Abstract
cardiomyopathy dystrophic הוא תוצאה הבינה היטב של ניוון שרירים. יצירת תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מחולים עם מחלת ניוון שרירים היא מקור רב ערך לסלולרי במבחנה מערכות מודל מחלה ויכולה לשמש למחקרי הקרנת סמים. תאי שמקורם בחולה שתן כבר בשימוש בתכנות מחדש מוצלח בתאי גזע pluripotent מושרה במטרה לבנות מודל cardiomyopathy dystrophic 1. בהתייחסו לחששות הבטיחות של שילוב מערכות וקטור, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות וקטור וירוס שאינו שילוב סנדאי לתמרה של יאמאנאקה גורמים לתאי שתן שנאספו מחולים עם מחלת ניוון שרירים. פרוטוקול זה יוצר לתכנות מחדש באופן מלא שיבוטים תוך 2-3 שבועות. תאי pluripotent הם נטול וקטור על ידי מעבר-13. יכול להיות מובחן iPSCs dystrophic אלה לתוך שריר לב ומשמש גם ללמוד מנגנוני מחלה או להקרנת סמים.
Introduction
קרדיומיופתיה היא הסיבה המובילה השניה למוות בחולים עם מחלת ניוון שרירים דושן והבקר (MD). למרות שמוטציות בגן דיסטרופין צמוד X להתרחש ב 1: 3,500 לידות של זכרים, מעט מאוד ידוע על האירועים המולקולריים ותאיים שמוביל לנזק לשרירי לב מתקדם. תאי גזע אנושיים pluripotent מושרה נגזרים מחולי ניוון שרירים צמחו ככלי רומן כדי לחקור את מנגנוני מחלה הבסיסיים ולהשתמש בסמים להקרנת 1,2.
אי הנוחות הצפויה של ביופסיות עור או דגימות דם עלול להניא חולים צעירים ו / או האפוטרופוסים שלהם לתת את ההסכמה להשתתפות במחקר. דגימות שתן הן מקור בלתי פולשנית של תאים סומטיים שamendable לשיטות תכנות מחדש. הראינו לאחרונה כי תאי שתן שנאספו מחולי ניוון שרירים יכולים להיות מתורבתים וביעילות לתכנות מחדש לiPSCs באמצעות התמרה retroviral עם גורמי יאמאנאקה (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, ו- c-Myc; OSKM) 1. החסרון של מסירת גן retroviral הוא שילוב של גני תכנות מחדש לכרומוזומים המארח האקראי. כדי להתגבר על מגבלה זו, השתמשנו וירוס סנדאי הלא שילוב לתכנות מחדש של תאי שתן.
פרוטוקול זה מפרט את תכנות מחדש של תאי וירוס סנדאי שתן מבודדים מחולי ניוון שרירים אז מה שיכול להיות מובחן לתוך שריר לב או סוגי תאים אחרים למחקר נוסף. פרוטוקול זה גם יכול להיות מותאם למחלות ספציפיות מטופל אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: חולים ו / או האפוטרופוסים שלהם צריכים לתת הסכמה מדעת להשתתפות במועצה לביקורת מוסדית אישרו מחקר.
1. חוצצים והכנות מדיה
- חיץ כביסה: כדי להכין של חיץ כביסה 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר של עט 100x / פתרון סטרפטוקוקוס (100 U / ml פניצילין + 100 / מיליליטר מיקרוגרם של סטרפטומיצין) 99 מיליליטר של תמיסת מלח פוספט חיץ (PBS).
- תא אב שתן בינוני (UPC): כדי להכין מדיום UPC, לערבב כמויות שווה של תא בינוני keratinocyte סרום חינם (KSF) בינוני + אב.
- KSF בינוני: כדי להכין מדיום keratinocyte, להוסיף 5 / מיליליטר ng של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 50 / מיליליטר ng של תמצית בלוטת יותרת המוח שור (BPE), 30 / מיליליטר ng של רעלן הכולרה, ופתרון העט / סטרפטוקוקוס (100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר) ל 500 מיליליטר בינוני KSF.
- תא אב בינוני: להוסיף שלושה רבעים של DMEM עם רבע מתקשורת Ham-F12 ולהשלים עם 10% FBS, 0.4 מיקרוגרם / מיליליטר הידרוקורטיזון, 0.1רעלן הכולרה ננומטר, 5 ng / ml אינסולין, 1.8 x 10 -4 אדנין M, 5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 2 x 10 thyronine M triiodo, 10 ng / ml EGF, והעט / סטרפטוקוקוס פתרון -9.
