Abstract
Cardiomiopatia distrófica é uma consequência pouco compreendido de distrofia muscular. Geração de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) de pacientes com distrofia muscular é uma fonte inestimável para celular in vitro sistemas modelo doença e pode ser usado para estudos de pesquisa de fármacos. Células derivadas de urina de doentes foram utilizadas na reprogramação em células estaminais pluripotentes induzidas, a fim de modelar cardiomiopatia distrófica 1. Responder às preocupações de segurança de integração de sistemas de vectores, apresentamos um protocolo usando um Sendai vetor do vírus não-integração para a transdução de Yamanaka fatores em células de urina coletadas de pacientes com distrofia muscular. Este protocolo gera clones totalmente reprogramado dentro de 2-3 semanas. As células pluripotentes são livres do vetor por passagem-13. Essas iPSCs distróficos podem se diferenciar em cardiomiócitos e usado tanto para estudar mecanismos de doença ou para o rastreio de drogas.
Introduction
Cardiomiopatia é a segunda principal causa de morte em pacientes com distrofia muscular de Duchenne e Becker (MD). Embora as mutações no gene da distrofina ligada a X ocorrer em 1: 3500 nascimentos do sexo masculino, muito pouco se sabe sobre os eventos moleculares e celulares que levam a lesão do músculo cardíaco progressivo. As células estaminais pluripotentes humanas induzida derivadas de pacientes com distrofia muscular emergiram como uma nova ferramenta para o estudo dos mecanismos patológicos subjacentes e usar-se para o rastreio de drogas 1,2.
O desconforto antecipada de biópsias de pele ou amostras de sangue pode dissuadir jovens pacientes e / ou seus responsáveis para dar o seu consentimento para participação no estudo. As amostras de urina são uma fonte não-invasivo de células somáticas que são alteráveis a métodos de reprogramação. Mostrámos recentemente que células de urina colhidas de pacientes com distrofia muscular podem ser cultivadas eficientemente e reprogramado em iPSCs utilizando transdução retroviral com os factores (YamanakaOCT3 / 4, Sox2, KLF4, e c-Myc; OSKM) 1. A desvantagem de entrega de genes retrovirais é a integração aleatória de genes de reprogramação em cromossomas hospedeiros. Para superar essa limitação, temos usado o vírus não-integração Sendai para a reprogramação celular urina.
Este protocolo detalha a reprogramação vírus Sendai de células isoladas de urina de pacientes com distrofia muscular, que pode então ser diferenciadas em cardiomiócitos e outros tipos de células para um estudo mais aprofundado. Este protocolo pode também ser adaptado para outras doenças específicas de pacientes.
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Protocol
NOTA: Os pacientes e / ou seus responsáveis devem dar consentimento informado para participar de um Comitê de Ética aprovou estudo.
1. Os tampões e Preparações Mídia
- Tampão de lavagem: Para preparar 100 ml de tampão de lavagem, adicionar 1 ml de caneta 100x / Solução strep (100 U / ml de penicilina + 100 ug / ml de estreptomicina) a 99 ml de solução salina de tampão fosfato (PBS).
- Urinária Progenitor Cell (UPC) Medium: Para preparar o meio UPC, misturar volumes iguais de Keratinocyte Serum Livre (KSF) Medium + Progenitor Medium Cell.
- KSF Médio: Para preparar o meio de queratinócitos, adicionam-se 5 ng / ml de factor de crescimento epidérmico (EGF), 50 ng / ml de extracto de pituitária de bovino (BPE), 30 ng / ml de toxina da cólera, e solução de pen / strep (100 L / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina) para 500 ml de meio de KSF.
- Medium Progenitor Cell: Adicione três trimestres de DMEM com um quarto de mídia Ham-F12 e suplementar com 10% FBS, 0,4 ug / ml de hidrocortisona, 0,1nM de toxina da cólera, 5 ng / ml de insulina, 1,8 x 10 ~ 4 M de adenina, 5 ug / ml de transferrina, 2 x 10 -9 M tironina triiodo, 10 ng / ml de EGF, e pen / strep solução.
- hES Médio: Adiciona-se 20% de substituição KO-soro (K-SR), aminoácidos não essenciais 1x MEM, 2 mM de L-glutamina, 100 uM β-mercaptoetanol, 20 ng / ml de bFGF e pen / strep a 400 ml de DMEM / F12.
Coleta de Amostras 2. Urina
- Instrua os pacientes a beber líquidos 30 minutos antes da coleta de urina para garantir que uma quantidade adequada (30-40 ml) de urina podem ser coletadas.
