Summary
Per analizzare i profili di espressione genica cardiaco durante lo sviluppo del cuore zebrafish, RNA totale deve essere estratto dai cuori isolati. Qui, vi presentiamo un protocollo per la raccolta funzionali / cuori che battono per una rapida dissezione manuale da embrioni di zebrafish per ottenere mRNA specifici cardiaco.
Abstract
Il cuore embrionale zebrafish è composto da poche centinaia di cellule, che rappresentano solo una piccola frazione dell'intero dell'embrione. Pertanto, per evitare che il trascrittoma cardiaco venga mascherato dal trascrittoma embrionale globale, è necessario raccogliere un numero sufficiente di cuore per ulteriori analisi. Inoltre, lo sviluppo cardiaco zebrafish procede rapidamente, raccolta cuore e metodi di estrazione di RNA devono essere veloce per garantire l'omogeneità dei campioni. Qui, vi presentiamo un protocollo dissezione manuale rapido per la raccolta funzionali / cuori che battono da embrioni di zebrafish. Questo è un presupposto essenziale per la successiva estrazione di RNA specifico cardiaco-per determinare cardiaco-specifici livelli di espressione genica per analisi trascrittomica, come ad esempio Real time PCR quantitativa (RT-qPCR). Il metodo si basa sulle proprietà adesive differenziali del cuore embrionale zebrafish rispetto ad altri tessuti; questo permette la rapida PHYSeparazione Sical di cardiaca dal tessuto extracardiache da una combinazione di fluidica perturbazione forza di taglio, filtrazione graduale e la raccolta manuale dei transgenici cuori fluorescente.
Introduction
Zebrafish (Danio rerio) è ampiamente usato in biologia dello sviluppo per studiare organogenesi in vivo per la sua veloce, trasparente e extrauterina sviluppo embrionale, combinato con dimensioni ridotte e la disponibilità di linee giornalista transgeniche con espressione tessuto-specifica di proteine fluorescenti. Questo piccolo vertebrato è particolarmente adatto per studiare lo sviluppo cuore perché l'ossigenazione del primo embrione zebrafish non si basa sul battito cardiaco e il flusso di sangue; queste caratteristiche hanno permesso la caratterizzazione di un gran numero di mutanti cardiovascolari 1,2 e il pesce zebra è ora un organismo modello ampiamente riconosciuto per lo studio delle malattie del cuore 3.
Per studiare l'espressione del gene durante lo sviluppo embrionale, le trascrizioni sono comunemente analizzati con tutto il montaggio in situ (WISH) 4, RT-qPCR 5, 6 microarrays, o generazione sequenziamento next (RNA-Seq) 7. MentreWISH consente un'analisi spazio-temporale di espressione genica nell'intero embrione, livelli di trascrizione sono solitamente valutati mediante RT-qPCR, microarrays o approcci RNA-Seq. Tuttavia, questi metodi richiedono arricchimento tessuto specifico per profili di espressione genica.
Poiché il cuore embrionale zebrafish rappresenta una piccola frazione dell'intero dell'embrione, studi trascrittoma durante lo sviluppo cardiaco richiedono un protocollo per la dissezione e arricchimento di cuori. Inoltre, per ottenere dati fisiologicamente rilevanti, è importante mantenere il tessuto cardiaco completamente funzionale fino estrazione dell'RNA. Qui, descriviamo un protocollo per isolare rapidamente fisiologicamente normale e battere i cuori di centinaia di embrioni di zebrafish per ottenere in modo efficiente campioni di RNA di alta qualità per ulteriori analisi. Il presente metodo è basato sul protocollo riportato da Burns e MacRae 2006 8. Per arricchimento del tessuto cardiaco, entrambi i metodi utilizzano una linea giornalista infarto transgenicae sfruttare le proprietà di adesione differenziale di zebrafish cuori embrionali rispetto ad altri tessuti. In breve, pipettando molti embrioni su e giù attraverso un puntale stretto, cuori sono simultaneamente rilasciati dai corpi embrionali e successivamente separati dai detriti embrionale in due fasi di filtrazione rapidi; cuori fluorescente vengono poi ordinati manualmente da residui restanti e raccolti per ulteriori elaborazioni.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali della legge tedesca e lo stato di Berlino; gestione zebrafish è stato monitorato dalle autorità locali per la protezione degli animali (LAGeSo, Berlin-Brandenburg).
