Summary
Dunne darm crypte organoids gekweekt ex vivo een weefselkweek systeem dat de groei van de crypten afhankelijk van stamcellen en hun niche recapituleert. We hebben een methode om het metabole profiel in real time in primaire muis crypte organoids assay. We vonden organoids behouden fysiologische eigenschappen gedefinieerd door hun bron.
Abstract
De kleine darmslijmvlies vertoont een repeterende architectuur georganiseerd in twee fundamentele structuren: villi, die uitsteekt in het darmlumen en samengesteld uit volwassen enterocyten, bekercellen en entero-endocriene cellen; en crypten, wonende proximaal van de submucosa en de muscularis, herbergen volwassen stamcellen en progenitor cellen en rijpe Paneth cellen en stromale en immuuncellen van de crypte micromilieu. Tot de laatste jaren, in vitro studies van dunne darm beperkt tot cellijnen die afkomstig zijn van zowel goedaardige of kwaadaardige tumoren, en niet de fysiologie van normale darmepitheel en de invloed van de micro-omgeving waarin zij verblijven vertegenwoordigen. Hier tonen we een aangepaste werkwijze van Sato et al. (2009) voor het kweken van primaire muis intestinale crypte organoids afgeleid uit C57BL / 6 muizen. Daarnaast presenteren we het gebruik van de crypte organoïde culturen naar de crypte metabole profiel in real time door de maatregel assayment van basale zuurstofverbruik, glycolytic rate, ATP productie en respiratoire capaciteit. Organoids behouden eigenschappen gedefinieerd door hun bron en de aspecten van hun metabolische aanpassing weerspiegeld door zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven behouden. Real time metabole studies in deze crypte organoïde kweeksysteem zijn een krachtig hulpmiddel om crypte organoïde energiemetabolisme te bestuderen, en hoe het kan worden gemoduleerd door voedings- en farmacologische factoren.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) is de derde belangrijke oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten. Sporadische darmkanker - dat wil zeggen, dat later die zich voordoen in het leven (> 50 jaar) en zonder duidelijke predisponerende genetische factoren - is goed voor ~ 80% van alle gevallen, met de incidentie sterk beïnvloed door langdurige voedingspatronen 1,2. Deze tumoren vertonen een metabolische verschuiving naar afhankelijkheid oxidatieve glycolyse, zogenaamde Warburgeffect, die gedeeltelijk kunnen maken hogere concentraties van cellulaire bouwstenen en energie beschikbaar (via glutaminolysis) mogelijk te maken en wellicht hoge percentages tumorcelproliferatie 3-5 drijven . Studies darmkanker en andere gastro-intestinale kanker waaronder dunne darm kanker verschaffen belangrijke inzicht in de oorzaak van tumorvorming. Het onderzoeken van de metabole verschillen tussen normale, pro-tumorigene en tumorigeen staten van gastro-intestinale organen kan det helpenermination relatieve risico op tumorontwikkeling en vroegtijdige detectie van neoplasie. Bovendien is het begrip van bio-energetische stofwisseling waarbij mitochondriale ademhaling en glycolyse zal fundamenteel inzicht in hoe de cel fysiologie, veroudering en de ziekte staat verstoort intestinale homeostase bieden. Benutting van de bio-energetica assay technologie voor extracellulaire flux analyse kunnen de tarieven van de mitochondriale ademhaling en glycolyse gelijktijdig beoordelen in cellen groeien in cultuur in real time 6,7.
Tot voor kort, werden in vitro onderzoek van dunne darm beperkt tot cellijnen die afkomstig zijn van zowel goedaardige of kwaadaardige tumoren 8,9 en niet de fysiologie van normale darmepitheel en de invloed van de micro-omgeving waarin zij verblijven vertegenwoordigen. In 2009, Sato et al. 10 introduceerde een ex vivo cultuur systeem om driedimensionale (3D) muis intestinale epitheliale organoids groeien, of epithEliel "mini-lef", geschikt voor experimentele, diagnostische en therapeutische onderzoeken 10,11. Bovendien crypten geïsoleerd van calorisch beperkte muizen behouden hun veranderde groei-eigenschappen als organoids in dergelijke culturen 12. Vergeleken met getransformeerde cellijnen kunnen crypte organoïde culturen worden fysiologisch relevante gegevens die een beter model voor de in vivo toestand begrijpen genereren.
