Abstract
Dystrofiske kardiomyopati er en dårligt forstået konsekvens af muskelsvind. Generering inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) fra patienter med muskelsvind er en uvurderlig cellulær kilde til in vitro sygdom modelsystemer og kan bruges til narkotika screening studier. Patient-afledte urin celler er blevet anvendt i en vellykket omprogrammering i inducerede pluripotente stamceller med henblik på at modellere dystrofiske kardiomyopati 1. Varetagelse sikkerhedsproblemer integrere vektorsystemer præsenterer vi en protokol ved hjælp af en ikke-integrerende Sendaivirusvektor for transduktion af Yamanaka faktorer urin celler opsamlet fra patienter med muskelsvind. Denne protokol genererer fuldt omprogrammeres kloner inden for 2-3 uger. De pluripotente celler er vektor-fri ved passage-13. Disse dystrofiske iPSCs kan differentieres i cardiomyocytter og anvendes enten til at studere sygdom mekanismer eller til lægemiddelscreening.
Introduction
Kardiomyopati er den næsthyppigste dødsårsag hos patienter med Duchenne og Becker muskeldystrofi (MD). Selvom mutationer i X-bundet dystrophingen forekomme i 1: 3.500 mandlige fødsler, er meget lidt kendt om de molekylære og cellulære begivenheder, der fører til progressiv hjertemusklen skader. Menneskelige induceret pluripotente stamceller fra Muskelsvindfonden patienter har vist sig som et nyt redskab til at studere de underliggende sygdomsmekanismer og bruge til narkotika screening 1,2.
Den forventede ubehag hudbiopsier eller blodprøver kan afholde unge patienter og / eller deres værger til at give samtykke til undersøgelsen deltagelse. Urinprøver er en non-invasiv kilde af somatiske celler, der er amendable til omprogrammering metoder. Vi har for nylig vist, at urin-celler opsamlet fra muskelsvind patienter kan dyrkes og effektivt omprogrammeres i iPSCs hjælp retroviral transduktion med Yamanaka faktorer (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, og c-Myc; OSKM) 1. Ulempen ved retroviral genlevering er den tilfældige integration af omprogrammering gener i værtskromosomerne. For at overvinde denne begrænsning, har vi brugt ikke-integrerende Sendaivirus for urin celle omprogrammering.
Denne protokol detaljer Sendaivirusset omprogrammering af isolerede urin celler fra Muskelsvindfonden patienter, som derefter kan differentieres i cardiomyocytter eller andre celletyper til yderligere undersøgelse. Denne protokol kan også tilpasses til andre patientpopulationer specifikke sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Patienter og / eller deres værger bør give informeret samtykke til at deltage i en Institutional Review Board godkendte undersøgelse.
1. Buffere og Media Forberedelser
- Vaskebuffer: Til fremstilling af 100 ml vaskebuffer, tilsættes 1 ml 100x pen / strep (100 U / ml penicillin + 100 ug / ml streptomycin) til 99 ml phosphatbuffer saltvand (PBS).
- Urinary progenitorcelle (UPC) Medium: At forberede UPC medium, bland lige dele keratinocyt Serum Gratis (KSF) Medium + progenitorcelleaktivitet Medium.
- KSF Medium: Til fremstilling keratinocyt medium, tilsættes 5 ng / ml epidermal vækstfaktor (EGF), 50 ng / ml oksehypofyseekstrakt (BPE), 30 ng / ml choleratoxin og pen / strep-opløsning (100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin) til 500 ml KSF medium.
- Progenitorcelle Medium: Tilsæt tre fjerdedele af DMEM med en fjerdedel af Ham-F12 medier og supplere med 10% FBS, 0,4 ug / ml hydrocortison, 0,1nM koleratoksin, 5 ng / ml insulin, 1,8 x 10 -4 M adenin, 5 ug / ml transferrin, 2 x 10 -9 M triiod thyronin, 10 ng / ml EGF, og pen / strep-opløsning.
- hES Medium: Tilsæt 20% KO-serum udskiftning (K-SR), 1x MEM ikke-essentielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin, 100 uM β-mercaptoethanol, 20 ng / ml bFGF og pen / strep til 400 ml DMEM / F12 medium.
2. urinprøve Collection
- Instruer patienterne til at drikke væske 30 min før urinopsamling at sikre, at en passende mængde (~ 30-40 ml) af urin kan opsamles.
- Giv patienterne og / eller deres værger en urinopsamling kit indeholder følgende punkter: (1) skriftlige instruktioner om, hvordan du får sterile eller rent fangst urinprøve, (2) fugtige antibakterielle toiletter, og (3) en 100 ml steril prøvetagning cup. Patienterne skal instrueres til at indsamle prøven.