- Dê os pacientes e / ou seus responsáveis um kit de coleta de urina contendo os seguintes itens: (1) as instruções escritas sobre como obter estéril ou limpo amostra de urina captura, (2) toilettes anti-bacterianas úmidos, e (3) a 100 ml estéril espécime copo de coleta. Instruir os pacientes para coletar amostra.
- Imediatamente coloque as amostras de urina no gelo e transferir para o laboratory em um refrigerador. Processar a urina para o isolamento de células imediatamente. Se um atraso for inevitável, armazenar as amostras em gelo por até 4 horas com mínima perda de viabilidade celular.
3. Isolamento e expansão de células de urina
NOTA: Execute as seguintes etapas em condições estéreis em um BSL2 Gabinete de Segurança Biológica.
- Utilizando pipetas estéreis, amostras de urina de transferência estéril para tubos de centrifugação de 50 ml. Centrifuga-se a 400 x g durante 10 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante deixando 1 ml no tubo; ter cuidado para não perturbar o pellet celular.
- Ressuspender e combinar os peletes a partir de múltiplos tubos em 7 ml de tampão de lavagem e repetir a centrifugação a 400 x g durante 10 min à temperatura ambiente.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando o sedimento celular e ~ 0,2-0,5 mL de sobrenadante. Ressuspender em 2-3 ml de células progenitoras urinário (UPC) médio e transferir a suspensão em 4-6 poços de uma unrevestido placa de 24 poços.
- Após 72 h, completar a cultura com 0,5 ml de meio fresco UPC por cavidade e alterar meio cada 2-3 dias depois. Os eritrócitos e células escamosas que não ligam para a chapa será removida com o meio de mudanças.
- Monitorar cultura após 4-6 dias.
Nota: Pequenas 2-4 colônias de células vão começar a aparecer. As células serão arredondadas ou alongadas que representam tipo I ou II do epitelial renal (RE) de células, respectivamente 3. - Mudar a forma a cada 2-3 dias desde uma vez que as células aparecem, eles passarão por uma fase de rápida expansão.
- Uma vez que as células atingem 80-90% de confluência, cerca de 9-15 dias após o plaqueamento, dissociam-se e passagem das células (15,000-18,000 células / cm2) em 04/02 poços de placa de 24 poços para uma maior expansão. Marcar como passagem célula 1 (P1).
- Caracterizar as células de urina para obter as especificações de linhagem por meio da análise de citometria de fluxo, immunohistochemcoloração idêntica ou através da reacção em cadeia da polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR).
- Reprogramar células de urina isoladas (seção 4) ou congelá-los para baixo em Congelamento Medium (DMEM suplementado com 10% de soro e 10% DMSO) para cryostorage longo prazo.
4. Urina reprogramação celular Usando Sendai Virus
NOTA: O tratamento adequado eo uso de EPI (equipamento de proteção individual) é recomendada durante a manipulação dos agentes de transfecção. Execute as seguintes etapas em condições estéreis em um BSL2 Gabinete de Segurança Biológica. O descarte adequado de transfecção de células de agente e / ou transfectadas é recomendado para evitar o risco de riscos ambientais e de saúde. Para urina reprogramação celular, use um Sendai Reprogramação Kit com modificações para protocolo dependente de alimentador do fabricante, conforme detalhado abaixo.
- Para garantir alta eficiência reprogramação utilizando o vírus Sendai, uso de passagens 1-5 de células de urina que são rápidosly dividindo. Se as células não se replicam bem ou se tornam senescentes, descartá-los, pois não vai reprogramar eficiente.
- Semente de 60.000 células por poço em dois poços de uma placa de 6 poços. Marcar como Dia -2. Ajustar densidade de sementeira de células (5 x 04-09 outubro 4 x 10 células por cavidade), conforme necessário para atingir 80-90% de confluência por Dia 0.
- No Dia 0 (48 h após o plaqueamento das células), preparar os vectores de reprogramação Sendai (SEV), contendo cada um dos quatro factores OSKM. Adicionar a cada um dos vectores de 1 ml de meio pré-aquecido a UPC. Utilize uma MOI de 1-1,5 (5-7,5 x 10 5 CIU), que é suficiente para as células de urina reprogramação. Aspirar o meio e adiciona-se lentamente a 1 ml UPC + SeV para um poço de células de urina. Utilize a segunda bem como o controlo negativo transdução.
- No dia 1, substituir o meio UPC + SeV com meio UPC fresco. Alguns morte celular é observada após 24 h devido a citotoxicidade virai.
- Dependendo da eficiência do clon reprogramadoe formações e a morfologia compacta, ficar mudando o meio dia até dia 6 ou 7.