We aangepast bioenergetica analyse technologie om energie-metabolisme van intestinale crypte organoids assay. Muis intestinale crypte organoids werden gekweekt ex vivo naar de crypte organoïde energiemetabolisme studies gepresenteerd ontwikkelen. De zuurstof verbruik (OCR) en de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van crypte organoids werden gemeten in de afwezigheid en aanwezigheid van twee verschillende metabolische remmers (oligomycin, rotenon) en een ion drager (carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). De crypte organoid metabole reactie op deze chemische verbindingen werden met succes tot uiting door middel van het wijzigen van ECAR en OCR-waarden.
Cellulaire bio-energetische studies zullen de wederzijdse interacties tussen metabole toestand en ziekterisico en fenotype verhelderen bij kanker, obesitas, diabetes, metabole stoornissen en mitochondriale ziekten en helpen vooraf screeningsmethoden met rechtstreekse gevolgen voor translationele geneeskunde. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol te dunne darm crypten te isoleren en cultuur crypte organoids. Bovendien introduceren we een nieuwe methode om crypte organoïde culturen gebruiken voor metabole assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door de Commissie voor de ethiek van dierproeven van het Albert Einstein College of Medicine.
1. Crypt Isolatie en Cultuur
- Isolatie van crypten uit de dunne darm:
- Isoleer intestinale crypten van elke muizenmodel met rente. Euthanaseren de muizen met CO2, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Het openstellen van de buik in de lengte en vul de dunne darm (SI) met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS (-Ca 2+; Mg 2+) met 2x antibiotica-antimycotische (anti-anti). Snel isoleren dunne darm.
- Grondig ontleden vrij van mesenteriale vet met behulp van een scalpel. Wees voorzichtig niet om het weefsel te perforeren - te allen tijde te houden het weefsel vochtig met ijskoude PBS. Openstellen inteStine lengterichting en grondig wassen met ijskoud PBS.
- Snijd dunne darm in twee secties en plat uit met behulp van een nat wattenstaafje voorzichtig afschrapen van de villi met behulp van een vooraf gekoeld slide. Was krachtig in ijskoude PBS meerdere malen.
- Incubeer 3 min in 20 ml 1 x PBS per 3 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) /0.5 mM dithiothreitol (DTT) voor niet-enzymatische dissociatie van het weefsel.
- Snij weefsel in kleine stukjes (2-4 mm) met een scheermesje op een voorgekoelde slide. Breng de stukken in een 50 ml buis met 20 ml ijskoud PBS.
- Pipet op en neer zachtjes 10x met behulp van een 10 ml steriele wegwerp pipet. Laat weefselfragmenten sediment door de zwaartekracht. Verwijder het supernatant met een pipet. Herhaal dit drie extra tijden; zorg ervoor dat bovenstaande is duidelijk.
- Voeg 20 ml PBS per 2 mM EDTA. Swirl en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min met zachte wiegen.
- Laat weefsel sediment en gooi supernatant. Voeg 15 ml ijskoude PBS en pipetop en neer 5x met een pipet 10 ml. Laat de weefselfragmenten sediment en het verzamelen van de supernatant als Fractie 1 (F1). Herhaal verzamelen F2-F5, elke fractie apart gehouden.
- Voeg 15 ml ijskoude PBS en deze keer Schud krachtig met de hand gedurende 15 sec. Verzamel F6 en herhaal voor F7, F8. Als weefsel stukken beginnen te zweven, tikt u op om hen te helpen vestigen.
- Inspecteren een aliquot van elke fractie onder de microscoop. Pool die fracties die crypten.
- Passeer de samengevoegde fracties door middel van een 70 micrometer nylon cel zeef, het verzamelen van crypten in een 50 ml buis.
- Centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, gooi supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml ijskoude PBS met 2x anti-anti crypten en overbrengen naar een 15 ml buis. Herhaal het wassen nog een keer.
- Was de crypten een keer met 10 ml ijskoude ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco 's Modified Eagle Medium / Ham' s F-12) - 2x anti-anti.
