
    10. वे पतला प्रोटीन मिश्रण से जुड़े होते हैं बनाना microscopically तहखाना organoids की जाँच करें.
    11. साधन और रन परख प्रोटोकॉल में लोड सेल संस्कृति की थाली.

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Representative Results

तहखाना organoids 8 महीने पुराने C57BL / 6 चूहों से स्थापित किए गए थे पोषण 76A (AIN76A) के कृंतक आहार अमेरिकी संस्थान शुद्ध खिलाया. आंतों तहखाना organoids एक भी तहखाना (चित्रा 1 ए, एक लाल तीर) से विस्तारित अवधि के लिए संस्कृति में उगाया जा सकता है. Organoids संस्कृति में 18-20 दिनों में (चित्रा 1 बी, लाल तीर) तहखाना संरचनाओं की तरह बाहर हो जाना. तहखाने हर 3 सप्ताह passaged गया और organoids कुशलता से प्रत्येक पारित होने निम्नलिखित बरामद किए.

Seahorse बायोइनरजेटिक्स उपकरण वास्तविक समय में संस्कृति में बढ़ कोशिकाओं में एक साथ माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस की दरों का आकलन कर सकते हैं. हम तहखाना organoid चयापचय परख करने के लिए इस प्रौद्योगिकी अनुकूलित. 8 महीने के लिए चूहों खिलाया AIN76A शुद्ध आहार से ली गई organoids के साथ, हम मापा:. 1 ऑक्सीजन की खपत दर, ओसीआर चित्रा 2A में दिखाया गया है - लाल रेखा तहखाना organoids में ऑक्सीजन की खपत की दर (pmol / मिनट) का प्रतिनिधित्व, नीले वें हैकेवल Matrigel (पतला प्रोटीन मिश्रण) के साथ ई नियंत्रण कुओं; चित्रा 2B में दिखाया 2. बाह्य अम्लीकरण दर (ECAR) - तहखाना organoids में बाह्य अम्लीकरण दर (मील प्रति घंटे / मिनट) का प्रतिनिधित्व लाल रेखा, नीला ही पतला प्रोटीन मिश्रण के साथ नियंत्रण कुओं है.

चित्रा 1
चित्रा 1:. पुराने C57BL / 6 चूहों 8 महीने से व्युत्पन्न तहखाना organoids तहखाने (ए) 2 दिन या (बी) संस्कृति में 18 दिन हैं. स्केल: 100 माइक्रोन.

चित्रा 2
चित्रा 2: 8 महीने पुराने C57BL / 6 चूहों से ली गई organoids का उपयोग बायोइनरजेटिक्स परख. (ए) ऑक्सीजन की खपत की दर (ओसीआर) दिखाया गया है;

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Discussion

हम बेसल दर की माप के बाद, तहखाना चयापचय oligomycin, कार्बोनिल साइनाइड जोड़कर मूल्यांकन किया गया था. ऑक्सीजन की खपत की दर (ओसीआर) और 8 महीने पुराने चूहों से अलग और organoids पूर्व vivo में हो तहखाने के बाह्य अम्लीकरण दर (ECAR) का परीक्षण किया क्रमिक रूप से -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) और rotenone,.

29 मिनट (2A चित्रा और 2 बी) - बेसल ओसीआर और बेसल ECAR 0 से दर्ज किए गए. 29 वें मिनट में, (बंदरगाह से) oligomycin (दोनों तहखाने और नियंत्रण कुओं के लिए, एन = 3) अच्छी तरह से प्रत्येक में इंजेक्ट किया गया था. Oligomycin एक एटीपी संश्लेषण अवरोध करनेवाला है. यह राज्य 3 (phosphorylating) श्वसन रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस प्रकार, oligomycin इंजेक्शन के कारण माइटोकांड्रिया में एटीपी संश्लेषण की नाकाबंदी करने के लिए, ओसीआर में मामूली कमी हुई है, और तहखाने ECAR में वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप एटीपी के लिए उनकी आवश्यकता को पूरा करने के लिए ग्लाइकोलाइसिस के लिए बंद. 64 वें मिनट, FCCP (fro है परएम बंदरगाह बी) अच्छी तरह से प्रत्येक में इंजेक्ट किया गया था. FCCP एटीपी पीढ़ी के लिए आवश्यकता के बिना तेजी से ऊर्जा की खपत के लिए अग्रणी, mitochondrial झिल्ली भर में हाइड्रोजन आयनों परिवहन, एक मोबाइल आयन वाहक है. ओसीआर कारण uncoupling की वृद्धि हुई और ECAR तहखाने इस प्रकार, एटीपी उत्पन्न करने के लिए ग्लाइकोलाइसिस रोजगार synthesizing और लैक्टिक एसिड स्रावित द्वारा अपनी ऊर्जा संतुलन बनाए रखा के बाद से वृद्धि हुई है. 99 वें मिनट में, (बंदरगाह सी से) rotenone अच्छी तरह से प्रत्येक में इंजेक्ट किया गया था. Rotenone एक माइटोकॉन्ड्रियल अवरोध करनेवाला है. इस प्रकार, तीसरा इंजेक्शन के कारण बिगड़ा mitochondrial समारोह को ओसीआर में कमी करने के लिए नेतृत्व और ऊंचा ECAR मूल्यों रखते हुए एक अधिक ग्लाइकोलाइटिक राज्य को तहखाने में स्थानांतरित कर दिया.