- הס בינוני: הוסף 20% החלפת KO-סרום (K-SR), חומצות אמינו לא חיוניות 1x ממ, l-גלוטמין 2 מ"מ, β-mercaptoethanol 100 מיקרומטר, 20 ng / ml bFGF ועט / סטרפטוקוקוס 400 מיליליטר DMEM / בינוני F12.
אוסף דוגמאות 2. שתן
- להורות לחולים לשתות נוזלים 30 דקות לפני איסוף שתן על מנת להבטיח כי כמות מספקת (~ 30-40 מיליליטר) של שתן יכולה להיות שנאספו.
- תן חולים ו / או האפוטרופוסים שלהם ערכת איסוף שתן המכילה את הפריטים הבאים: (1) הוראות בכתב על איך להשיג דגימת שתן לתפוס סטרילי או נקייה, (2) toilettes אנטי בקטריאלי הלח, ו- (3) 100 מיליליטר סטרילי כוס אוסף דגימה. להורות חולים כדי לאסוף דגימה.
- מייד למקם את דגימות שתן על קרח ולהעביר לlaboraטורים בצידנית. לעבד את השתן לבידוד תא באופן מיידי. אם עיכוב הוא בלתי נמנע, לאחסן את הדגימה על קרח במשך שעה עד 4 עם הפסד מינימאלי של כדאיות תא.
3. בידוד והרחבת תאים שתן
הערה: בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים בBSL2 בטיחות ביולוגית קבינט.
- שימוש בטפטפות סטרילי, דגימות שתן להעברת סטרילי צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל. צנטריפוגה בg × 400 במשך 10 דקות ב RT.
- לשאוב supernatant עוזב 1 מיליליטר בצינור; להיזהר לא להפריע תא גלולה.
- Resuspend ולשלב את כדורים מצינורות מרובים לתוך 7 מיליליטר של חיץ כביסה וחזור צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 10 דקות ב RT.
- בזהירות לשאוב supernatant, עוזב את התא גלולה ו~ 0.2-0.5 מיליליטר של supernatant. Resuspend ב 2-3 מיליליטר של תא אב שתן בינוני (UPC) ולהעביר את ההשעיה ל4-6 בארות של האו"םצלחת 24 מצופה היטב.
- לאחר 72 שעות, להשלים את התרבות עם 0.5 מיליליטר של מדיום UPC טרי בכל טוב ולשנות בינוני כל 2-3 ימים לאחר. אריתרוציטים ותאי קשקש שלא לצרף הצלחת יוסרו עם השינויים בינוניים.
- צג התרבות לאחר 4-6 ימים.
הערה: מושבות תאים קטנות 2-4 יתחילו להופיע. תאים יעוגלו או מאורכים המייצגים סוג I או II סוג של האפיתל כליות (RE) תאי בהתאמה 3. - לשנות את המדיום כל 2-3 ימים מאז פעם התאים מופיעים, הם יעברו שלב התרחבות מהיר.
- ברגע שהתאים מגיעים 80-90 מפגש%, סביב 9-15 ימים לאחר ציפוי, לנתק והמעבר התאים (15,000-18,000 תאים / 2 סנטימטר) על 2-4 בארות של 24 צלחת גם להתרחבות נוספת. מסמן זאת כתא מעבר 1 (P1).
- לאפיין תאי שתן למפרטי שושלת באמצעות ניתוח התזרים cytometric, immunohistochemצביעת iCal או באמצעות תגובת שרשרת transcriptase-פולימראז הפוכה (RT-PCR).
- לתכנת מחדש תאי שתן מבודדים (סעיף 4) או להקפיא אותם בהקפאה בינונית (DMEM בתוספת סרום 10% ו -10% DMSO) לcryostorage לטווח ארוך.
תכנות מחדש Cell 4. תנו שימוש וירוס סנדאי
הערה: הטיפול הנכון והשימוש בPPE (ציוד מגן אישי) מומלצת בעוד מניפולציה סוכני transfecting. בצע את השלבים בתנאים סטריליים בBSL2 בטיחות ביולוגית קבינט הבא. הסילוק נאות של transfecting תאי סוכן ו / או transfected מומלץ להימנע מסיכון של סכנות בריאותיות וסביבתיות. לתכנות מחדש של תאי שתן, להשתמש סנדאי תכנות מחדש קיט עם שינויים לפרוטוקול המזין תלוי של היצרן כפי שיפורט להלן.