- Was de crypten een keer met 10 ml ADF - 1x anti-anti.
- Tel de crypten met behulp van een hemocytometer. Stel de crypte oplossingsvolume en naar een 1,5 ml buis zodanig dat de uiteindelijke concentratie bij crypte geresuspendeerd zal 100-500 crypten per 50 ui gelatineuze eiwitmengsel (Matrigel). Centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer crypten in de gelatineuze eiwitmengsel.
- Plaat 50 ui crypt - gelatineuze eiwitmengsel suspensie per putje in een 24-well plaat (groeigebied: 2 cm 2) voorzichtig plaatsen van de suspensie daling in het midden van elk putje. Handhaving van de plaat in een CO 2, 37 ° C incubator voor ~ 30 min tot de schorsing stolt.
- Voeg 500 ul ijskoud compleet kweekmedium (DMEM Uitgebreid / F12 met 1x anti - anti, 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 supplement, 1x N2 supplement, 1 mM N-Acetyl-L-cysteïne (NAC), 50 ng / ml epidermale groeifactor (EGF), 100 ng / mlHersenpan, 500 ng / ml R-Spondin).
- Reconstitueren groeifactoren in 0,1% runderserumalbumine (BSA) in PBS.
- Crypte organoïde Cultuur en Passage:
- Passage crypt organoids 14-21 dagen na zaaien (of naar behoefte) als volgt:
- Change media elke vrijdag en maandag. Op woensdag, vervang de helft van de media met verse media.
- Verwijder het kweekmedium. Tweemaal spoelen van het monster met 500 pi PBS bij 5 min intervallen.
- Verwijder PBS en voorzichtig breken de geleiachtige eiwit mengsel met behulp van een steriele P1000 micro pipet tip.
- Voeg 1 ml compleet voedingsbodems tot één goed en resuspendeer de organoids in 1 ml media.
- Zachtjes verstoren de organoids met een P1000 door en neer te pipetteren 20-30x (kijk onder de microscoop voor juiste organoïde dissociatie met een goede opbrengst crypte totdat een consistente techniek ontwikkeld).
- Breng de crypten naar een 1,5 ml microcentrifugebuis;Centrifugeer bij 100 xg bij 4 ° C, 5 min.
- Was de pellet twee keer met 1 ml compleet kweekmedium.
- Splitsing in een verhouding van 1: 3 of 1: 6 als nodig resuspenderen crypten in 50 gl per putje Matrigel. Ga te werk zoals hierboven beschreven (paragraaf 1.1.16-18) beschreven.
- Passage crypt organoids 14-21 dagen na zaaien (of naar behoefte) als volgt:
- Crypte organoïde Invriezen:
- Verwijder het kweekmedium. Was het monster in 500 pi PBS.
- De verspreiding van de geleiachtige eiwit mengsel met behulp van een P1000 pipet tip.
- Voeg 1 ml media om één goed en resuspendeer de organoids in 1 ml media.
- Breek voorzichtig de organoids met een P1000 door en neer te pipetteren 20-30x.
- Breng de organoids naar een 1,5 ml tube. Centrifugeer bij 100 xg bij 4 ° C, 5 min.
- Was de pellet twee keer met 1 ml compleet kweekmedium.
- Hersuspendeer crypten in 500 pi bevriezing media.
- Transfer crypten een cryotube Plaats de buis in een bevriezing container en op een -80 ° C vriezer overnight.
- Transfer crypten om vloeibare N 2 tank.
- Recover bevroren crypte organoids door snel ontdooien in een 37 ° C waterbad. Wassen met 500 ul compleet kweekmedium eenmaal centrifuge bij 100 xg, 5 min en resuspendeer in gelatineuze eiwitmengsel en cultuur zoals hierboven beschreven. Voor beter herstel, voeg ROCK inhibitor (Y-27632) aan de bevriezing media.
2. Crypt organoïde Metabolisme Assay
- 24-well plaat Bereiding:
- Isoleren en tel crypten volgens het protocol (zie paragraaf 1.1 voor crypte isolatie en paragraaf 1.2 voor crypte passage).
