Summary
Zebra balığı kalp gelişimi sırasında kalp gen ekspresyon profillerini analiz etmek, toplam RNA izole kalpleri elde edilecek olan. Burada, biz kalp-özel mRNA elde etmek Zebra balığı embriyolarının gelen hızlı manuel diseksiyon ile işlevsel / yenerek kalpleri toplamak için bir protokol mevcut.
Abstract
Zebra balığı Embriyonik kalp tüm embriyonun sadece küçük bir kısmını temsil eden, sadece birkaç yüz hücrelerden oluşur. Bu nedenle, genel embriyonik transcriptome tarafından maskelenen kardiyak transcriptome önlemek için, ayrıca analiz için kalpleri yeterli sayıda toplamak için gereklidir. Zebra balığı kalp geliştirme hızla devam Dahası, kalp toplanması ve RNA ekstraksiyonu yöntemleri numunelerin homojen olmasını sağlamak için hızlı olması gerekir. Burada, biz Zebra balığı embriyolarının fonksiyonel / yenerek kalpleri toplamak için hızlı manuel diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu transcriptome analizleri ile bu kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) halinde, kalp-özgü gen ekspresyon seviyelerini belirlemek için daha sonra, kalp-özel RNA ekstraksiyonu için bir temel oluşturur. yöntem, diğer dokulara göre zebra balığı embriyonik kalp diferansiyel yapışma özellikleri dayanmaktadır; Bu hızlı laşılmakla sağlarakışkan kesme kuvveti bozulması, aşamalı filtrasyon ve transgenik floresan etiketli kalplerin manuel toplama bir kombinasyonu ile dışı dokusundan kalp ceği ayrılması.
Introduction
Balığı (Danio rerio), yaygın küçük olması nedeniyle ve floresan proteinleri dokuya-özel ifadesi transjenik raportör hatları durumu ile birleştirilmiş olan, hızlı, şeffaf ve rahim dışı embriyonik gelişme, in vivo olarak organogenez çalışma gelişim biyolojisi kullanılır. Bu küçük omurgalı, özellikle de erken Zebra balığı embriyonun oksijenlenme, kalp atışı ve kan akımı dayanmaz çünkü kalp gelişimini incelemek için uygundur; Bu özellikler kardiyovasküler mutantların 1,2 sayıda karakterizasyonu izin ve zebra balığı artık kalp hastalıkları 3 incelemek için yaygın olarak tanınan bir model organizmadır.
Embriyo gelişimi esnasında gen ekspresyonunu incelemek için, transkriptler genellikle tüm montaj in situ melezleşme (VVISH) 4 ile analiz edilmiştir, RT-qPCR 5, mikrodiziler 6, ya da bir sonraki nesil sıralama (RNA Dizi) 7. SüreWISH analiz tüm embriyo olan gen ifadesinin uzamsal ve zamansal analizi, transkript seviyeleri, genellikle, RT-qPCR mikrodizilerdeki ya da RNA-Seq yaklaşımlarla değerlendirilir sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler, belirli bir gen ekspresyonu profillemesi doku zenginleştirme gerektirir.
Zebra balığı Embriyonik kalp tüm embriyo küçük bir kısmını temsil ettiğinden dolayı, kalp gelişimi sırasında transcriptome çalışmaları diseksiyon ve kalpleri zenginleştirilmesi için bir protokol gerektirir. Buna ek olarak, fizyolojik olarak ilgili veri elde etmek için, bu RNA ekstraksiyonu kadar tam olarak işlevsel kalp dokusunu muhafaza etmek önemlidir. Burada, biz hızla fizyolojik, normal izole ve verimli bir şekilde ileri analizler için yüksek kaliteli RNA örnekleri elde etmek için Zebra balığı embriyolarının yüzlerce kalpleri yenerek bir protokol açıklar. Bu yöntem Burns ve MACRAE 2006 8 tarafından bildirilen protokol dayanmaktadır. Kalp dokusunun zenginleşmesi için, her iki yöntem bir transgenik miyokard muhabiri hattını kullanmakve diğer dokulara karşı Zebra balığı embriyonik kalpleri diferansiyel yapışma özelliklerine yararlanmak. Kısaca, dar bir pipet ucu ile yukarı ve aşağı doğru çok sayıda embriyolar pipetleme, kalpler aynı embriyonik gövdelerinden serbest bırakılır ve daha sonra, iki hızlı bir filtreleme adımlarından embriyonik enkaz ayrılır; floresan etiketli kalpler sonra el kalan enkaz sıralanır ve daha fazla işlem için toplanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol Alman ve Berlin eyalet yasasının hayvan bakım kurallarına şöyle; Zebra balığı işleme hayvan koruma (LaGeSo, Berlin-Brandenburg) yerel otorite tarafından izlendi.