- כדי להבטיח תכנות מחדש יעילות גבוהה באמצעות וירוס סנדאי, שימוש קטעים 1-5 תאי שתן שמהיריםly החלוקה. אם התאים לא לשכפל היטב או להיות senescent, להשליך אותם כפי שהם לא לתכנת מחדש את יעילות.
- זרע 60,000 תאים לכל גם בשתי בארות של צלחת 6 היטב. מארק זה כמו יום -2. התאם צפיפות זריעת תאים (5 x 4-9 אוקטובר x 10 4 תאים לכל טוב) לפי צורך כדי להגיע 80-90% על ידי מפגש יום 0.
- ביום 0 (48 שעות לאחר ציפוי התאים), להכין את וקטורי סנדאי תכנות מחדש (sev) המכילים כל אחד מגורמי OSKM ארבעה. להוסיף כל אחד מהווקטורים עד 1 מיליליטר של מדיום UPC מחומם מראש. השתמש במשרד פנים של 1-1.5 (5-7.5 x 10 5 CIU), אשר הוא מספק לתאי שתן תכנות מחדש. לשאוב הבינוני ומוסיף באיטיות 1 מיליליטר UPC + sev לטוב אחד תאי השתן. השתמש גם השני כשליטת התמרה שלילית.
- ביום 1, להחליף את מדיום UPC + sev עם מדיום UPC טרי. מוות של תאים מסוימים נתפס לאחר 24 שעות בשל cytotoxicity ויראלי.
- בהתאם ליעילות של תכנות מחדש clonתצורות דואר והמורפולוגיה הקומפקטית, לשמור על שינוי הבינוני מדי יום עד שהיום 6 או 7.
- יום אחד לפני הניתוק של תאי transduced (יום 5 או 6), להכין צלחות מזין MEF ידי ציפוי mitomycin-C (10 מיקרוגרם / מיליליטר במשך 3 שעות) שטופל MEFs בצפיפות של 5 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר, על 0.1 ג'לטין% מצופה 100 מנות מ"מ 2 תרבות.
- למחרת (יום 6 או 7), לנתק את התאים עם טריפסין 0.25%, resuspend התאים במדיום UPC וצלחת 5 x 10 4 - צלחת מזין 2 x 10 5 תאים / 100 מ"מ 2 MEF.
- למחרת, לעבור למדיום הס ולשנות את המדיום בכל יום. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ כדי לפקח על תאים הפכו.
הערה: התאים ליצור אגרגטים משובטים עם מורפולוגיה אופיינית מרוצפת ויש להם גרעין גבוה יחס cytoplasmic (לאחר התמרה 12-18 ימים). - בתוך שבועות עד שלושה שבועות לאחר התמרה, לאסוף מושבות ולהעביר לצלחות חדשות לclonהרחבת אל.
- לבצע מכתים תא חי לבחירת השיבוטים iPSC ידי דוגרים תאים עם TRA-1-81 נוגדן עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור ואחריו מכתים דלפק עם נוגדנים משני מצומדות צבע ניאון ספציפי עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור.
- שימוש במחט אינץ 'G ½ 1 26 לצלב-לבקוע TRA-1-81 שיבוטים גדולים יותר החיוביים iPSC לחתיכות בגודל שווה קטנות (4-6 חתיכות לשיבוט).
- השתמש פיפטה טיפ סטרילי כדי לאסוף ולהעביר 10-20 חתיכות צלב בקע משיבוטים מרובים לבאר כל Matrigel (10 מיקרוגרם / 2 סנטימטר) -coated 24 צלחת היטב עם מדיום הס.
הערה: פיסות משיבוט אחד מצופה בנפרד לתוך באר אחד לא להרחיב או לשמור על pluripotency. - לשנות מהס עד בינוני iPSC 24-48 שעות לאחר השיבוטים לתכנות מחדש מחוברים אל פני השטח Matrigel.
- במהלך תחזוקה על צלחות Matrigel מצופה, ידני scraPE-את כל תאים מובחנים או תאים מזינים MEF לזהם בעזרת פיפטה טיפ להעשיר לשיבוטי dystrophic לתכנות מחדש וpluripotent מלא iPSC (MD-iPSC).