- Hersuspendeer crypten in geleiachtige eiwitmengsel (100-200 crypten per 20 pi).
- Plaat crypt-geleiachtige eiwitmengsel suspensie in een 24-well assay plaat (zorg ervoor dat er ten minste drie exemplaren voor elk monster) en laat de schorsing te stollen bij 37 ° C in een CO 2incubator; voeg dan 500 ul compleet voedingsbodems.
- Cultuur crypten (zoals beschreven in paragraaf 1.1) en de in acht te nemen onder de microscoop tot crypten uitgroeien tot volledig ontwikkelde organoids.
- Extracellulaire Flux Assay:
- Hydraat cartridge overnacht in een niet-CO 2 (0% CO 2), 37 ° C incubator.
- Verwijder het kweekmedium en was organoids tweemaal met 500 ul DMEM (zonder glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, en met: fenolrood). Wacht 5 min.
- Voeg 675 ul per putje assaymedium (DMEM met 2 mM L-glutamine en 5 mM D-glucose) aan elk putje.
- Controleer crypte organoids microscopische morfologie om ervoor te zorgen dat organoids en de geleiachtige eiwit mengsel intact zijn na de wasbeurten. Incubeer 1 uur in een niet-CO 2, 37 ° C incubator.
- Bereid 10 uM injecteerbare verbindingen (oligomycin, carbonyl cyanide-p-trifluor-methoxy-fenyl-hydrazon (FCCP), rotenone) in testmedium.
- Set-up van de cartridge door het laden van 75 pi van 10 uM injecteerbare verbindingen in de havens van de cartridge sequentieel: Port A - oligomycin; Port B - FCCP; en Port C - rotenon (De uiteindelijke concentraties tijdens de test zal 1 uM zijn).
- Incubeer cartridge 30 minuten - 1 uur bij 37 ° C in een niet-CO 2 incubator.
- Tegelijkertijd zet de XF Analyzer en maak de assayprotocol template.
- Plaats cartridge en het nut plaat in XF Analyzer en run "kalibreren" cartridge.
- Controleer crypte organoids microscopisch onderzoeken om ervoor te zorgen dat ze gehecht zijn aan de geleiachtige eiwitmengsel.
- Load celkweekplaat naar instrument en run-test protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Crypte organoids werden vastgesteld op basis van 8 maanden oude C57BL / 6 muizen gevoed gezuiverd knaagdierendieet American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinale crypte organoids kunnen worden gekweekt in cultuur voor langere tijd van een enkele crypte (Figuur 1A, enkele rode pijl). Organoids groeien uit crypte-achtige structuren in 18-20 dagen in kweek (Figuur 1B, rode pijlen). Crypten werden gepasseerd om de 3 weken en organoids efficiënt hersteld na elke passage.
Seahorse bioenergetica instrumentatie kunnen de tarieven van de mitochondriale ademhaling en glycolyse tegelijkertijd te beoordelen in cellen groeien in cultuur in real time. We paste deze technologie crypte organoïde metabolisme assay. Met organoids afgeleid van muizen gevoed AIN76A gezuiverd dieet gedurende 8 maanden, we gemeten:. 1 zuurstof verbruik, OCR weergegeven in figuur 2A - rode lijn vertegenwoordigt zuurstof verbruik (pmol / min) in crypte organoids, blauw is the controleputjes alleen Matrigel (het gelatineuze mengsel eiwit); 2. extracellulaire aanzuursnelheid (ECAR) weergegeven in figuur 2B - rode lijn vertegenwoordigt extracellulaire aanzuursnelheid (MPH / min) in crypte organoids, blauw is de controle putten alleen met de geleiachtige eiwitmengsel.
Figuur 1:. Crypt organoids afgeleid van 8 maanden oude C57BL / 6-muizen crypten (A) 2-dagen of (B) 18 dagen in kweek. Schaal: 100 urn.
Figuur 2: Bioenergetica assay gebruikt organoids afgeleid van 8 maanden oude C57BL / 6 muizen. (A) Het zuurstofverbruik rate (OCR) is aangegeven;
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We testten het zuurstofverbruik rate (OCR) en de extracellulaire aanzuursnelheid (ECAR) van crypten geïsoleerd van 8 maanden oude muizen en uitgegroeid tot organoids ex vivo. Na meting van de basale snelheid, werd crypte metabolisme geëvalueerd door het toevoegen oligomycin, carbonyl cyanide -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) en rotenon, sequentieel.