- Umiddelbart placerer urinprøverne på is og overføre til laboratory i en køler. Proces urinen for celleisolering straks. Hvis en forsinkelse er uundgåelig, opbevare prøven på is i op til 4 timer med minimalt tab af cellernes levedygtighed.
3. Isolering og Udvidelse af urin Cells
BEMÆRK: Udfør følgende trin under sterile forhold i en BSL2 biologisk sikkerhedsskab.
- Brug sterile pipetter til at overføre urinprøver sterilt 50 ml centrifugerør. Der centrifugeres ved 400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer supernatanten forlader 1 ml i rør; Pas på ikke at forstyrre cellepelleten.
- Resuspender og kombinere pellets fra flere rør i 7 ml vaskebuffer og gentag centrifugering ved 400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Aspireres forsigtigt supernatanten forlader cellepelleten og ~ 0,2-0,5 ml supernatant. Resuspender i 2-3 ml urin stamceller (UPC) medium og overføre suspensionen i 4-6 brønde af en unovertrukket plade med 24 brønde.
- Efter 72 timer, supplere kultur med 0,5 ml frisk UPC medium per brønd og ændre medium hver 2-3 dage efter. De erythrocytter og planocellulære celler, der ikke knytter sig til pladen, vil blive fjernet med medium ændringer.
- Overvåg kultur efter 4-6 dage.
BEMÆRK: Små 2-4 cellekolonier vil begynde at dukke op. Celler vil blive afrundet eller aflange som repræsenterer type I eller type II af nedsat epitelial (RE) celler henholdsvis 3. - Skift medium hver 2-3 dage, siden en gang cellerne vises, vil de gennemgå en hurtig ekspansionsfase.
- Når cellerne nå 80-90% konfluens, omkring 9-15 dage efter udpladning, dissociere og passage af cellerne (15,000-18,000 celler / cm2) på 2-4 brønde af 24-brønds plade til yderligere ekspansion. Marker dette som celle passage 1 (P1).
- Karakterisere urin celler til slægt specifikationer gennem flowcytometrisk analyse, immunohistochemical farvning eller ved revers transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR).
- Omprogrammere isolerede urin celler (afsnit 4), eller fryse dem ned i frysning Medium (DMEM suppleret med 10% serum og 10% DMSO) for langsigtet cryostorage.
4. Urin Cell Reprogrammering Brug Sendai-virus
BEMÆRK: korrekt håndtering og brug af værnemidler (personlige værnemidler) anbefales samtidig at manipulere transficerende agenter. Udfør følgende trin under sterile forhold i en BSL2 biologisk sikkerhedsskab. Det anbefales at korrekt bortskaffelse af transfektion agent og / eller transficerede celler for at undgå risikoen for miljø- og sundhedsmæssige risici. For urin celle omprogrammering Brug en Sendai Omprogrammering Kit med ændringer af producentens feeder-afhængige protokol som beskrevet nedenfor.
- For at sikre høj effektivitet omprogrammering hjælp af Sendai-virus, anvendelse passager 1-5 af urin celler, der er hurtigely dividere. Hvis cellerne ikke replikere godt eller blive senescent, kassere dem, da de ikke vil omprogrammere effektivt.
- Seed 60.000 celler per brønd i to brønde i en 6-brønds plade. Marker dette som Day -2. Juster cellepodning densitet (5 x 04-9 oktober x 10 4 celler per brønd) som nødvendigt for at nå 80-90% konfluens på dag 0.
- På dag 0 (48 timer efter udpladning af cellerne), forberede Sendai omprogrammeringsbeslutninger vektorer (SeV) indeholdende hver af de fire OSKM faktorer. Tilføje hver af vektorerne til 1 ml forvarmet UPC medium. Brug en MOI på 1-1,5 (5-7,5 x 10 5 CIU), som er tilstrækkelig til omprogrammering urin celler. Aspirer mediet og langsomt tilsæt 1 ml UPC + SeV til en brønd af urinen celler. Brug den anden samt transduktionen negativ kontrol.
- På dag 1, erstatte UPC + SeV medium med frisk UPC medium. Nogle celledød ses efter 24 timer på grund af viral cytotoksicitet.
- Afhængig af effektivitet omprogrammeret Clone formationer og den kompakte morfologi, holde ændre mediet dagligt indtil dag 6 eller 7.