- לאחר שיבוטים בודדים שהגיעו לגודל מיקרומטר ~ 100, להרחיב את השיבוטים על ידי מתנער עם 0.48 mM EDTA (חומצת ethylenediaminetetraacetic) פתרון במשך 3 דקות וציפוי אגרגטים תא קטנים של MD-iPSCs התלוי במדיום iPSC (בתוספת 5 מיקרומטר Y27632, Rho קינאז מעכב ) על matrigel הטרי (10 מיקרוגרם / 2 סנטימטר) מצופה 12 צלחת גם. שנה בינונית iPSC יומי.
- תכנות מחדש מלא של כל שיבוט יכול להיקבע על ידי שני ניתוח ביטוי גנים של גני OSKM ומכתים immunohistochemical של סמני pluripotency (Oct3 / 4 וTRA-1-81). הערכה קפדני של פוטנציאל pluripotency צריך להיות מועסק כדי לאשר קווי iPSC לתכנות מחדש באופן מלא יכולים להתמיין לשלוש שכבות נבט. זה יכול להיות מושלם גם על ידי גוף embryoid assay (EB) היווצרות והבידול או terassay היווצרות Atoma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רוב התאים המבודדים משתן אנושי הם חיוביים לסמני אב וpericyte uroepithelial כגון CD44, CD73, וCD146 (97.37%, 97.09%, ו97.3% בהתאמה; איור 1 א ו -1 B). תאים אלה באו לידי ביטוי גם סמני mesenchymal אחרים כגון אקטין אלפא-שריר החלק וvimentin (איור 1). ניתוח RT-PCR נותן עדות לאוכלוסייה מעורבת של תאים בתרביות שביש ביטוי חלש של cytokeratin-7 (CK-7) וUroplakin (UP) -Ia & -IIIa, סמנים של שושלת uroepithelial (איור 1 ג).
צעדי תכנות מחדש מסוכמים על ידי סכמטי באיור 2 א. נציג תמונות להוכיח את המורפולוגיה של התאים במהלך נקודות זמן שונות לאורך הפרוטוקול (איור 2). תאי השתן להפוך ממוארכים, תאי סוג II (יום 0) לתוך תבנית מרוצפת (יום 4) במהלך תכנות מחדש. B12 שיבוטים יום y, אופייניים pluripotent (iPSC) נראים והם מסוגלים לשמור על המורפולוגיה שלהם pluripotent בתנאים חופשיים מזין (iPSC-P2). מכתים תא חי לTRA-1-81 מזהה שיבוטים לתכנות מחדש (איור 2 ג).
כדי לאשר את הדור של וקטור ושיבוטי pluripotent transgene חופשי, RT-PCR מתבצע באמצעות פריימרים נגד הגנום הנגיפי sev וכל אחד מהגורמים אקסוגניים OSKM. עד-הרגולציה של גורמי תכנות מחדש אנדוגני גם ניתן לאשר בשלב זה. ביטוי גנים אקסוגניים כבר לא זוהה על ידי מעבר-13, אבל עד-הרגולציה של גורמים במשק נראית (איור 3 א). מכתים Immunofluorescent מאשר ביטוי סמן pluripotency על iPSCs (Oct3 / 4 וTRA-1-81; איור 3). ביטוי גני תכנות מחדש אנדוגני ראה בתאי שתן עלול להוביל תאים אלה לתכנת מחדש ביעילות גבוהה יותר 1, בהשוואה למקורות תא סומטי אחרים. Expres שיאון של גן דיסטרופין וחלבון מאומת על ידי צביעת immunofluorescence, כתם מערבי (WB) וRT-PCR ניתוחים (איור 3 ג-ה). מכתים Immunofluorescent של UCS הפראי הסוג וiPSCs לדיסטרופין להפגין לוקליזציה גרעינית לידי ביטוי 11 בiPSCs, אבל מעט מאוד UCS הביע חיובי (איור 3 ג). כדי לוודא ביטוי דיסטרופין בתאים, ניתוח immunoblot לדיסטרופין גילה כי איזופורם בכל מקום דיסטרופין (Dp71) הוא השולט איזופורם מיוצר בiPSCs הסוג בר, בעוד iPSCs dystrophic חסר ביטוי גני דיסטרופין יש ביטוי Dp71 בלתי ניתן לגילוי (איור 3D). מוטציות מחיקת אקסון בדיסטרופין ניתן לאשר בiPSCs dystrophic באמצעות פריימרים ספציפיים איגוף אקסונים נמחקו. אין הגברה PCR מזוהה בiPSCs dystrophic אילו iPSCs הסוג בר להפגין הגברה תמליל דיסטרופין (איור 3E).