- Um dia antes da dissociação de células transduzidas (5 ou 6 dias), para preparar as placas alimentadoras MEF por plaqueamento de mitomicina-C (10 ug / ml durante 3 horas) MEFs-tratados com uma densidade de 5 x 10 4 células / cm 2, em 0,1 % de gelatina revestidas placas de 100 mm 2 de cultura.
- No dia seguinte (dia 6 ou 7), dissociar as células com tripsina a 0,25%, ressuspender as células em meio de UPC e placa 5 x outubro 4-2 x 10 5 células / 100 mm 2 MEF alimentador de placas.
- No dia seguinte, mudar para o meio-tronco embrionárias humanas e mudar o meio de todos os dias. Observe as células em um microscópio para monitorar as células transformadas.
NOTA: As células formam agregados clonais com morfologia característica de paralelepípedos e ter maior núcleo à relação citoplasmática (12-18 dias após a transdução). - Dentro de duas a três semanas após a transdução, escolher colônias e transferir para novas placas para clonexpansão ai.
- Realização da coloração de células vivas para a selecção de clones de IPSC por incubação das células com anticorpo TRA-1-81 durante 1 hora a 37 ° C na incubadora de CO2, seguido de coloração com corante fluorescente contador específica do anticorpo secundário conjugado durante 1 hora a 37 ° C na incubadora de CO 2.
- Use a 26 G 1½ polegada agulha para cross-chocar os maiores TRA-1-81 clones IPSC positivos em pequenos pedaços de tamanhos iguais (4-6 peças por clone).
- Use uma pipeta estéril-ponta para pegar e transferência 10-20 peças cross-eclodidos de vários clones em cada poço de Matrigel (10 g / cm 2) -Revestido placa de 24 poços com meio-tronco embrionárias humanas.
NOTA: As partes de um único clone banhado individualmente em um único bem não expandir ou manter pluripotência. - Mudar a forma de hES iPSC 24-48 h, depois os clones reprogramadas estão ligados à superfície de Matrigel.
- Durante a manutenção em placas Matrigel-revestidos, manualmente SCRAPE-off quaisquer células diferenciadas ou contaminantes células alimentadoras MEF utilizando uma pipeta-ponta para enriquecer iPSC (MD-IPSC) clones distróficos totalmente reprogramadas e pluripotentes.
- Depois de clones individuais alcançaram ~ 100 mm de tamanho, expandir os clones dissociando com EDTA 0,48 mM (ácido etilenodiaminotetracético) solução para 3 min e plaqueamento agregados de células pequenas de MD-iPSCs suspensas em meio iPSC (suplementado com 5? M Y27632, Rho Kinase inibidor ) em matrigel fresco (10? g / cm 2) revestido placa de 12 poços. Alterar médio iPSC diária.
- Reprogramação completa de cada clone pode ser determinado tanto por análise de genes OSKM e coloração imuno-histoquímica de marcadores de pluripotência (OCT3 / 4 e TRA-1-81) a expressão do gene. Uma avaliação rigorosa do potencial de pluripotência deve ser empregada para confirmar linhas de IPSC totalmente reprogramadas podem se diferenciar em três camadas germinativas. Isto pode ser realizado tanto por corpo embrióides (EB), ensaio de formação e diferenciação ou um terensaio de formação de atoma.
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Representative Results
A maioria das células progenitoras isoladas a partir de urina humana são positivos para progenitoras e pericitos uroepiteliais marcadores tais como CD44, CD73, CD146 e (97,37%, 97,09% e 97,3%, respectivamente; Figura 1A e 1B). Estas células também expressaram outros marcadores mesenquimais, tais como alfa-actina do músculo liso e vimentina (Figura 1B). A análise por RT-PCR proporciona a evidência de uma população mista de células nas culturas em que há expressão fraca de citoqueratina-7 (CK-7) e Uroplakin (SE) -Ia & -IIIa, marcadores de linhagem uroepiteliais (Figura 1C).
Os passos de reprogramação são resumidos por esquemática na Figura 2A. Imagens representativas demonstrar a morfologia das células durante a diferentes pontos de tempo ao longo do protocolo (Figura 2B). As células de urina transformar de alongado, digite células II (dia 0) em um padrão de calçada (dia 4) durante a reprogramação. By Dia 12, clones pluripotentes típicas (IPSC) são vistos e são capazes de manter sua morfologia pluripotentes sob condições de alimentação livres (iPSC-P2). A coloração celular Vivo para TRA-1-81 identifica clones reprogramadas (Figura 2C).
