Abstract
Cardiomyopathie dystrophique est une conséquence mal compris de la dystrophie musculaire. Générer des cellules souches pluripotentes induites (CISP) provenant de patients atteints de dystrophie musculaire est une source précieuse cellulaire pour des systèmes de modèles in vitro de la maladie à l'intérieur et peut être utilisé pour des études de criblage de médicaments. Les cellules d'urine provenant de patients ont été utilisés dans une reprogrammation réussie dans les cellules souches pluripotentes induites afin de modéliser une cardiomyopathie dystrophique. Répondre aux préoccupations de l'intégration des systèmes de vecteurs de sécurité, nous présentons un protocole utilisant un vecteur de virus Sendai non-intégration pour la transduction de Yamanaka facteurs dans les cellules d'urine prélevés chez des patients atteints de dystrophie musculaire. Ce protocole génère entièrement reprogrammé clones dans les 2-3 semaines. Les cellules pluripotentes sont indemne de vecteurs par passage-13. Ces CSPi dystrophiques peuvent être différenciées en cardiomyocytes et utilisés soit pour étudier les mécanismes de la maladie ou pour le dépistage de la drogue.
Introduction
La cardiomyopathie est la deuxième principale cause de décès chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne et de Becker (MD). Bien que des mutations dans le gène de la dystrophine liée à l'X se produisent dans une: 3500 naissances masculines, on sait très peu sur les événements moléculaires et cellulaires conduisant à une dégradation progressive du muscle cardiaque. cellules souches pluripotentes humaines induites provenant de patients atteints de dystrophie musculaire ont émergé comme un nouvel outil pour étudier les mécanismes de la maladie sous-jacents et à utiliser pour le dépistage de drogues 1,2.
Le malaise prévue de biopsies de la peau ou des échantillons de sang peut dissuader les jeunes patients et / ou leurs tuteurs de donner son consentement pour la participation à l'étude. Les échantillons d'urine sont une source non invasive de cellules somatiques qui sont amendable des procédés de reprogrammation. Nous avons récemment montré que les cellules d'urine prélevés de patients atteints de dystrophie musculaire peuvent être cultivées et efficacement reprogrammé en utilisant CSPi transduction rétrovirale avec les facteurs Yamanaka (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, et c-Myc; OSKM) 1. L'inconvénient de délivrance de gène rétroviral est l'intégration aléatoire de gènes de reprogrammation dans les chromosomes de l'hôte. Pour surmonter cette limitation, nous avons utilisé le virus Sendai non-intégration pour la reprogrammation des cellules d'urine.
Ce protocole détaille le virus Sendai reprogrammation des cellules isolées urine de patients atteints de dystrophie musculaire qui peut ensuite être différenciées en cardiomyocytes ou d'autres types de cellules pour une étude plus approfondie. Ce protocole peut également être adapté à d'autres maladies spécifiques des patients.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Les patients et / ou leurs tuteurs doivent donner un consentement éclairé à participer à un Institutional Review Board étude approuvée.
1. Tampons et préparations des médias
- tampon de lavage: Pour préparer 100 ml de tampon de lavage, ajouter 1 ml de stylo 100x / Solution streptococcique (100 U / ml de pénicilline + 100 pg / ml de streptomycine) à 99 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Progenitor urinaire cellulaire (UPC) Medium: Pour préparer le milieu UPC, mélanger des volumes égaux de kératinocytes Free Serum (KSF) Medium + de cellules souches moyen.
- KSF Medium: Pour préparer le milieu de kératinocytes, ajouter 5 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF), 50 ng / ml d'extrait pituitaire bovin (BPE), 30 ng / ml de toxine cholérique, et la solution pen / strep (100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine) à 500 ml de milieu KSF.
- Moyen de cellules souches: Ajouter trois quarts de DMEM avec un quart des médias Ham-F12 et de compléter avec 10% de FBS, 0,4 pg / ml hydrocortisone, 0,1nM toxine du choléra, 5 ng / ml d'insuline, 1,8 x 10 -4 M d'adénine, 5 ug / ml de transferrine, 2 x 10 -9 M triiodo thyronine, 10 ng / ml d'EGF, et pen / strep solution.