1. Ottenere embrioni di zebrafish per Cuore Estrazione
- Croce zebrafish giornalista cardiaca come il Tg (myl7: EGFP) twu34 linea transgenica 9 al fine di ottenere embrioni con espressione GFP-specific cuore.
- Mantenere gli embrioni in acqua uovo a 28,5 ° C, fino alla fase embrionale desiderato 10,11. Assicurarsi che la popolazione embrione raccolto è omogeneo sia geneticamente e stadio di sviluppo per limitare le variazioni nell'espressione genica.
- Dechorionate gli embrioni manualmente.
2. Dissezione Zebrafish embrionali Hearts
NOTA: Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio. Se possibile, effettuare il lavoro di squadra: una persona analizza i cuori dal embRyos mentre un'altra persona ordina i cuori allo stereomicroscopio a fluorescenza. Questo permette la lavorazione di diverse centinaia di embrioni in poche ore.
- Trasferire circa 100 embrioni in una provetta da 1,5 ml centrifugazione. Anestetizzare gli embrioni con tricaine (0,16 mg / ml in E3 medio). Procedere volta gli embrioni sono chiaramente anestetizzati (essi non nuotano e sedimenti sul fondo del tubo, ma i loro cuori sono ancora battendo).
- Rimuovere la soluzione / E3 tricaine e lavare gli embrioni una volta con 1 ml di L-15/10% di media FBS e mantenere in ghiaccio.
NOTA: Il mezzo FBS L-15/10% è importante mantenere gli organi e le cellule in vita durante l'intera procedura di dissezione fino a quando i cuori sono stati trasferiti in RNAlater o Trizol. - Aggiungere 1 ml di L-15/10% di media FBS agli embrioni e pipetta su e giù 5-8 volte con un Round Gel Loading Suggerimento fino a quando il tuorlo è completamente distrutto. Pipetta embrioni goccia a goccia sulla superficie della soluzione, in modo che la goccia scoppio egli embrioni vengono delicatamente interrotte.
NOTA: Come con vigore e con quale frequenza gli embrioni devono essere pipettati su e giù dipende dallo stadio di sviluppo degli embrioni, cioè più pipettaggio è necessaria a stadi più avanzati (ad esempio a 56 HPF). - Per il primo lotto di embrioni sezionati, valutare l'integrità degli embrioni e la percentuale di cuore sezionato allo stereomicroscopio, dal momento che alcuni cuori possono rimanere attaccati ai embrioni se pipettati troppo delicatamente. Regolare il modo di pipettaggio per i prossimi turni di dissezione di conseguenza.
NOTA: utilizzare punte bassa ritenzione per pipette e tubi microcentrifuga per ridurre al minimo i cuori attaccare alla plastica. - Applicare il campione attraverso un filtro 100 micron collocato su un tubo da 50 ml centrifugazione; risciacquare la provetta da 1,5 ml con 1 ml di mezzo L-15/10% FBS e quindi applicare questo al filtro per minimizzare la perdita del campione (alcuni cuori potrebbero essere attaccati alle pareti del tubo). Lavare due volte il filtro con 1 ml L-15 / 10% FBS. In questa fase i cuori passano attraverso il filtro e sono raccolti nel tubo 50 ml.
- Applicare il flusso continuo su un filtro da 30 micron collocato su un tubo di centrifugazione 15 ml e risciacquare il filtro una volta con 1 ml L-15/10% FBS media. In questa seconda fase di filtrazione, i cuori sono trattenuti nel filtro e detriti più piccolo è lavato via.