- En dag før dissociering af transducerede celler (dag 5 eller 6), forberede MEF fødepladerne ved udpladning Mitomycin-C (10 ug / ml i 3 timer) behandlet-MEF'er på densitet på 5 x 10 4 celler / cm2 på 0,1 % gelatine coated 100 mm 2 dyrkningsskåle.
- Næste dag (dag 6 eller 7), dissociere cellerne med 0,25% trypsin, resuspenderes cellerne i UPC medium og pladen 5 x Oktober 04-02 x 10 5 celler / 100 mm2 MEF feeder plade.
- Den følgende dag, skifte til hES medium og ændre mediet hver dag. Observer cellerne under et mikroskop for at overvåge transformerede celler.
BEMÆRK: Cellerne danner klonale aggregater med karakteristisk brosten morfologi og med højere kerne til cytoplasma ratio (12-18 dage efter transduktion). - Inden for to til tre uger efter transduktion, plukke kolonier og overføre til nye plader til Clonal ekspansion.
- Udfør levende celler farvning for udvælgelse IPSC kloner ved at inkubere celler med TRA-1-81-antistof i 1 time ved 37 ° C i CO2-inkubator efterfulgt af counter farvning med specifikke fluorescerende farvestof konjugeret sekundært antistof i 1 time ved 37 ° C i CO2-inkubator.
- Brug en 26 G 1½ inch nål på tværs af klækkes de større TRA-1-81 positive IPSC-kloner i små lige store stykker (4-6 stykker pr klon).
- Brug en steril pipette-tip til at vælge og overføre 10-20 skraverede stykker fra flere kloner i hver brønd i Matrigel (10 ug / cm2) belagte 24-brønds plade med HES medium.
BEMÆRK: Pieces fra en enkelt klon belagt individuelt i en enkelt brønd ikke udvide eller vedligeholde pluripotens. - Skift fra hES til iPSC medium 24-48 timer efter omprogrammerede kloner er fastgjort til Matrigel overflade.
- Under vedligeholdelse på Matrigelcoatede plader, manuelt SCRAPE-off eventuelle differentierede celler eller kontaminerende MEF feeder-celler under anvendelse af en pipette-tip til berigelse for fuldt omprogrammeres og pluripotente dystrofiske iPSC (MD-iPSC) kloner.
- Efter individuelle kloner har nået ~ 100 um størrelse, udvide kloner ved at dissociere med 0,48 mM EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre) opløsning i 3 min og plating små celleaggregater af MD-iPSCs suspenderet i iPSC medium (suppleret med 5 uM Y27632, Rho-kinase-inhibitor ) på frisk Matrigel (10 ug / cm2) coatet 12 brønds plade. Skift iPSC medium dagligt.
- Fuld omprogrammering af hver klon kan bestemmes ved både genekspression analyse af OSKM gener og immunhistokemisk farvning af pluripotens markører (Oct3 / 4 og TRA-1-81). En streng evaluering af pluripotens potentiale bør anvendes til at bekræfte fuldt omprogrammerede IPSC linjer kan differentiere til tre kimlag. Dette kan opnås enten ved embryoid legeme (EB) dannelse og differentiering assay eller et terAtoma formation assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fleste progenitorceller isoleret fra human urin er positive for uroepitele progenitor og pericyt markører, såsom CD44, CD73 og CD146 (97,37%, 97,09% og 97,3% henholdsvis, figur 1A og 1B). Disse celler udtrykte også andre mesenchymale markører, såsom alfa-glat muskel-actin og vimentin (figur 1B). RT-PCR-analyse giver bevis for en blandet population af celler i kulturer i, at der er svag ekspression af cytokeratin-7 (CK-7) og Uroplakin (UP) IA & -IIIa, markører for uroepitele afstamning (figur 1C).
Omprogrammering trin er sammenfattet af skematiske i figur 2A. Repræsentative billeder demonstrere morfologien af cellerne under forskellige tidspunkter i hele protokollen (figur 2B). De urin celler omdanne fra langstrakt, type II-celler (dag 0) i en brosten mønster (dag 4) under omprogrammering. By dag 12, typiske pluripotente kloner (IPSC) er set og er i stand til at opretholde deres pluripotente morfologi under feeder gratis betingelser Sikkerhed (IPSC-P2). Levende cellefarvning for TRA-1-81 identificerer omprogrammerede kloner (figur 2C).