- hES moyenne: 20% Ajouter remplacement KO-sérum (M-SR), 1x MEM acides aminés non essentiels, 2 mM de L-glutamine, 100 uM de β-mercaptoéthanol, 20 ng / ml de bFGF et pen / strep à 400 ml de DMEM / F12.
2. Prélèvement d'échantillons d'urine
- Demander aux patients de boire des liquides 30 min avant la collecte d'urine pour se assurer qu'une quantité adéquate (~ 30-40 ml) d'urine peut être collectée.
- Donner aux patients et / ou leurs tuteurs un kit de collecte d'urine contenant les éléments suivants: (1) des instructions écrites sur la façon d'obtenir l'échantillon captures d'urine stérile ou propre, (2) toilettes anti-bactériennes humides, et (3) un 100 ml stérile collecte de spécimens tasse. Demander aux patients pour recueillir l'échantillon.
- Placer immédiatement les échantillons d'urine sur la glace et transfert à l'laboraTory dans une glacière. Traiter l'urine pour l'isolement cellulaire immédiatement. Si un retard est inévitable, stocker les échantillons sur la glace jusqu'à 4 heures avec une perte minimale de la viabilité cellulaire.
3. Isolement et expansion des cellules d'urine
REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes dans des conditions stériles dans un Cabinet de sécurité biologique BSL2.
- L'aide de pipettes stériles, les échantillons d'urine pour le transfert stériles tubes de centrifugation de 50 ml. Centrifuger à 400 g pendant 10 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant laissant 1 ml dans le tube; attention à ne pas perturber le culot cellulaire.
- Remettre en suspension et de combiner les pellets à partir de tubes multiples dans 7 ml de tampon de lavage et répéter centrifugation à 400 g pendant 10 min à température ambiante.
- Aspirer soigneusement le surnageant, en laissant le culot de cellules et de ~ 0,2 à 0,5 ml de surnageant. Remettre en suspension dans 2-3 ml de Progenitor urinaire cellulaire (UPC) à moyen et à transférer la suspension dans 4-6 puits d'une nonplaque de 24 puits revêtue.
- Après 72 h, compléter la culture avec 0,5 ml de milieu frais UPC par puits et changer moyenne tous les 2-3 jours après. Les érythrocytes et des cellules squameuses qui ne se attachent pas à la plaque seront enlevés avec les moyennes changements.
- Surveiller la culture après 4-6 jours.
Remarque: Les petits 2-4 colonies de cellules vont commencer à apparaître. Les cellules seront arrondies ou allongées qui représentent de type I ou II de l'épithélium rénal (RE) des cellules respectivement 3. - Changer le support tous les 2-3 jours car une fois les cellules apparaissent, ils seront soumis à une phase d'expansion rapide.
- Une fois que les cellules atteignent 80-90% de confluence, autour de 9-15 jours après placage, et le passage dissocier les cellules (15,000-18,000 cellules / cm 2) sur 2-4 puits de plaque à 24 puits pour poursuivre son expansion. Marquer comme ce passage d'une cellule (P1).
- Caractériser les cellules d'urine pour les spécifications de la lignée à travers l'analyse de cytométrie en flux, immunohistochemcoloration ical ou par réaction en chaîne de polymérase-transcriptase inverse (RT-PCR).
- Reprogrammer des cellules isolées d'urine (section 4) ou congelez-les dans un milieu de congélation (DMEM complété avec 10% de sérum et 10% de DMSO) pour cryoconservation à long terme.
4. urine cellulaire Reprogrammation Utilisation Sendai Virus
NOTE: La manipulation et l'utilisation des EPI (équipements de protection individuelle) est recommandée lors de la manipulation des agents de transfection. Effectuez les étapes suivantes dans des conditions stériles dans un Cabinet de sécurité biologique BSL2. L'élimination appropriée des transfection de cellules de l'agent et / ou transfectées est recommandé d'éviter tout risque de risques environnementaux et sanitaires. Pour l'urine cellules reprogrammation, utiliser une reprogrammation Kit Sendai avec des modifications du protocole d'alimentation dépendant du fabricant tel que détaillé ci-dessous.