בתוך-page = "תמיד"> 
אפיון איור 1. בתאים מבודדים שתן (UCS) מראה אב uroepithelial, mesenchymal ושושלות שריר חלק. (א) ניתוח תזרים cytometric של UCS משש עם נוגדנים מצומדות נגד סמני uroepithelial וpericyte CD44, CD73 וCD146. מכתים (B) Immunofluorescent של UCS עם CD44, αSMA וvimentin. פרופיל ביטוי גנים של UCS (C) להראות ביטוי חלש של CK-7 וUP-Ia וUP-IIIa בהשוואה לדגימות בקרה חיוביות, תוך ביטוי גנים של אקטין שריר אלפא-חלק (αSMA) דומה לביקורת חיובית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
להעלות / 52,032 / 52032fig2highres.jpg "width =" 700px "/>
איור 2. תכנות מחדש של UC כדי ליצור iPSCs. (א) סקירה סכמטי של ציר זמן תכנות מחדש. (ב) תמונות המייצגות מורפולוגיות שונות של UCS במהלך התמרה sev, ביום 0 (התמרה sev), יום 4 (מעבר מורפולוגיות), יום 12 (שיבוטים pluripotent מתעוררים בMEFs) ושיבוט iPSC האופייני בתנאי מזין ללא (iPSC -P2 על Matrigel). הדמיה תא חי לTRA-1-81 לזהות מושבות pluripotent ביום (17 ג). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. דור של נגיפי הגנום וtransgene iPSCs חינם. ()ניתוח ביטוי גנים מראה הנוכחות של הגנום sev וtransgenes OSKM במעבר 2 (iPSC-P2) והיעלמותם על ידי מעבר 13 (iPSC-P13) ואילו ביטוי גני אנדוגני נמשך לאורך כל דרך. תמונות (B) בניגוד השלב וimmunofluorescence השוואת Oct3 / 4 וTRA-1-81 צביעה בUCS וiPSCs התוצאה. (C) דיסטרופין הוא זוהה על ידי immunofluorescence בiPSCs wild-type לעומת wild-type UCS, ו( D) איזופורם דיסטרופין הספציפי (Dp71) יכול להיות מאושר על ידי WB. ניתוח (E) RT-PCR משמש כדי לאשר את מחיקת אקסון דיסטרופין הספציפית בiPSCs dystrophic לעומת UCS wild-type וiPSCs. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שם מגיב / חומרים / ציוד | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| GAPDH-קדימה פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | GTGGACCTGACCTGCCGTCT |
| GAPDH-הפוך פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT |
| CK7-קדימה פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | TGGTGCTGAAGAAGGATGTG |
| CK7-הפוך פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | CACGCTGGTTCTTGATGTTG |
| Up-Ia-קדימה פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | ACGTCCTACACCCACCGTGA |
| Up-Ia-הפוך פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | ACCCCACGTGTAGCTGTCGAT |
| Up-IIIa-קדימה פריימר | IDT Inc. | Seq gIven בתגובות | ACAAACAGAGGGTGGGAGGA CAG |
| Up-IIIa-הפוך פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | AGAAGGGCAGGGAGCCCAGG |
| αSMA-קדימה פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | ACCCACAATGTCCCCATCTA |
| αSMA-הפוך פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | TGATCCACATCTGCTGGAAG |
| Oct3 / 4 (אקסוגני) -Forward פריימר * | IDT Inc. | * ערכת החיים Tech-Cytotune | CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG |
| Oct3 / 4 פריימר -Reverse (אקסוגני) * | IDT Inc. | * ערכת החיים Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Sox2 (אקסוגני) -Forward פריימר * | IDT Inc. | * ערכת החיים Tech-Cytotune | ATGCACCGCTACGACGTGAG CGC |
| Sox2 (אקסוגני) -Reversהדואר פריימר * | IDT Inc. | * ערכת החיים Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Klf4 (אקסוגני) -Forward פריימר * | IDT Inc. | * ערכת החיים Tech-Cytotune | TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Klf4 (אקסוגני) -Reverse פריימר * | IDT Inc. | * ערכת החיים Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| cMyc (אקסוגני) -Forward פריימר * | IDT Inc. | * ערכת החיים Tech-Cytotune | TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| cMyc (אקסוגני) -Reverse פריימר * | IDT Inc. | * ערכת החיים Tech-Cytotune | TCCACATACAGTCCTGGATGAT GATG |