For at bekræfte frembringelse af vektor og transgene fri pluripotente kloner er RT-PCR udført under anvendelse af primere mod SeV virusgenomet, og hver af de eksogene OSKM faktorer. Den opregulering af endogene omprogrammering faktorer kan også bekræftes ved dette trin. Det exogene gen ekspression ikke længere detekteres ved passage-13, men opregulering af endogene faktorer ses (figur 3A). Immunfluorescensfarvning bekræfter pluripotens markør ekspression på iPSCs (Oct3 / 4 og TRA-1-81; figur 3B). Den endogene omprogrammering genekspression set i urinen celler kan føre disse celler til at omprogrammere ved højere effektivitet 1, sammenlignet med andre somatiske celler kilder. De Expresdelse af dystrofin-genet og proteinet verificeres ved immunfluorescensfarvning, western blot (WB) og RT-PCR-analyser (figur 3C-E). Immunfluorescensfarvning af vildtype professionshøjskoler og iPSCs for dystrophin demonstrere indlysende kernelokalisering 11 i iPSCs, men meget få professionshøjskoler udtrykte positive (figur 3C). For at verificere dystrofin ekspression i cellerne, immunoblotanalyse for dystrofin afslørede, at den allestedsnærværende dystrofin isoform (Dp71) er den fremherskende isoform fremstilles i vildtype iPSCs, mens dystrofiske iPSCs mangler dystrofin genekspression har målbart Dp71 ekspression (figur 3D). De exon deletionsmutationer i dystrophin kan bekræftes i dystrofiske iPSCs anvendelse af specifikke primere, der flankerer de slettede exons. Ingen PCR-amplifikation er påvist i de dystrofiske iPSCs mens vildtype iPSCs demonstrere dystrofin udskrift forstærkning (Figur 3E).
inden-side = "altid"> 
Figur 1. Karakterisering af isolerede urin Cells (UCS) viser uroepitele stamfader, mesenkymale og glatte muskelceller slægter. (A) Flow cytometri af professionshøjskoler undersøgt med konjugerede antistoffer mod uroepitele og pericyt markører CD44, CD73 og CD146. (B) immunfluorescensfarvning af professionshøjskoler med CD44, αSMA og Vimentin. (C) Genekspression profil professionshøjskoler viser svage udtryk for CK-7 og UP-Ia og UP-IIIa i forhold til positive kontrolprøver mens genekspression af alfa-glatmuskelactin (αSMA) kan sammenlignes med positiv kontrol. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
upload / 52032 / 52032fig2highres.jpg "width =" 700 pixel "/>
Figur 2. Omprogrammering af UC til at generere iPSCs. (A) Skematisk oversigt over omprogrammering tidslinjen. (B) billeder, der repræsenterer forskellige morfologier af professionshøjskoler i SeV transduktion, på dag 0 (SeV transduktion) Dag 4 (morfologiske overgang), Dag 12 (pluripotente kloner dukker op på MEF'er) og den karakteristiske iPSC klon under fødefri betingelser (IPSC -P2 på Matrigel). (C) levende celler billeddannelse til TRA-1-81 for at identificere pluripotente kolonier på dag 17. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Generation af viralt genom og Transgene Gratis iPSCs. (A)Genekspressionsanalyse viser tilstedeværelsen af SeV genom og OSKM transgener ved passage 2 Sikkerhed (IPSC-P2) og deres forsvinden ved passage 13 Sikkerhed (IPSC-P13), mens endogene genekspression fortsætter hele vejen igennem. (B) Fase kontrast billeder og immunfluorescens sammenligner Oct3 / 4 og TRA-1-81 farvning i professionshøjskoler og resulterende iPSCs. (C) dystrofin detekteres ved immunofluorescens i vildtype iPSCs sammenlignet med vildtype UCS, og (D) den særlige dystrofin isoform (Dp71) kan bekræftes ved WB. (E) RT-PCR-analyse anvendes til at bekræfte den specifikke dystrofin exon sletning i dystrofiske iPSCs sammenlignet med vildtype professionshøjskoler og iPSCs. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Navn på Reagens / Material / Udstyr | Firma | Catalog Number | Kommentarer |
| GAPDH-forward primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | GTGGACCTGACCTGCCGTCT |
| GAPDH-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT |
| CK7-forward primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | TGGTGCTGAAGAAGGATGTG |
| CK7-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | CACGCTGGTTCTTGATGTTG |
| Up-Ia-forward primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | ACGTCCTACACCCACCGTGA |
| Up-Ia-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | ACCCCACGTGTAGCTGTCGAT |
| Up-IIIa-forward primer | IDT Inc. | Seq gIven i kommentarer | ACAAACAGAGGGTGGGAGGA CAG |
| Up-IIIa-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | AGAAGGGCAGGGAGCCCAGG |
| αSMA-forward primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | ACCCACAATGTCCCCATCTA |
| αSMA-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | TGATCCACATCTGCTGGAAG |