- Pour assurer la reprogrammation de haute efficacité utilisant le virus Sendai, l'utilisation des passages 1-5 de cellules d'urine qui sont rapideLy divisant. Si les cellules ne se répliquent pas bien ou deviennent sénescentes, jetez-les car ils ne seront pas reprogrammer efficacement.
- Seed 60 000 cellules par puits dans deux puits d'une plaque à 6 puits. Marquer ce que la Journée -2. Régler la densité d'ensemencement des cellules (5 x oct 4 à 9 x 10 4 cellules par puits) comme nécessaire pour atteindre 80 à 90% de confluence au jour 0.
- Le jour 0 (48 h après étalement des cellules), préparer les vecteurs de reprogrammation Sendai (DVE) contenant chacun des quatre facteurs de OSKM. Ajouter chacun des vecteurs à 1 ml de milieu préchauffé UPC. Utiliser une MOI de 1 à 1,5 (de 5 à 7,5 x 10 5 CIU), qui est suffisante pour la reprogrammation des cellules d'urine. Aspirer le milieu et ajouter lentement 1 ml de la UPC + SeV à une bien des cellules d'urine. Utilisez la seconde ainsi que la transduction contrôle négatif.
- Le Jour 1, remplacer le milieu UPC + SeV avec le milieu UPC frais. Certains mort cellulaire est observée après 24 h en raison de la cytotoxicité virale.
- Selon efficacité de Clon reprogramméformations e et la morphologie compacte, ne cessent de changer le milieu tous les jours jusqu'au jour 6 ou 7.
- Un jour avant la dissociation des cellules transduites (jour 5 ou 6), préparer des plaques d'alimentation MEF par placage mitomycine C (10 ug / ml pendant 3 heures)-MEF traitées à une densité de 5 x 10 4 cellules / cm 2, sur 0,1 % de gélatine enduite 100 mm 2 plats de culture.
- Le lendemain (jour 6 ou 7), dissocier les cellules avec 0,25% de trypsine, remettre en suspension les cellules dans du milieu UPC et de la plaque 5 x octobre 4-2 x 10 5 cellules / mm 2 100 MEF plaque d'alimentation.
- Le lendemain, passer à moyen hES et de changer le milieu tous les jours. Respecter les cellules sous un microscope pour surveiller cellules transformées.
REMARQUE: Les cellules forment des agrégats clonales et une morphologie caractéristique pavée et ayant noyau supérieur rapport cytoplasmique (12-18 jours après transduction). - Dans les deux à trois semaines après la transduction, prélever des colonies et de les transférer sur de nouvelles plaques pour clonextension al.
- Effectuer la coloration de cellules vivantes pour la sélection de clones iPSC en incubant des cellules avec TRA-1-81 anticorps pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur CO 2 suivie d'une contre-coloration avec un colorant fluorescent spécifique conjugué anticorps secondaire pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur CO 2.
- Utilisez un G 1½ aiguille 26 pouces de contre-éclore les grands TRA-1-81 clones positifs iPSC en petits morceaux de taille égale (4-6 pièces par clone).
- Utiliser une pipette à pointe stérile pour ramasser et le transfert de 10 à 20 pièces hachurées de multiples clones dans chaque puits de Matrigel (10 ug / cm 2) doté d'un revêtement plaque à 24 puits avec du milieu hES.
REMARQUE: Pièces d'un clone unique plaqué individuellement dans un seul puits ne étendre ou de maintenir la pluripotence. - Changer de hES à moyen iPSC 24-48 heures après les clones reprogrammées sont attachés à la surface Matrigel.
- Lors de l'entretien sur des plaques enduites de Matrigel, SCRA manuellementpe-off des cellules différenciées ou contaminantes cellules nourricières MEF aide d'une pipette à pointe pour enrichir iPSC (MD-iPSC) clones dystrophiques entièrement reprogrammées et pluripotentes.