| Sev (אקסוגני) -Forward פריימר * | IDT Inc. | * ערכת החיים Tech-Cytotune | GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| Sev (אקסוגני) -Reverse פריימר * | IDT Inc. | * ערכת החיים Tech-Cytotune | CCAGACAAGAGTTTAAGAGA TATGTATC |
| Oct3 / 4 (אנדוגני) -Forward פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | CAGTGCCCGAAACCCACAC |
| Oct3 / 4 (אנדוגני) -Reverse פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | GGAGACCCAGCAGCCTCAAA |
| Sox2 (אנדוגני) -Forward פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | CAAGATGCACAACTCGGAGA |
| Sox2 (אנדוגני) -Reverse פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | GTTCATGTGCGCGTAACTGT |
| דיסטרופין-קדימה פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | GGCAAAAACTGCCAAAAGAA |
| דיסטרופין-הפוך פריימר | IDT Inc. | Seq ניתנו בהערות | GACCTGCCAGTGGAGGATTA |
טבלת 1. רשימה של פרירצפי mer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דוגמנות מחלות לב וכלי דם באמצעות iPSCs הופכת גישה נפוצה להבין את התרומה הגנטית 4-6. כמה קשיים בלתי צפויים של קבלת דגימות תאים מחולים, ילדים צעירים במיוחד, יכולים להימנע על ידי המציע את האפשרות של גישה לא פולשנית כגון איסוף שתן. באוכלוסיית חולים הצעירה הזה, הוא לעתים קרובות קשה לאסוף נפח השתן מספיק כדי להניב מספיק תאי שתן לתכנות מחדש. אימון החולים הצעירים לשתות נוזלים 30 דקות לפני האיסוף שתן משפר את ההצלחה של בידוד תא שתן. עם זאת, אוספי שתן חוזרים ייתכן שיהיו צורך באוכלוסייה זו. יש לנו שילוב והתאמה שני פרוטוקולים שונים 3,7 על מנת לייעל את הבידוד והתרבות של UCS מחולים עם מחלת ניוון שרירים.
תאי גזע pluripotent מושרה כבר נוצרו משני fibroblasts עור או תאי שתן מpatien ניוון שריריםts 1,2. עם זאת, שני פרוטוקולי תכנות מחדש הסתמכו על lentiviruses להציג גורמי תכנות מחדש לתאים סומטיים. שיטת העברה זו שילוב וירוס יכולה להיות בעייתית אם transgene משלב באופן אקראי לתוך הגנום המארח וגורם גם מחדש transgene או mutagenesis (הנסקרת ב 8). לכן, אנו שיפרנו על הטכניקות הללו על ידי שימוש בוירוס סנדאי לtransduce transgenes OSKM לתוך תאי השתן באופן שאינו שילוב 9.
שיטה זו משתמשת בוירוס סנדאי לתכנת מחדש UCS מציעה את היתרון של גישה הלא-שילוב עם יעילות התמרה גבוהה 9,10. תאי שתן שנאספו מחולי ניוון שרירים הם תוכנתו מחדש תוך 2-3 שבועות לאחר התמרה. קינטיקה תכנות מחדש אלה הן דומות לתכנות מחדש UC באמצעות התמרה lentiviral 1. למרות שפרוטוקול זה ניתן לשנותם להקים שיטת מזין ללא לתכנות מחדש של תאי שתן, להיותing שיטה יעילה באמצעות התמרה Sendai-וירוס של תאי שתן מבודדים מחולי ניוון שרירים. שיטה זו תוארה מסתמכת על MEFs כמזין שכבה כדי להקים באופן מלא את שיבוט MD pluripotent לפני העברת תנאים למזין ללא במעבר 2.
ההפצה הגרעינית של איזופורם Dp71 של חלבון דיסטרופין כבר נקבעה עוד בדגמי תא שלב עובריים שונים 11,12. ביטוי בכל מקום זה של Dp71 בחלק מטריצה גרעיני של תאי שלב אב / עוברי המוקדמים מצביע על תפקידם בארכיטקטורה גרעינית ורגולצית מחזור תא 12. iPSCs הסוג שלנו לתכנות מחדש הפראי להביע Dp71; עם זאת, העדרה בiPSCs dystrophic לא לעכב את תכנות מחדש או פוטנציאל של תאי pluripotent dystrophic. לסיכום, המוטציות גנטי dystrophic נשמרות בiPSCs תכנות מחדש; מה שהופך אותו לכלי יעיל למודל cardiomyopathy dystrophic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Holo-transferrin from human | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - labeled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - labeled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - labeled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