Basaal OCR en basale ECAR werden geregistreerd 0-29 min (figuur 2A en 2B). Op de 29ste min, oligomycin (van poort A) werd geïnjecteerd in elk putje (n = 3, zowel crypten en controleputjes). Oligomycin is een ATP-synthese remmer. Het wordt gebruikt toestand 3 (fosfo-) ademhaling te voorkomen. Aldus oligomycin injectie resulteerde in een lichte daling OCR, vanwege blokkade van ATP-synthese in mitochondria en de crypten geschakeld glycolyse hun vereiste ATP resulteert in een toename ECAR voldoen. Op de 64e min, FCCP (from poort B) werd geïnjecteerd in elk putje. FCCP is een mobiele ion drager, transporteren waterstofionen over de mitochondriale membraan, leidt tot een snelle energieverbruik zonder ATP generatie. OCR toegenomen als gevolg van ontkoppeling en ECAR toegenomen sinds de crypten handhaafden hun energiebalans door het gebruik van glycolyse om ATP te genereren, waardoor het synthetiseren en afscheiden melkzuur. Op de 99 ste min, rotenon (van poort C) werd geïnjecteerd in elk putje. Rotenone is een mitochondriaal inhibitor. Dus de derde injectie leidde tot een afname van OCR vanwege verminderde mitochondriale functie en verschoof de crypten een glycolytische toestand houden van de ECAR waarden verhoogd.
Er zijn twee belangrijke conclusies: 1) crypte organoids vanaf 8 maanden oude muizen werden met succes door middel van meerdere passages gekweekt; 2) organoids die passage was in kweek gedurende 2 maanden na afleiding vertoonde een metabole respons op oligomycin, carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphen ylhydrazone en rotenon. Aldus glycolytische vermogen van organoids was stabiel na 2 maanden in kweek, in overeenstemming met het rapport dat organoids van calorisch beperkte muizen relatief permanent aangepast aan verschillende groei en metabole fenotypen in kweek 12.
De in dit protocol beschreven experimentele procedures zullen van groot belang zijn in de metabole studies van intestinale crypten. Het protocol voor isolatie crypte wordt aangepast van Sato et al. 10 Het protocol voor het bestuderen crypt metabolisme in kleine darm crypt organoïde culturen met bioenergetica analysetechniek is niet gemeld. De crypte organoïde metabolisme studies kan worden uitgebreid verdere invoering van verschillende variabelen om de cultuur media en testomstandigheden, zoals verschillende energiebronnen, inhibitoren en activatoren van specifieke signalering en metabole routes, en hypoxische condities die metabole routes kunnen moduleren.
NHOUD "> Er zijn technische problemen die speciale aandacht nodig hebben bij het toepassen van deze protocollen. Crypt aantal en de groei van de efficiëntie van de crypte organoïde culturen kunnen variëren, afhankelijk van de crypte bron, bijv crypten van genetisch veranderde versus wild-type muizen. Zo crypte seeding dichtheid kan worden aangepast experimenten door het uitvoeren van een proef. Bovendien crypten en organids een sterke neiging tot kleven aan oppervlakken. Voor een betere opbrengsten alle buizen (1,5 ml, 15 ml en 50 ml buisjes), pipetten en pipetpunten kunnen bekleed met 1% foetaal runderserum in fosfaatgebufferde zoutoplossing bij 4 ° C geïncubeerd. De resultaten worden genormaliseerd aan totale eiwitconcentratie met de bicinchoninezuur (BCA) assay. Na de metabolische test, de 24-well plaat op ijs gehouden totdat de BCA test. Voor de BCA assay crypten worden voorzichtig gewassen in 500 ui koude PBS driemaal en gelyseerd in 75 pl 0,1 N NaOH in PBS gevolgd door krachtig schudden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Een P1000 pipet kanworden gebruikt om de gelatineuze eiwitmengsel pipetteren breken beneden bevordert lysis. Na crypte lysis, kan de standaard BCA assay protocol voor cellen worden gevolgd. Het is belangrijk "Matrigel alleen" controleputjes gehele bioenergetica analyse om de achtergrond eiwitconcentratie in deze putten te meten en zo de crypte eiwitconcentratie nauwkeurig bepalen van de BCA assay.Crypte organoïde metabolisme studies gepresenteerd kan worden toegepast op de normale en de patiënt afgeleid epitheliale mini-lef om het hulpprogramma voor de vroege evaluatie van het relatieve risico van de ziekte en benaderingen die metabole fenotype kunnen moduleren en daarmee het risico te verminderen verkennen. De metabole assays beschreven introduceren van nieuwe strategieën ter mogelijke evaluatie van het relatieve risico voor ontwikkeling van de ziekte en voor vroege detectie van ziektetoestand, de