- Après clones individuels ont atteint ~ 100 taille um, d'élargir les clones en dissociant avec mM d'EDTA 0,48 (acide éthylènediaminetétraacétique) solution pendant 3 min et le placage de petits agrégats de cellules de MD-iPSCs en suspension dans du milieu iPSC (additionné de 5 uM Y27632, la Rho kinase inhibiteur ) sur matrigel frais (10 ug / cm 2) revêtu 12 plaque bien. Changer le milieu iPSC quotidienne.
- La reprogrammation complète de chaque clone peut être déterminée à la fois par analyse d'expression génique de gènes de OSKM et la coloration immunohistochimique de marqueurs de la pluripotence (Oct3 / 4 et TRA-1-81). Une évaluation rigoureuse du potentiel de la pluripotence devrait être utilisée pour confirmer lignes iPSC entièrement reprogrammées peuvent se différencier en trois feuillets embryonnaires. Ceci peut être réalisé soit en corps embryoïdes (EB) la formation et de la différenciation ou d'un dosage teratoma formation dosage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La plupart des cellules souches isolées à partir d'urine humaine sont positives pour les marqueurs progénitrices et péricytes uroépithéliales tels que CD44, CD73, et CD146 (97,37%, 97,09% et 97,3%, respectivement: la figure 1A et 1B). Ces cellules ont également exprimé d'autres marqueurs mésenchymateuses tels que l'alpha-actine musculaire lisse et vimentine (figure 1B). Analyse RT-PCR donne la preuve d'une population mixte de cellules dans les cultures en ce qu 'une faible expression de la cytokératine-7 (CK-7) et Uroplakin (UP) -la & -IIIa, des marqueurs de la lignée uroépithéliales (figure 1C).
Les étapes de reprogrammation sont résumés par schématique sur la figure 2A. Des images représentatives montrent la morphologie des cellules au cours de différents moments tout au long du protocole (figure 2B). Les cellules d'urine de transformer allongée, les cellules de type II (Jour 0) dans un modèle pavée (Jour 4) lors de la reprogrammation. BJour 12, y clones pluripotentes (iPSC) typiques sont vus et sont capables de maintenir leur morphologie pluripotentes dans des conditions libres de desserte (iPSC-P2). Coloration de cellules vivantes pour TRA-1-81 identifie clones reprogrammées (figure 2C).
Pour confirmer la production de vecteur et libre transgènes clones pluripotentes, une RT-PCR est réalisée en utilisant des amorces contre le génome viral SeV et de chacun des facteurs de OSKM exogènes. La régulation à la hausse des facteurs de reprogrammation endogènes peut également être confirmé à cette étape. L'expression du gène exogène ne est plus détectée par le passage 13, mais la régulation à la hausse de facteurs endogènes est considéré (figure 3A). Coloration immunofluorescence confirme l'expression des marqueurs de pluripotence sur CSPi (Oct3 / 4 et TRA-1-81; figure 3B). L'expression des gènes de reprogrammation endogène observée dans les cellules d'urine peut conduire ces cellules de reprogrammer à des rendements plus élevés 1, par rapport à d'autres sources de cellules somatiques. Les expression de gène de la dystrophine et la protéine est vérifiée par immunofluorescence, Western blot (WB) et les analyses par RT-PCR (Figure 3C-E). La coloration par immunofluorescence des UC de type sauvage et CSPi pour la dystrophine démontrer localisation nucléaire évidente 11 dans CSPi, mais très peu d'UC exprimé positive (figure 3C). Pour vérifier l'expression de la dystrophine dans les cellules, une analyse par immunotransfert pour la dystrophine a révélé que l'isoforme de la dystrophine ubiquitaire (Dp71) est l'isoforme prédominante produite dans iPSCs de type sauvage, tandis que iPSCs dystrophiques manque l'expression du gène de la dystrophine est expression de Dp71 indétectables (Figure 3D). Les mutations de délétion de l'exon dystrophine peuvent être confirmées dans les CSPi dystrophiques en utilisant des amorces spécifiques flanquant les exons supprimés. Aucune amplification PCR est détectée dans les CSPi dystrophiques alors CSPi de type sauvage montrent transcription de la dystrophine amplification (figure 3E).