- Ruotare il filtro a testa in giù e lavare i cuori fuori del filtro in un agarosio rivestite Petri 1% applicando tre lavaggi consecutivi con 1 ml L-15/10% FBS.
- Separare manualmente cuori GFP-positive dalla macerie embrionale nonfluorescent (ad esempio le lenti degli occhi), con un paio di pinze allo stereomicroscopio a fluorescenza e concentrarsi al centro del piatto. Raccogliere loro secondo step 3.
NOTA: Se gli embrioni sono più vecchi di 24 HPF, il cuore dovrebbe essere battono, indicando che i tessuti sono ancora fisiologicamente normale.
3. Isolamento mRNA da dissezioneted Hearts
- Raccogliere i cuori del minor volume possibile (ad esempio, 10 mL) e trasferirli in una provetta da 1,5 ml contenente 0,75 ml RNAlater (su ghiaccio). Verificare che nessun cuore rimane nella punta della pipetta visualizzando sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza.
- In alternativa, se una cappa chimica è disponibile nelle immediate vicinanze del microscopio a fluorescenza, trasferire i cuori raccolti in Trizol (ATTENZIONE) sotto il cofano chimica. Questo aggira la possibile perdita di cuori che spuntano nella punta della pipetta e anche durante la centrifugazione del cuore (i passaggi 3.4, 3.5 e 3.7). Pool i cuori di diversi cicli di isolamento nello stesso tubo con Trizol e passare direttamente al punto 3.8; il volume finale non deve superare il 10% del volume originale Trizol.
NOTA: Leggere il Trizol Scheda di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Maneggiare Trizol reagente sotto una cappa e usura raccomandato dispositivi di protezione individuale. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e clothing. Rimuovere tutte le fonti di accensione. - Pool cuori di diversi cicli di isolamento nello stesso tubo con RNAlater (su ghiaccio), l'efficienza di isolamento dell'RNA migliora con la quantità di tessuto raccolto. Se il volume totale del campione supera il 10% del volume RNAlater originale, utilizzare un tubo supplementare con 0,75 ml RNAlater per la memorizzazione (su ghiaccio).
- Centrifugare i campioni a 15.700 xg per 20 min a 4 ° C per sedimentare il cuore.
- Sotto un stereomicroscopio a fluorescenza, raccogliere il più accuratamente possibile surnatante in una capsula petri agarosio rivestite 1% contenente 3 ml L-15/10% FBS mezzo, ma non disturbare i cuori sedimentate sul fondo del tubo di centrifugazione. Poiché fino al 15% dei cuori può rimanere nel supernatante causa dell'elevata viscosità di RNAlater, recuperali come descritto al punto 3.7.
- Sotto una cappa chimica, aggiungere 0,5 ml Trizol per il tubo contenente i cuori sedimentati e tenere in ghiaccio.
- Sotto la microsco fluorescentepe, trasferire i cuori (dal punto 3.5) dal piatto agarosio 1% rivestite contenenti la soluzione FBS RNAlater / L-15/10% in un altro piatto 1% agarosio rivestite con 3 ml L-15/10% FBS per diluire il RNAlater. Raccogliere il cuore nel centro della capsula di Petri e trasferirli in un piccolo volume nel tubo di cuori sedimentati in Trizol sotto cappa chimica.
- Vortex la provetta da 1,5 ml contenente i cuori in Trizol perturbare il cuore e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Sotto una cappa chimica, aggiungere 100 ml di cloroformio (ATTENZIONE), mescolare bene e trasferire la soluzione / cloroformio Trizol in un 1,5 ml pre-filata tubo PLG (centrifuga 30 sec alla massima velocità prima dell'uso). Incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Leggere le MSDS cloroformio prima dell'uso. Manipolare il reagente cloroformio sotto una cappa e usura raccomandato dispositivi di protezione individuale. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e gli indumenti. Tenere lontano dai materiali incompatibili come i metalli, alcali. - Centrifugoge il campione a 15.700 xg per 15 min a 4 ° C e trasferire la fase acquosa in una nuova provetta da 1,5 ml.