1. Kalp Ekstraksiyon için Zebra balığı Embriyolar Alınması
- Transgenik hat 9 twu34 Kalbe spesifik GFP ile embriyolar elde etmek için: bu tür Tg (EGFP myl7) halinde çapraz kalp raportör zebra balığı.
- İstenilen embriyonik aşamada 10,11 yılına kadar 28.5 ° C'de yumurta suda embriyolar koruyun. Toplanan embriyo nüfus gen ifadesi değişikliklerini sınırlamak için hem genetik ve gelişimsel aşamada homojen olduğundan emin olun.
- Elle embriyolar Dechorionate.
2. Kesme Zebra balığı Embriyonik Kalpler
NOT: buz üzerinde tüm çözümleri tutun. Mümkünse, takım çalışması yapın: Bir kişi emb gelen kalpleri masayaryos başka bir kişi floresan stereomikroskop altında kalpleri sıralar ise. Bu, birkaç saat içinde embriyo yüzlerce işlenmesine olanak tanır.
- 1.5 ml santrifüj tüpüne yaklaşık 100 embriyolar transfer. Tricaine embriyo (E3 ortamı içinde 0.16 mg / ml) anestezisi. Embriyolar açıkça anestezi kez devam edin (onlar yüzmek ve tüpün dibine tortu, ama yürekleri hala yenerek değil).
- Tricaine / E3 çözeltisini çıkarın ve 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile bir kez embriyolar yıkama ve buz üzerinde muhafaza.
NOT: L-15 /% 10 FBS orta kalpleri RNAlater veya Trizol içine devredilmiştir kadar tüm diseksiyon işlemi sırasında canlı organ ve hücreleri tutmak önemlidir. - Sarısı tamamen bozulur kadar Yuvarlak Jel Yükleme İpucu yukarı ve aşağı embriyolar ve pipet 5-8 kez 1 ml L-15 /% 10 FBS orta ekleyin. Embriyolar damla damla çözeltinin yüzeyine açılan patlama böylece pipet veEmbriyolar hafifçe bozulur.
NOT: yukarı pipetle ve aşağı, yani daha pipet geç evrelerde (örneğin 56 hpf) ihtiyaç olduğu, embriyoların gelişim aşamasında bağlıdır edilecek Nasıl şiddetle ve ne sıklıkta embriyolar var. - Çok hafifçe pipetle, bazı kalpleri embriyoların takılı kalabilir çünkü disseke embriyoların ilk parti için, embriyoların bütünlüğünü ve bir stereo mikroskop altında disseke kalpleri oranını değerlendirmek. Buna göre diseksiyon sonraki tur için pipetleme şeklini ayarlayın.
NOT: plastik yapışmasını kalpleri en aza indirmek için düşük tutma pipet uçları ve mikrosantrifüj tüpleri kullanın. - 50 ml'lik santrifüj tüpüne yerleştirilen 100 mikron filtre üzerine numuneyi uygulayın; 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile 1.5 mi tüp durulama ve sonra, (bir kupa tüpün duvarlarına yapışmasını olabilir) örnek kaybını en aza indirmek amacıyla, filtreye, bu geçerlidir. 1 ml L, iki kez filtre yıkayın-15/10% FBS. Bu adımda, kalpler filtre içinden geçer ve 50 ml'lik bir tüp içinde toplanmıştır.