Para confirmar a geração de clones de vector e pluripotentes transgene livre, RT-PCR é realizada utilizando iniciadores contra o genoma viral SeV e cada um dos factores exógenos OSKM. A sobre-regulação dos factores endógenos de reprogramação também pode ser confirmada neste passo. A expressão do gene exógeno já não é detectada por passagem-13, mas a sobre-regulação dos factores endógenos é visto (Figura 3A). Coloração de imunofluorescência confirma a expressão do marcador pluripotência em iPSCs (OCT3 / 4 e TRA-1-81; Figura 3B). A expressão do gene endógeno de reprogramação visto em células de urina pode conduzir estas células para reprogramar a eficiências mais elevadas 1, em comparação com outras fontes de células somáticas. As expresmento do gene da distrofina e a proteína é verificada por imunofluorescência, western blot (WB) e análise por RT-PCR (Figura 3C-E). Coloração de imunofluorescência de UCs tipo selvagem e iPSCs para distrofina demonstrar localização nuclear evidente 11 em iPSCs, mas muito poucas UCs expressa positivo (Figura 3C). Para verificar a expressão de distrofina nas células, análise de imunotransf erência para distrofina revelou que a isoforma distrofina ubíqua (DP71) é a isoforma predominante produzido em iPSCs de tipo selvagem, enquanto iPSCs distróficos falta a expressão do gene da distrofina foi indetectável expressão DP71 (Figura 3D). As mutações exão de deleção da distrofina pode ser confirmado nos iPSCs distróficos usando primers específicos de acompanhamento dos exons excluídos. Sem amplificação por PCR é detectada nas iPSCs distróficos enquanto iPSCs tipo selvagem demonstrar amplificação de distrofina transcrição (Figura 3E).
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Figura 1. Caracterização de células isoladas de urina (UCs) mostra progenitor uroepiteliais, mesenquimal e linhagens de músculo liso. (A) citometria de fluxo e UCs sondado com anticorpos conjugados contra marcadores uroepiteliais e pericyte CD44, CD73 e CD146. (B) coloração de imunofluorescência de UCs com CD44, αSMA e Vimentin. (C) o perfil de expressão gênica UCs mostrar fraca expressão da CK-7 e UP-Ia e UP-IIIa, em comparação com amostras de controlo positivo, enquanto a expressão do gene da actina de músculo liso (αSMA) é comparável ao controle positivo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. A reprogramação das UC para gerar iPSCs. (A) esquema do cronograma de reprogramação. (B) As imagens que representam diferentes morfologias de UCs durante a transdução SeV, no dia 0 (transdução SeV), Dia 4 (transição morfológica), Dia 12 (clones pluripotentes emergente sobre MEFs) e o clone iPSC característica em condições de livre-feeder (IPSC -P2 em Matrigel). (C) imagens de células vivas para TRA-1-81 para identificar colónias pluripotentes no dia 17. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Geração de Viral Genoma e Transgene gratuito iPSCs. (A)Análise da expressão do gene mostra a presença do genoma de SeV e transgenes OSKM na passagem 2 (IPSC-P2) e o seu desaparecimento por passagem 13 (IPSC-P13), enquanto que a expressão do gene endógeno persiste durante toda. (B) imagens de contraste de fase e de imunofluorescência comparando OCT3 / 4 e TRA-1-81 coloração em UCs e iPSCs resultante. (C) A distrofina é detectado por imunofluorescência, de tipo selvagem iPSCs comparação com o tipo selvagem UC, e (D) a isoforma específica distrofina (DP71) pode ser confirmada por WB. Análise (E) RT-PCR é usado para confirmar a exclusão da distrofina exão específico nos iPSCs distróficos comparação com o tipo selvagem UCs e iPSCs. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do Reagente / Material / Equipamento | Companhia | Número de Catálogo | Comentários |
| GAPDH-Forward Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | GTGGACCTGACCTGCCGTCT |
| GAPDH-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT |
| CK7-Forward Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | TGGTGCTGAAGAAGGATGTG |
| CK7-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | CACGCTGGTTCTTGATGTTG |
| Up-Ia-Forward Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | ACGTCCTACACCCACCGTGA |
| Up-Ia-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | ACCCCACGTGTAGCTGTCGAT |
| Up-IIIa-Forward Primer | IDT Inc. | Seq given nos comentários | ACAAACAGAGGGTGGGAGGA CAG |
| Up-IIIa-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | AGAAGGGCAGGGAGCCCAGG |
| αSMA-Forward Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | ACCCACAATGTCCCCATCTA |
| αSMA-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | TGATCCACATCTGCTGGAAG |
| OCT3 / 4 (exógena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Vida Tech-Cytotune | CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG |
| OCT3 / 4 (exógena) Primer -Reverse * | IDT Inc. | * Kit Vida Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Sox2 (exógena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Vida Tech-Cytotune | ATGCACCGCTACGACGTGAG CGC |