- Aggiungere 5-10 mg glicogeno e 250 microlitri preraffreddata (a -20 ° C) isopropanolo; mescolare bene e incubare per tutta la notte a -20 ° C.
- Centrifugare il campione a 15.700 xg per 30 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
- Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%, centrifugare a 15.700 xg per 15 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
- Lasciare evaporare etanolo essiccando il pellet a temperatura ambiente fino a quando diventa bianco (ad esempio per 10-15 min).
- Aggiungere 20 microlitri RNasi-free DDH 2 O al pellet e incubare per 10-15 min a 55 ° C per sciogliere il RNA; poi tenere su ghiaccio.
- Valutare la concentrazione di RNA e la purezza mediante misurazione assorbanza. Valutare l'integrità dell'RNA eseguendo il campione su un gel di agarosio 1%.
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Representative Results
Qui, descriviamo un esperimento rappresentativo dissezione cuore con il pesce zebra Tg (myl7: GFP) twu34 transgenici linea 9, che esprime la proteina verde fluorescente (GFP) esclusivamente all'interno del miocardio (Fig. 1). Abbiamo raccolto sia il cuore sezionato e gli embrioni da cui sono stati ricavati per valutare la purezza del campione cuore. In breve, omozigote Tg (myl7: GFP) twu34 zebrafish 9 sono stati outcrossed con wild-type in modo che tutti i cuori embrionali sono stati GFP etichettati. Alcuni 500 embrioni (56 HPF) sono stati trasferiti in provette da 1,5 ml (circa. 100 embrioni in ciascuno) (Fig. 1A1, 1B). Ogni tubo è stata trattata come descritto nella sezione Protocol (step 2) e nella Figura 1A. Hearts sono stati rilasciati pipettando su e giù parecchie volte (Fig. 1A2) e poi applicate su un filtro di 100 micron (Fig. 1A3). Grossi pezzi di tessuto embrionale sono state mantenute in questo filtro; questa frazione è stato recuperato e messo in Trizol foEstrazione di RNA r per ottenere un "embrione senza cuore" RNA campione (Fig. 1A3). Il flusso continuo contenente cuori è stato poi applicato su un filtro di 30 micron (Fig. 1A4), che ha mantenuto il cuore e tessuti detriti di dimensioni simili. Cuori GFP-positive sono state eliminate dal filtro in una capsula di Petri agarosio rivestite (Fig. 1A5, 1C), rapidamente riuniti nel centro del piatto allo stereomicroscopio a fluorescenza e trasferito in 0,75 ml RNAlater (Fig. 1A6). All'interno di questo tubo con RNAlater, abbiamo messo in comune cuori derivati da 5 turni dissezione (circa. 300 cuore da 500 embrioni rappresentano una efficienza di estrazione di circa il 60%). Un confronto dei campioni cardiaci prima dell'ordinamento dai detriti da embrioni a 56 HPF (Fig. 1C) contro 36 HPF (Fig. 1C ') è mostrato in Figura 1. 56 HPF, l'interruzione di embrioni prodotto detriti più embrionale ( quali lenti, punta di freccia, Fig. 1C) rispetto a 36 HPF seguito della fase di filtrazione 30 micron (Fig. 1C ').