within-page = "always"> 
Figure 1. caractérisation des cellules isolées d'urine (SCU) montre progéniteur uroépithéliales, mésenchymateuses et lignages musculaires lisses. (A) Débit analyse cytométrique de la NGC sondé avec des anticorps conjugués contre marqueurs uroépithéliales et péricytes CD44, CD73 et CD146. (B) La coloration par immunofluorescence de la NGC avec CD44, αSMA et vimentine. (C) le profil d'expression génique de la NGC montrent une faible expression de la CK-7 et UP-Ia et UP-IIIa par rapport à des échantillons témoins positifs tandis que l'expression du gène de l'alpha-actine musculaire lisse (αSMA) est comparable au contrôle positif. Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
télécharger / 52032 / 52032fig2highres.jpg "width =" 700px "/>
Figure 2. Reprogrammation de l'UC pour générer CSPi. (A) aperçu schématique de la chronologie de reprogrammation. (B) Images représentant différentes morphologies de la NGC pendant la transduction SEV, au jour 0 (SeV transduction), Jour 4 (de transition morphologique), Jour 12 (clones pluripotentes émergents sur MEF) et le clone caractéristique iPSC dans des conditions sans cellules nourricières (iPSC -P2 sur Matrigel). (C) d'imagerie cellulaire Live pour TRA-1-81 pour identifier colonies pluripotentes au Jour 17. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Génération de génome viral et Transgene CSPi gratuit. (A)analyse de l'expression génique montre la présence du génome du SeV transgènes et OSKM passage à deux (CISP-P2) et par leur disparition passage 13 (CISP-P13), tandis que l'expression du gène endogène persiste tout au long. (B) des images à contraste de phase et immunofluorescence comparant Oct3 / 4 et TRA-1-81 coloration dans UCS et CSPi qui en résultent. (C) La dystrophine est détectée par immunofluorescence dans CSPi de type sauvage par rapport à de type sauvage UC, et (D) de la dystrophine isoforme spécifique (Dp71) peut être confirmée par la BM. Analyse (E) RT-PCR est utilisée pour confirmer la suppression de la dystrophine exon spécifique dans les CSPi dystrophiques par rapport au type sauvage UCS et CSPi. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Nom de réactif / Matériel / Equipement | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Primer GAPDH-Forward | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | GTGGACCTGACCTGCCGTCT |
| Primer GAPDH inversée | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT |
| Primer CK7-Forward | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | TGGTGCTGAAGAAGGATGTG |
| Primer CK7 inversée | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | CACGCTGGTTCTTGATGTTG |
| Up-Ia-Forward Primer | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | ACGTCCTACACCCACCGTGA |
| Up-Ia-amorce inverse | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | ACCCCACGTGTAGCTGTCGAT |
| Up-IIIa-Forward Primer | IDT Inc. | Seq gompte tenu dans les commentaires | ACAAACAGAGGGTGGGAGGA CAG |
| Up-IIIa-amorce inverse | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | AGAAGGGCAGGGAGCCCAGG |
| Primer αSMA-Forward | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | ACCCACAATGTCCCCATCTA |
| αSMA-amorce inverse | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | TGATCCACATCTGCTGGAAG |
| / 4 (exogène) Primer -Forward de Oct3 * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG |
| Oct3 / 4 (exogène) Primer Reverse * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Sox2 (exogène) Primer -Forward * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | ATGCACCGCTACGACGTGAG CCG |
| Sox2 (exogène) -ReversPrimer e * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| Klf4 (exogène) Primer -Forward * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Klf4 (exogène) Primer Reverse * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | AATGTATCGAAGGTGCTCAA |
| cMyc (exogène) Primer -Forward * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| cMyc (exogène) Primer Reverse * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | TCCACATACAGTCCTGGATGAT GATG |
| SEV (exogène) Primer -Forward * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| SEV (exogène) Primer Reverse * | IDT Inc. | * Kit Life Tech-Cytotune | UnCCAGACAAGAGTTTAAGAGA TATGTATC |