| Oct3 / 4 (Eksogen) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG |
| Oct3 / 4 (Eksogen) -Omvendt Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Sox2 (Exogenous) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | ATGCACCGCTACGACGTGAG CGC |
| Sox2 (Exogenous) -Reverse Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Klf4 (Exogenous) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Klf4 (Exogenous) -Omvendt Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| cMyc (Exogenous) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| cMyc (Exogenous) -Omvendt Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | TCCACATACAGTCCTGGATGAT GATG |
| SeV (Exogenous) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| SeV (Exogenous) -Omvendt Primer * | IDT Inc. | * Life Tech-Cytotune kit | ACCAGACAAGAGTTTAAGAGA TATGTATC |
| Oct3 / 4 (Endogen) -Forward Primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | CAGTGCCCGAAACCCACAC |
| Oct3 / 4 (Endogen) -Omvendt Primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | GGAGACCCAGCAGCCTCAAA |
| Sox2 (Endogen) -Forward Primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | CAAGATGCACAACTCGGAGA |
| Sox2 (Endogen) -Omvendt Primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | GTTCATGTGCGCGTAACTGT |
| Dystrofin-forward primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | GGCAAAAACTGCCAAAAGAA |
| Dystrofin-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq givet i kommentarer | GACCTGCCAGTGGAGGATTA |
Tabel 1. Liste over Primer sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modeling kardiovaskulære sygdomme ved hjælp iPSCs bliver en fælles tilgang til at forstå den genetiske bidrag 4-6. Nogle uventede vanskeligheder ved at få celleprøver fra patienter, især små børn, kan undgås ved at tilbyde mulighed for en ikke-invasiv metode såsom en urinopsamling. I denne unge patientpopulation, er det ofte vanskeligt at indsamle en mængde urin tilstrækkelig til at give nok urin celler til omprogrammering. Coaching de unge patienter til at drikke 30 min forud for urinopsamling forbedrer succes urin celleisolering. Dog kan gentagne urin samlinger være nødvendig i denne patientgruppe. Vi har kombineret og tilpasset to forskellige protokoller 3,7 for at optimere isolering og dyrkning af UCS fra patienter med muskelsvind.
Provokeret pluripotente stamceller er blevet genereret fra enten hudfibroblaster eller urin celler fra muskelsvind patients 1,2. Men begge omprogrammering protokoller påberåbt lentivira at indføre omprogrammering faktorer i de somatiske celler. Denne integration af virus leveringsmetode kan være problematisk, hvis transgen tilfældigt integreres i værtsgenomet og forårsager enten transgen reaktivering eller mutagenese (revideret i 8). Derfor vi forbedret på disse ved hjælp af et Sendai virus til transducere OSKM transgenerne i urinen celler i en ikke-integrerende måde 9.
Denne fremgangsmåde ved anvendelse af Sendai-virus til at omprogrammere UCS tilbyder fordelen ved en ikke-integrerende tilgang med en højere transduktionseffektivitet 9,10. Urin celler opsamlet fra Muskelsvindfonden patienter omprogrammeres inden for 2-3 uger efter transduktion. Disse omprogrammering kinetik er sammenlignelige med UC omprogrammering hjælp lentiviral transduktion 1. Selv om denne protokol kan skaleres til at etablere feeder-fri metode til urin celle omprogrammering, væreing en effektiv metode under anvendelse af Sendai-virus transduktion af urin celler isoleret fra muskelsvind patienter. Denne metode er beskrevet afhængig MEF'er som feeder-lag for fuldt fastslå pluripotente MD klon inden overførsel til fødefri betingelser ved passage 2.
Det nukleare fordeling af Dp71 isoform af dystrophinprotein har længe været etableret i forskellige embryonale fase cellemodeller 11,12. Denne allestedsnærværende udtryk for Dp71 i nukleare brøkdel af tidlige progenitor / fosterstadiet celler matrix antyder deres rolle i nukleare arkitektur og cellecyklus regel 12. Vores omprogrammerede vildtype iPSCs udtrykker Dp71; imidlertid sit fravær i dystrofiske iPSCs ikke hæmme omprogrammering eller pluripotente potentiale dystrofiske celler. Afslutningsvis er de dystrofisk genmutationer bevaret i omprogrammerede iPSCs; hvilket gør det et effektivt redskab til at modellere dystrofisk kardiomyopati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Holo-transferrin from human | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - labeled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - labeled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - labeled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