दो मुख्य निष्कर्ष हैं: कई मार्ग के माध्यम से सफलतापूर्वक सुसंस्कृत थे 8 महीने पुराने चूहों से 1) तहखाना organoids; व्युत्पत्ति oligomycin के लिए एक चयापचय प्रतिक्रिया प्रदर्शन के बाद 2 महीने के लिए संस्कृति में passaged गया था कि 2) organoids, कार्बोनिल साइनाइड-P-trifluoromethoxyphen ylhydrazone और rotenone. इस प्रकार, organoids की ग्लाइकोलाइटिक क्षमता calorically प्रतिबंधित चूहों से organoids अपेक्षाकृत स्थायी रूप से संस्कृति 12 में विभिन्न विकास और चयापचय phenotypes के लिए अनुकूलित कर रहे हैं कि रिपोर्ट के साथ संगत संस्कृति में 2 महीने के बाद स्थिर था.

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं आंतों तहखाने की चयापचय पढ़ाई में बहुत महत्व का हो जाएगा. तहखाना अलगाव के लिए प्रोटोकॉल सातो एट अल से अनुकूलित है. 10 विश्लेषण प्रौद्योगिकी सूचना नहीं गया है बायोइनरजेटिक्स का उपयोग छोटे आंत्र तहखाना organoid संस्कृतियों में तहखाना चयापचय के अध्ययन के लिए प्रोटोकॉल. तहखाना organoid चयापचय पढ़ाई आगे संस्कृति मीडिया और इस तरह के चयापचय मार्ग मिलाना सकता है कि विभिन्न ऊर्जा स्रोतों, inhibitors और विशिष्ट संकेत और चयापचय मार्ग की activators, और hypoxic शर्तों के रूप में परख शर्तों के विभिन्न चर शुरू बढ़ाया जा सकता है.

"ontent> इन प्रोटोकॉल लागू करते समय विशेष ध्यान देने की जरूरत है कि तकनीकी मुद्दे हैं. तहखाना संख्या और तहखाना organoid संस्कृतियों के विकास दक्षता तहखाना स्रोत के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, जैसे जंगली प्रकार चूहों बनाम आनुवंशिक रूप से परिवर्तित से तहखाने. इस प्रकार, तहखाना बोने घनत्व एक परीक्षण चलाकर प्रयोगों के लिए समायोजित किया जा सकता है. इसके अलावा, तहखाने और organids सतहों के लिए छड़ी करने के लिए एक मजबूत प्रवृत्ति है. बेहतर पैदावार के लिए, सभी ट्यूब (1.5 मिलीग्राम, 15 मिलीग्राम, और 50 मिलीलीटर ट्यूब) pipettes और विंदुक युक्तियाँ हो सकता है रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट बफर खारा में 1% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ लेपित. परिणाम bicinchoninic एसिड का उपयोग कर कुल प्रोटीन एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है (बीसीए) परख. चयापचय परख के बाद, 24 अच्छी तरह से थाली तक बर्फ पर रखा है बीसीए परख. बीसीए परख के लिए, तहखाने धीरे ठंड पीबीएस 500 μl में तीन बार धोया जाता है और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मिलाते हुए जोरदार द्वारा पीछा पीबीएस में 75 μl 0.1 एन NaOH में lysed. एक P1000 पिपेट कर सकते हैंनीचे अप-सेल को बढ़ावा देता है पतला प्रोटीन मिश्रण और pipetting तोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. तहखाना सेल के बाद, कोशिकाओं के लिए मानक बीसीए परख प्रोटोकॉल का पालन किया जा सकता है. यह बीसीए परख द्वारा सही रूप तहखाना प्रोटीन एकाग्रता का आकलन करने के लिए इस प्रकार इन कुओं में पृष्ठभूमि प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए बायोइनरजेटिक्स विश्लेषण भर में "केवल Matrigel" नियंत्रण कुओं है और महत्वपूर्ण है.