- 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirilir, 30 mikron filtre üzerine akış yoluyla uygulanır ve 1 ml L-15/10% FBS ortamı ile bir kez durulayın. Bu ikinci filtrasyon adımında, kalpler filtre muhafaza edilir ve küçük çöp yıkanır.
- Baş aşağı çevirin ve filtreyi 1 ml L-15/10% FBS ile arka arkaya üç yıkar uygulayarak% 1 agaroz kaplı petri içine filtre dışarı kalpleri yıkayın.
- Elle floresan stereomikroskop altında forseps bir çift ile nonfluorescent embriyonik enkaz (örn göz mercekleri) GFP-pozitif kalpleri ayırmak ve yemeğin ortasında onları konsantre. Adım 3'e göre onları toplayın.
NOT: embriyolar daha eski 24 hpf iseniz, kalpler, dayak dokular hala fizyolojik normal olduğunu belirten olmalıdır.
3. Dissec mRNA izoleted Kalpler
- (Buz üzerinde) ve 0.75 ml RNAlater ihtiva eden 1.5 ml'lik bir tüp içine mümkün olan en küçük hacimde kalpleri (örneğin, 10 | il) ve pipet toplayın. Hiçbir kalpler bir floresan stereomikroskop altında görüntüleyerek pipet kalır emin olun.
- Alternatif olarak, bir kimyasal başlık floresan mikroskop hemen yakınında varsa, kimyasal başlık altında Trizol (DİKKAT) toplanır kalpleri aktarmak. Bu pipet ve aynı zamanda kalplerin santrifüj sırasında yapışmasını kalplerin olası kaybını circumvents (3.4, 3.5 ve 3.7 adımları). Trizol ile aynı tüpe izolasyon birkaç tur kalpleri havuzu ve 3.8 adıma doğrudan gitmek; Nihai hacim orijinal Trizol hacminin% 10 geçmemelidir.
NOT: Kullanmadan önce Trizol Malzeme Güvenlik Bilgi Formu (MSDS) okuyun. Bir başlık altında Trizol reaktif Kulp ve Kişisel Koruyucu Ekipman tavsiye aşınma. Cilt, göz ve clothi ile temastan kaçınınng. Tüm tutuşma kaynaklarını uzaklaştırın. - RNA izolasyonu etkinliği toplanan doku miktarı ile iyileştikçe, (buz üzerinde) RNAlater aynı tüp içine tecrit birkaç tur kalpleri havuzda toplayın. Toplam örnek hacmi, orijinal RNAlater hacminin% 10'unu aşması halinde, (buz üzerinde) depolama için 0.75 ml RNAlater ile ek bir tüp kullanın.
- Kalpleri çökeltmek için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 15.700 x g'de örnekleri santrifüjleyin.
- Flöresanlı bir stereomikroskop altında, 3 ml L-15/10% FBS ortamı içeren bir% 1 agaroz kaplı petri içine mümkün olduğu kadar çok dikkatli bir şekilde süpernatan toplamak ama santrifüj tüpünün tabanına tabakalandığı kalpleri rahatsız yoktur. Kalpleri% 15 e kadar bağlı RNAlater yüksek bir viskoziteye sahip süpernatan içinde kalabildiği için aşama 3.7'de tarif edildiği gibi, bunları almak.
- Bir kimyasal Kaputun altında, sedimante kalpleri içeren tüp 0.5 ml Trizol ekleyin ve buz üzerinde tutmak.
- Floresan microsco altındaPE, sulandırmak için 3 ml L-15/10% FBS ile bir% 1 agaroz-kaplanmış çanak içine RNAlater / l-15/10% FBS çözeltisi ihtiva eden,% 1 agaroz-kaplanmış çanak (adım 3.5 den) kalpleri aktarmak RNAlater dışarı. Petri kasesinin ortasına kalpleri toplamak ve kimyasal bir başlık altında Trizol tabakalandığı kalplerin tüp içine, küçük bir hacim içinde aktarın.