Per determinare la purezza del campione 56 hpf "cuore", abbiamo confrontato i livelli di espressione di cardiaca rispetto trascrizioni extra-cardiaci nel "cuore" e "embrione senza cuore" campioni di RT-qPCR. A questo scopo, abbiamo estratto mRNA da questi due campioni e valutato qualità RNA su gel di agarosio (Figura 2A) e quantità mediante misurazione dell'assorbanza (Tabella 1) come descritto nella sezione del protocollo (passaggio 3). Il ca. 300 cuori hanno prodotto 660 ng RNA. Successivamente, cDNA è stato sintetizzato utilizzando M-MLV Reverse transcriptase RNase H (-) ed esameri casuali secondo le istruzioni del fabbricante, e gli esperimenti di RT-qPCR sono state eseguite come descritto 12. Relativi livelli di espressione genica sono stati calcolati per i diversi marcatori tessuto-specifici come la luce miosina polipeptide 7 [myl7, un marcatore infarto] 9, chinasi del recettore del dominio inserto come [kdrl, un endoteliale / marcatore endocardica] 13, l'emoglobina beta embrionale-1.1 [hbbe1.1, un indicatore di eritrociti] 14, crystallin-alpha A [cryaa, un indicatore obiettivo occhio] 15, e proteina acidica fibrillare gliale [GFAP, un marker del sistema nervoso centrale] 16 (Figura 2B). Il eucariotico fattore zebrafish inizio della traduzione 1B [eif1b] 12 è stato utilizzato come un gene di riferimento interno (vedi Tabella 2 per i numeri di identificazione GenBank, sequenze di primer, dimensioni del prodotto di PCR e la specificità del tessuto per ogni gene). Come previsto, myl7 era altamente arricchito nel campione "cuore" rispetto al "dell'embrione senza cuore" campione (Fig. 2B). L'indicatore di cella endoteliali kdrl è risultato essere moderatamente arricchita nel campione cuore, come previsto (circa il 40% delle cellule cardiache a 56 HPF sono kdrl esprimente cellule endocardico) (Fig. 2B). Il hbbe1.1 marcatore eritrociti era sovrarappresentato nel campione "cuore", anche se i cuori erano still pestaggio dopo la dissezione, che dovrebbe espellere globuli rossi dal cuore (Fig. 2B). In contrasto, i livelli di espressione del SNC e marcatori lenti (GFAP e cryaa rispettivamente) erano estremamente basse nel "cuore" campione (Fig. 2B). Complessivamente, si può concludere che i rendimenti del protocollo di dissezione cuore di alta qualità e RNA cardio-specifica da interi embrioni di zebrafish.
Figura 1. Estrazione Cuore da embrioni di zebrafish. (A) Schema raffigurante la procedura di estrazione del cuore. Circa 100 embrioni vivi sono raccolti in una provetta da 1,5 ml (A1, B, B '), anestetizzati e poi pipettati su e giù parecchie volte attraverso uno stretto puntale per liberare i cuori (A2). La soluzione risultante contenente i tessuti embrionali (A2) viene quindi applicato su un filtro 100 micron (A3). Tessuti embrionali senza tuorlo e hearts e detriti di grandi dimensioni embrionali rimangono nel filtro (A3). Il flusso continuo è raccolto in un tubo da 50 ml (A3) e poi applicato su un filtro 30 micron (A4). I cuori e piccoli detriti vengono mantenuti nel filtro 30 micron e trasferiti in una piccola capsula di Petri agarosio rivestite (A5, C, C '). EGFP cuori etichettati (C, C '; freccia) sono ordinati manualmente dai detriti rimanente, come ad esempio le lenti (C, punta di freccia), e sono raccolti in RNAlater (A6). Questo procedimento viene ripetuto almeno 5 volte e tutti i cuori vengono riunite insieme per un'ulteriore elaborazione. (BC ') Overlay della fluorescenza (EGFP in verde) e DIC immagini di vivo transgenico Tg (myl7: EGFP) twu34 embrioni a 56 HPF (B, C) e 36 HPF (B', C '), a due passi del cuore Procedura dissezione: prima embrione dissezione (B, B ') e subito dopo il lavaggio dal filtro 30 micron, prima di ordinare i cuori dai detriti nella capsula di Petri (C, C'). Scala bar: 500 micron.