biochemische en moleculaire dissectie en mogelijke modulatie. Samengevat beschrijven we een gedetailleerd protocol voor kleine intestina isolerenl crypten en cultuur crypte organoids. Daarnaast introduceren we een nieuwe methode om crypt organoïde cultuur voor het bepalen van extracellulaire verzuring en zuurstofverbruik tot crypte organoïde energiemetabolisme bestuderen gebruiken. Ex vivo crypt organoïde cultuur metabole profilering studies zullen nieuwe strategieën voor het begrijpen van intestinale biologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen mededelingen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 en P3013330 van de National Institutes of Health.
Wij willen Michele Houston, Elena Dhima en Dr. Anna Velcich bedanken voor hun waardevolle opmerkingen bij het ontwikkelen van de crypte isolatie protocol.
We danken ook de Diabetes Training and Research Center van het Albert Einstein College of Medicine ondersteund door NIH P60DK20541, en Dr Michael Brownlee en Dr. Xue-Liang Du, die sturing en bediening van de Seahorse faciliteit, respectievelijk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free | BD Biosciences | 356231 | |
| PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2 | Life Technologies | 20012-027 | |
| Advanced DMEM/F-12 (1x) | Life Technologies | 12634-028 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium w/o glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | P4758 | Final Concentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2 |
| Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml | Life Technologies | 15240-062 | Final concentration 1x or 2x |
| Penicilin-Streptomycin, liquid | Life Technologies | 15140-122 | Final concentration 1x |
| Gibco® GlutaMAX™ supplement | Life Technologies | 35050061 | Final concentration 1x |
| Gibco® HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Final concentration 10 mM |
| N-acetyl-L-cysteine, 25 g | Sigma-Aldrich | A9165-25G | Final concentration 1 mM |
| 100x N-2 supplement, liquid | Invitrogen | 17502-048 | Final concentration 1x |
| 50x B-27® supplement minus Vitamin A, liquid | Invitrogen | 12587-010 | Final concentration 1x |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50 μg | R&D Systems | 3474-RS-050 | Final concentration 500 ng/ml |
| Recombinant Murine EGF, 100 μg | Peprotech | 315-09 | Final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant Murine Noggin, 20 μg | Peprotech | 250-38 | Final concentration 100 ng/ml |
| Gibco® L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Final concentration 2 mM |
| Gibco® glucose powder | Life Technologies | 15023-021 | Final concentration 5 mM |
| Ambion® 0.5 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | Final concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT (dithiothreitol), 1M | Life Technologies | P2325 | Final concentration 3 mM |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | 0.1% in PBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | 1% in PBS |
| Recovery™ Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Sigma-Aldrich | Y0503 | Final concentration 10 μM |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | Final concentration 1 μM |
| Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | Final concentration 1 μM |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Final concentration 1 μM |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Final concentration 0.1 N in PBS |
| XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer) | Seahorse Bioscience |
References
- Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
- Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
- Warburg, O.
- Coles, N. W., Johnstone, R. M. Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells. Biochem J. 83, 284-291 (1962).
- Medina, M. A., Castro I, N. unezde Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells. Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).
- Anso, E., et al. Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC. Cancer Metab. 1, 7 (2013).
- Malmgren, S., et al. Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity. J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).
- Whitehead, R. H., et al. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
- Roig, A. I., et al. Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro. Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).
- Sato, T., et al. Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