- Girdap Trizol kalpleri ihtiva eden 1.5 ml'lik bir tüp kalpleri bozabilir ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübasyona.
- Bir kimyasal Kaputun altında, 100 ul kloroform (DİKKAT) ekleyin, iyice karıştırın ve (kullanmadan önce maksimum hızda santrifüj 30 sn) 1.5 ml önceden bükülmüş PLG tüp Trizol / kloroform çözüm aktarın. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Kullanmadan önce kloroform MSDS okuyunuz. Bir başlık altında kloroform reaktif Kulp ve Kişisel Koruyucu Ekipman tavsiye aşınma. Deri, göz ve giysilere dokunmayınız. Alkaliler, metal gibi uzak Uygunsuz maddelerden tutunuz. - Santrifüjge 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15.700 x g'de numune ve yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içine, sulu faz aktarılır.
- 5-10 mikrogram glikojen ve izopropanol (-20 ° C'de) soğutulmuş 250 ul ekleyin; iyice karıştırılır ve -20 ° C 'de gece boyunca inkübe edilir.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15,700 x g'de santrifüjleyin ve süpernatant atılır.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15.700 x g'de 1 mi% 75 etanol, santrifüj ile pelet yıkayın ve süpernatant atılır.
- Bu (10-15 dakika, örneğin), beyaz hale gelinceye kadar oda sıcaklığında pelet kurutulmasıyla etanol buharlaşmasını olsun.
- Pelet 20 ul RNase içermeyen GKD 2 O ekleyin ve RNA çözmek üzere 55 ° C de 10-15 dakika inkübe edilir; Daha sonra buz üzerinde tutmak.
- Absorbans ölçümü RNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirin. Bir% 1 agaroz jeli üzerinde örneği çalışmadan RNA bütünlüğü değerlendirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sadece miyokardın (. Şekil 1) içinde twu34 transgenik hattı 9, yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eder: Burada, biz zebrabalıkları Tg (GFP myl7) kullanarak bir temsilci kalp diseksiyon deneyi tarif. Biz disseke kalpleri ve kalp numunenin saflığını değerlendirmek için elde edilmiştir hangi embriyolar hem topladı. Kısaca, homozigot Tg (myl7 GFP) twu34 zebra balığı 9, embriyonik kalpleri GFP etiketli ki, vahşi tip ile çaprazlanırlar. Yaklaşık 500 embriyo (56 HPF) 1.5 ml tüpler içine transfer edilmiştir (yakl. 100 embriyolar her) (Şek. 1A1, 1B). Protokol bölümü (aşama 2) ve Şekil 1A'da anlatıldığı gibi hazırlanan her bir tüp işlenmiştir. Kalpler aşağı birkaç kez (Şekil. 1A2) yukarı pipetleme tarafından yayımlanan ve daha sonra 100 mikron filtre (Şekil. 1A3) üzerine uygulanmıştır. Embriyonik doku büyük parça bu filtre tutuldu; Bu fraksiyon alınır ve fo Trizol kondur RNA ekstraksiyon bir "embriyo kalp olmadan" RNA örneği (Şekil. 1A3) elde etmek. kalpleri içeren akış yoluyla daha sonra benzer büyüklükteki kalpleri ve doku artıkları birikmiş 30 mikron filtre (Şekil. 1A4), üzerine uygulandı. GFP pozitif kalpler bir agaroz kaplı bir petri (Şek. 1A5, 1 C), hızlı bir şekilde 0.75 mi RNAlater (Şek. 1A6) içine flöresanlı bir stereomikroskop altında kabı orta toplandı ve transfer filtreden dışarı çekildi. RNAlater bu boru içinde, 5 diseksiyon mermi türetilen kalpleri toplanmış (yakl. 300 kalpleri% 60 kadar bir ekstraksiyon verimi temsil 500 embriyolardan). Önce 36 hpf karşı 56 hpf embriyolar enkaz (Şekil. 1C) sıralama kalp örneklerinin karşılaştırılması (Şekil. 1C ') 56 hpf At Şekil 1'de gösterilmiştir, embriyoların bozulması (daha embriyonik enkaz verdi Böyle 30 mikron filtrasyon aşaması (Şekil şu 36 hpf daha lensler, ok ucu, Şek. 1C) olarak. 1C ').