Figura 2. Analisi della qualità dell'RNA e la purezza mediante elettroforesi e RT-qPCR rispettivamente. (A) RNA totale dal campione "cuore" (2 mL) e dal "dell'embrione senza cuore" campione (1 ml), derivato da 56 embrioni HPF, ha deliberato su un gel 1%. Bande Prominent S18 e S28 rRNA indicano che RNA non sono degradati. (B) i livelli di espressione relativi di marcatori specifici tessuti myl7 (miocardio), kdrl (endotelio), hbbe1.1 (eritrociti), cryaa (obiettivo), e GFAP (CNS), come determinato da RT-qPCR per il campione "cuore" normalizzato al "embrione senza cuore" campione. Gli esperimenti di RT-qPCR sono state eseguite come triplicato tecniche ei dati sono forniti come media ± SEM. È stata effettuata un'analisi t-test spaiato. **** P <0,0001; ** P <0,005. bp, coppia di basi.
| ID campione | ng / ml | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | cursore abs. | 340 raw |
| cuori | 32.97 | 0.82 | 0.41 | 2.01 | 0.35 | 2.355 | 0,031 |
| embrioni senza il cuore | 568,82 | 14.22 | 7.00 | 2.03 | 2.04 | 6,965 | 0.018 |
Tabella 1. RNA quantità e qualità mediante misurazione spettrofotometrica. La quantità e la qualità dell'RNA del "cuore" e "dell'embrione senza cuore" campioni ottenuti da 56 HPF embrioni come misurato mediante spettrofotometria.
| gene | GenBank # | Sequenza iniettore | PCR formato del prodotto (bp) | Marcatore tessuto-specifica |
| myl7 | BX248505 | F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' | 163 | miocardio |
| R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 ' | ||||
| kdrl | CR759732 | F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' | 170 | endotelio / endocardium |
| R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 ' | ||||
| GFAP | BX324157 | F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' | 247 | sistema nervoso centrale |
| R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 ' | ||||
| cryaa | BX248514 | 190 | lente dell'occhio | |
| R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 ' | ||||
| hbbe1.1 | BC095024 | F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 | 102 | eritrociti |
| R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8 | ||||
| eif1b | BX323079 | F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 | 195 | gene di riferimento |
| R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12 |
Tabella 2. primer utilizzati per gli esperimenti di RT-qPCR. Nome, GenBank numero di accesso, di sequenza, le dimensioni del prodotto PCR e il tessuto-specificità sono indicati per tutti i geni analizzati.
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Discussion
Questo protocollo permette il rapido arricchimento di zebrafish tessuto cardiaco embrionale per analisi dell'espressione genica. La quantità e la qualità del campione RNA cardio-specifica dipende molto pochi passi fondamentali: in primo luogo, la quantità di campione viene notevolmente migliorata se la perdita di cuori è impedito ad ogni passo del protocollo, poiché la purificazione dell'RNA funziona solo con sufficiente materiale di partenza. In secondo luogo, la purezza del campione, che dipende interamente sperimentatore, è determinata da classificare e raccogliendo cuori ai Petri nel rigoroso escludendo altri tessuti. In terzo luogo, la qualità del campione dipende criticamente limitare RNA degrado che possono verificarsi interruzioni degli embrioni; ciò si ottiene utilizzando terreno di coltura cellulare per evitare la morte cellulare e mantenendo i campioni in ghiaccio. Degradazione dell'RNA viene arrestato una volta che i cuori sono stati trasferiti in RNAlater o Trizol. Che i cuori battono nella capsula di Petri dimostra con forza che la t cardiacoproblema è fisiologicamente normale dopo la dissezione.