प्रस्तुत तहखाना organoid चयापचय पढ़ाई रिश्तेदार रोग के जोखिम और चयापचय फेनोटाइप मिलाना और इस प्रकार जोखिम को कम कर सकते हैं कि दृष्टिकोण के प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए उपयोगिता का पता लगाने के लिए सामान्य और रोगी व्युत्पन्न उपकला मिनी हिम्मत करने के लिए लागू किया जा सकता है. यहाँ वर्णित चयापचय assays के रोग विकास के लिए रिश्तेदार जोखिम के संभावित मूल्यांकन के लिए और रोग राज्य, अपनी जैव रासायनिक और आणविक विच्छेदन और संभावित मॉडुलन का जल्दी पता लगाने के लिए नई रणनीति का परिचय. संक्षेप में, हम छोटे intestina अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णनएल तहखाने और संस्कृति तहखाना organoids. इसके अलावा, हम तहखाना organoid ऊर्जा चयापचय का अध्ययन करने के लिए बाह्य अम्लीकरण और ऑक्सीजन की खपत दरों का निर्धारण करने के लिए organoid संस्कृति तहखाना उपयोग करने के लिए एक उपन्यास विधि परिचय. पूर्व vivo तहखाना organoid आंतों जीव विज्ञान को समझने के लिए नई रणनीति को परिभाषित करेगा पढ़ाई रूपरेखा संस्कृति चयापचय.

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Disclosures

कोई खुलासे कर रहे हैं.

Acknowledgments

इस अध्ययन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से अनुदान RO1 सीए 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 और P3013330 द्वारा समर्थित किया गया था.

हम तहखाना अलगाव प्रोटोकॉल के विकास में उनके बहुमूल्य टिप्पणी के लिए मिशेल ह्यूस्टन, ऐलेना Dhima और डॉ अन्ना Velcich धन्यवाद देना चाहूंगा.

हम भी प्रत्यक्ष और क्रमशः, seahorse सुविधा संचालित जो मधुमेह प्रशिक्षण और एनआईएच P60DK20541 द्वारा समर्थित मेडिसिन के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ रिसर्च सेंटर, और डॉ माइकल ब्राउनली और डॉ ज़ू-लिआंग दू, धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free BD Biosciences 356231
PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 Life Technologies 20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x) Life Technologies 12634-028
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate Sigma-Aldrich D5030
Phenol red sodium salt Sigma-Aldrich P4758 Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2
Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml Life Technologies 15240-062 Final concentration 1x or 2x
Penicilin-Streptomycin, liquid Life Technologies 15140-122 Final concentration 1x
Gibco® GlutaMAX™ supplement Life Technologies 35050061 Final concentration 1x
Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M Life Technologies 15630-080 Final concentration 10 mM
N-acetyl-L-cysteine, 25 g Sigma-Aldrich A9165-25G Final concentration 1 mM
100x N-2 supplement, liquid Invitrogen 17502-048 Final concentration 1x
50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid Invitrogen 12587-010 Final concentration 1x
Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg R&D Systems 3474-RS-050 Final concentration 500 ng/ml
Recombinant Murine EGF, 100 μg Peprotech 315-09 Final concentration 50 ng/ml
Recombinant Murine Noggin, 20 μg Peprotech 250-38 Final concentration 100 ng/ml
Gibco® L-glutamine, 200 mM Life Technologies 25030-081 Final concentration 2 mM
Gibco® glucose powder Life Technologies 15023-021 Final concentration 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 Life Technologies AM9260G Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8
Name Company Catalog Number Comments
DTT (dithiothreitol), 1M Life Technologies P2325 Final concentration 3 mM
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma-Aldrich A2058 0.1% in PBS
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044 1% in PBS
Recovery™ Cell Culture Freezing Medium Life Technologies 12648-010
ROCK inhibitor (Y-27632) Sigma-Aldrich Y0503 Final concentration 10 μM
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 Final concentration 1 μM
Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920 Final concentration 1 μM
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Final concentration 1 μM
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465 Final concentration 0.1 N in PBS
XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) Seahorse Bioscience

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References

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  2. Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
  3. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
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  12. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).

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कैंसर जीवविज्ञान अंक 93 कोलोरेक्टल कैंसर माउस छोटी आंत तहखाना Organoid आहार चयापचय कोशिकी अम्लीकरण दर ऑक्सीजन की खपत दर
में मेटाबोलिक प्रोफ़ाइल के वास्तविक समय विश्लेषण<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; माउस आंतों तहखाना Organoid संस्कृति
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Bas, T., Augenlicht, L. H. Real Time … More

Bas, T., Augenlicht, L. H. Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures. J. Vis. Exp. (93), e52026, doi:10.3791/52026 (2014).

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