| Oct3 / 4 (endogène) Primer -Forward | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | CAGTGCCCGAAACCCACAC |
| Oct3 / 4 (endogène) Primer -Reverse | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | GGAGACCCAGCAGCCTCAAA |
| Sox2 (endogène) Primer -Forward | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | CAAGATGCACAACTCGGAGA |
| Sox2 (endogène) Primer -Reverse | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | GTTCATGTGCGCGTAACTGT |
| Primer dystrophine-Forward | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | GGCAAAAACTGCCAAAAGAA |
| Primer dystrophine inversée | IDT Inc. | Seq donné dans les commentaires | GACCTGCCAGTGGAGGATTA |
Tableau 1. Liste des PriSéquences mer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modélisation des maladies cardiovasculaires à l'aide CSPi devient une approche commune pour comprendre la contribution génétique 4-6. Certaines difficultés imprévues d'obtenir des échantillons de cellules de patients, en particulier les jeunes enfants, peuvent être évités en offrant la possibilité d'une approche non invasive comme une collection d'urine. Dans cette jeune population de patients, il est souvent difficile de recueillir un volume d'urine suffisante pour produire des cellules d'urine assez pour la reprogrammation. Coaching des jeunes patients de boire des liquides 30 min avant la collecte de l'urine améliore le succès de l'isolement cellulaire d'urine. Toutefois, les collections d'urine répétés peuvent se imposer dans cette population. Nous avons combiné et deux protocoles différents adaptés à 3,7, afin d'optimiser l'isolement et la culture de l'UC à partir de patients atteints de dystrophie musculaire.
Les cellules souches pluripotentes induites ont été générés à partir de soit des fibroblastes cutanés ou des cellules d'urine provenant de la dystrophie musculaire patients 1,2. Toutefois, les deux protocoles de reprogrammation invoqués lentivirus pour introduire les facteurs de reprogrammation dans les cellules somatiques. Ce mode de livraison du virus intégration peut être problématique si le transgène intègre au hasard dans le génome de l'hôte et provoque la réactivation soit transgène ou mutagenèse (revue dans 8). Par conséquent, nous avons amélioré ces techniques en utilisant le virus Sendai pour la transduction de transgènes dans les cellules OSKM d'urine d'une manière non-intégrant 9.
Cette méthode utilisant le virus Sendai à reprogrammer CU offre l'avantage d'une approche non-intégration avec une efficacité de transduction plus 9,10. cellules urine prélevés de patients atteints de dystrophie musculaire sont reprogrammés dans les 2-3 semaines post-transduction. Ces cinétiques de reprogrammation sont comparables à la reprogrammation en utilisant UC transduction lentiviral 1. Bien que ce protocole peut être adapté à établir des liaisons de méthode libre pour l'urine cellules reprogrammation, êtrement une méthode efficace en utilisant Sendai-virus transduction des cellules isolées à partir de l'urine patients atteints de dystrophie musculaire. Cette méthode se appuie sur MEF décrit comme un chargeur-couche afin d'établir pleinement le pluripotentes MD clone avant le transfert conditions sur Chargeur-libres au passage 2.
La distribution nucléaire de l'isoforme Dp71 de la protéine dystrophine est établi depuis longtemps dans différents modèles cellulaires de stade embryonnaire 11,12. Cette expression omniprésente de Dp71 dans la fraction de la matrice nucléaire de cellules progénitrices début embryonnaire / scène suggère leur rôle dans l'architecture nucléaire et la régulation du cycle cellulaire 12. Nos CSPi de type sauvage reprogrammées expriment Dp71; Cependant, son absence dans CSPi dystrophiques ne inhibe pas la reprogrammation ou potentiel pluripotent des cellules dystrophiques. En conclusion, les mutations du gène dystrophique sont conservées dans CSPi reprogrammées; ce qui en fait un outil efficace pour modéliser cardiomyopathie dystrophique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| Holo-transferrin from human | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - labeled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 - labeled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 - labeled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