Si consiglia di iniziare con almeno 300 cuori (cioè circa 500 embrioni), dal quale abbastanza RNA può tranquillamente essere precipitato (con 5-10 mg glicogeno). Tuttavia, non possiamo escludere che un minor numero di cuori sarebbe sufficiente per esperimenti su piccola scala. Esso è semplicemente importante avere RNA sufficiente per determinare la concentrazione, la purezza e l'integrità del campione. Si prega di notare che il contenuto di RNA possono variare a seconda della fase di sviluppo e il background genetico dell'embrione (ad esempio nel caso di mutanti con cuori anomali). Quindi, la quantità minima di embrioni necessari per un esperimento dovrebbe essere determinata in ciascun caso.
Ci sono poche differenze tecniche tra questo protocollo e un protocollo prima da Burns e MacRae, e non credo che ci sia una differenza significativa in termini di efficienza e di velocità tra i due protocolli.Tuttavia, abbiamo introdotto miglioramenti: La cosa più importante, si consiglia l'uso di una soluzione di stabilizzazione RNAlater. Questo è importante per due motivi: in primo luogo, per raccogliere RNA di alta qualità per ulteriori esperimenti come RT-qPCR riducendo la degradazione dell'RNA al minimo, come RNAlater inattiva immediatamente RNasi e stabilizza l'RNA nei tessuti o cellule. In secondo luogo, RNAlater è cruciale per permettere la raccolta dei cuori su diversi giorni, che è importante quando il numero di embrioni è un fattore limitante. Consente inoltre raggruppamento dei cuori che possono essere necessarie per ottenere una quantità sufficiente di materiale di partenza per l'isolamento efficace di RNA di alta qualità con Trizol. Trasferimento cuori direttamente in Trizol sarebbe bypassare l'uso di RNAlater, tuttavia, a causa rischi per la salute, questo passo dovrebbe essere effettuata sotto una cappa chimica, che non può essere assunto per essere collocata nelle immediate vicinanze del microscopio a fluorescenza per tutti sperimentatori .
Abbiamo trovato tcappello la dissezione cuore funziona bene con gli embrioni tra 20-72 hpf [12; dati non pubblicati per 72 HPF]. Tuttavia, la procedura di estrazione diventa più difficile con l'aumentare dell'età embrionale e lunghezza: siano necessarie e pipettaggio più forte per introdurre con successo gli embrioni nella punta lunga e di separare i cuori di altri tessuti embrionali. Come risultato, detriti più embrionale è presente nella preparazione del campione (vedere Figura 1C, C ') e lo sperimentatore deve essere più attenti a classificare i cuori nella capsula di Petri.
Il protocollo dissezione cuore qui presentata consente un'analisi dell'intero profilo di espressione cardiaca di tipi cellulari diversi, tra miocardio e endocardio. Ulteriore separazione dei tipi di cellule cardiache potrebbe essere raggiunto tramite endocardial- e infarto-specifici giornalista linee [es Tg (myl7: GFP) twu34 e Tg (kdrl: mCherry is5] 9, 17 per l'estrazione del cuore combinato con FACS ordinamento. In contrasto con il metodo Traducendo ribosoma Affinity Purification (TRAP) 18,19, che permette l'analisi trascrizionale tessuto-specifica senza dissezione dei tessuti, il nostro approccio non è limitato a mRNA attivamente tradotte ma include anche mRNA non-attivamente tradotte o RNA non codificanti. Un'applicazione alternativa del protocollo dissezione cuore è quello di analizzare l'espressione della proteina nei cuori: livelli proteici possono essere valutati da macchia e proteine la localizzazione occidentale possano essere analizzati con immunoistochimica, come l'anatomia del cuore è conservato durante la procedura di dissezione.
In sintesi, vi presentiamo qui un protocollo dettagliato per sezionare funzionali / cuori che battono da centinaia di embrioni in un breve periodo di tempo, che possono essere utilizzati per ottenere specifici cuore RNA (o proteine) campioni di elevata purezza per ulteriori analisi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 ml centrifugation tubes | |||
| 15 ml and 50 ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µl in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
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