| Sox2 (exógena) -Reverse Primer * | IDT Inc. | * Kit Vida Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| KLF4 (exógena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Vida Tech-Cytotune | TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| KLF4 (exógena) -Reverse Primer * | IDT Inc. | * Kit Vida Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| cMyc (exógena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Vida Tech-Cytotune | TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| cMyc (exógena) -Reverse Primer * | IDT Inc. | * Kit Vida Tech-Cytotune | TCCACATACAGTCCTGGATGAT GATG |
| SeV (exógena) -Forward Primer * | IDT Inc. | * Kit Vida Tech-Cytotune | GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| SeV (exógena) -Reverse Primer * | IDT Inc. | * Kit Vida Tech-Cytotune | ACCAGACAAGAGTTTAAGAGA TATGTATC |
| OCT3 / 4 (endógena) -Forward Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | CAGTGCCCGAAACCCACAC |
| OCT3 / 4 (endógena) -Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | GGAGACCCAGCAGCCTCAAA |
| Sox2 (endógena) -Forward Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | CAAGATGCACAACTCGGAGA |
| Sox2 (endógena) -Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | GTTCATGTGCGCGTAACTGT |
| Distrofina-Forward Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | GGCAAAAACTGCCAAAAGAA |
| Distrofina-Reverse Primer | IDT Inc. | Seq dado nos comentários | GACCTGCCAGTGGAGGATTA |
Tabela 1. Lista de Primer sequências.
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Discussion
Modelando doenças cardiovasculares usando iPSCs está se tornando uma abordagem comum para compreender a contribuição genética 4-6. Algumas dificuldades imprevistas de obtenção de amostras de células de pacientes, especialmente crianças pequenas, pode ser evitada, oferecendo a opção de uma abordagem não-invasiva, como uma coleta de urina. Nessa população jovem paciente, muitas vezes é difícil coletar um volume de urina suficiente para produzir células de urina suficiente para a reprogramação. Treinando os pacientes jovens a beber líquidos 30 min antes da coleta de urina aumenta o sucesso de isolamento de células urina. No entanto, coletas de urina de repetição pode ser necessário nesta população. Temos combinada e adaptada dois protocolos diferentes de 3,7, a fim de optimizar o isolamento e cultura de UC de pacientes com distrofia muscular.
As células estaminais pluripotentes induzida foram geradas a partir de ambos os fibroblastos da pele e células de urina de distrofia muscular patien1,2 ts. No entanto, ambos os protocolos de reprogramação invocado lentivírus para introduzir os fatores de reprogramação nas células somáticas. Esta integração método de entrega do vírus pode ser problemático se o transgene integra aleatoriamente no genoma do hospedeiro e causa ou reactivação do transgene ou mutagénese (revistos em 8). Portanto, estas técnicas melhoradas utilizando o vírus de Sendai para transduzir os transgenes OSKM para as células de urina de uma forma não-integrantes 9.
Este método usando vírus Sendai para reprogramar UCs oferece a vantagem de uma abordagem não-integração com uma maior eficiência de transdução de 9,10. Células de urina de pacientes com distrofia muscular são reprogramadas dentro de 2-3 semanas após a transdução. Estes cinética reprogramação são comparáveis a reprogramação UC usando transdução lentiviral 1. Apesar de este protocolo pode ser escalado para estabelecer método livre de alimentador para a urina reprogramação celular, sejaing um método eficiente utilizando transdução de Sendai-vírus de células de urina isoladas de pacientes com distrofia muscular. Este método baseia-se na MEFs descrito como uma camada de alimentador, a fim de confirmar os pluripotentes MD clone antes da transferência para condições alimentador livres na passagem 2.
A distribuição nuclear da isoforma DP71 da proteína distrofina tem uma longa tradição em diferentes modelos celulares fase embrionária 11,12. Esta expressão ubíqua de DP71 na fração de matriz nuclear de células progenitoras de palco / embrionário inicial sugere seu papel na arquitetura nuclear e celular ciclo regra 12. Nossos iPSCs tipo selvagem reprogramadas expressar DP71; no entanto, a sua ausência em iPSCs distróficos não inibe a reprogramação ou potencial de células pluripotentes distróficos. Em conclusão, as mutações genéticas distrófica são conservados em iPSCs reprogramadas; tornando-se uma ferramenta eficiente para modelar cardiomiopatia distrófica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Holo-transferrin from human | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - labeled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - labeled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - labeled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
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- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
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