56 hpf "kalp" örnek saflığını belirlemek için, biz RT-qPCR numuneleri "kalbi olmadan embriyo" "kalp" ve ekstra kardiyak transkript karşı kardiyak ifade düzeyleri karşılaştırıldı. Bu amaçla, bu iki örnekten alınan mRNA özütlendi ve protokol bölümü (aşama 3) 'de tarif edildiği gibi absorbans ölçümü (Tablo 1), bir agaroz jeli (Şekil 2A) ve miktarına RNA kalitesi değerlendirildi. yakl. 300 kalpler 660 ng RNA vermiştir. Üreticinin talimatlarına göre ve rastgele heksamerleri ve 12 tarif edildiği gibi RT-qPCR deneyler gerçekleştirilmiştir (-) Daha sonra, cDNA, ir M-MLV ters transkriptaz RNaz H kullanılarak sentezlendi. Bağıl gen sentezleme seviyeleri, miyosin hafif polipeptid 7 [myl7, miyokardiyal belirteç] 9, [kdrl bir endotel / endokardiyal işaretleyici] 13 hemoglobin p embriyonik-1 gibi bir kinaz tesbit etki alanı reseptörü gibi farklı doku özel markörler için hesaplanmıştır.1 [hbbe1.1, bir eritrosit işaretleyici] 14, kristalin-alfa A [cryaa, göz merceği işaretleyici] 15, ve glial fibriler asidik protein [GFAP, bir merkezi sinir sistemi işaretleyici] 16 (Şekil 2B). 1B [eif1b] 12, bir dahili referans gen olarak kullanıldı zebra balığı ökaryotik translasyon başlatma faktörü (Gen Bankası İD numaraları, astar dizileri, PCR ürünü, boyutları ve her gen için doku özgünlüğü için bakınız Tablo 2). Beklendiği gibi numune (Şekil. 2B) "kalbi olmadan embriyo" ile karşılaştırıldığında, myl7 yüksek "kalbi" numunede zenginleştirilmiş. (Şek. 2B) (56 hpf kalp hücreleri yaklaşık% 40 kdrl endokardiyal hücreleri -expressing edilir), beklendiği gibi, endotelyal hücre belirteci kdrl, orta kalp örneğinde zenginleştirilmiş olduğu bulunmuştur. eritrosit işaretleyici hbbe1.1 kalpler st olsa bile, "kalp" numunede fazla temsil edildikalp (Şekil. 2B) kırmızı kan hücreleri atılmalarını diseksiyonu sonra hasta dayak. Buna karşılık, CNS ve objektif belirteçleri (sırasıyla GFAP ve cryaa) ifadesi düzeyleri "kalp" örnek (Şekil. 2B) son derece düşük. Tamamen, biz sonucuna ki tüm Zebra balığı embriyolarının kalp diseksiyonu protokolü verimleri yüksek kalite ve kalp-spesifik RNA.
Zebra balığı embriyolarının Şekil 1. Kalp çıkarma. Kalp çıkarma prosedürünü gösteren (A) Şema. Yaklaşık 100 canlı embriyolar, 1.5 ml tüp (A1, B, B ')' de toplandı anestezi yapılır ve sonra kalpler serbest bırakmak için dar bir pipet ucu (A2) boyunca birkaç kez pipetle aşağı edilir. embriyonik dokular (A2) ihtiva eden elde edilen çözelti daha sonra, bir 100 mikron filtre (A3) üzerine tatbik edilir. Sarısı ve h olmadan Embriyonik dokularearts ve büyük embriyonik Kalıntı filtresinin (A3) kalır. akış yoluyla 50 ml'lik bir tüp (A3) içinde toplanır ve daha sonra bir 30 um'lik bir filtreden (A4) üzerine tatbik edilir. kalpleri ve küçük çöp 30 mikron filtre içinde tutulan ve küçük bir agaroz kaplı bir petri (A5, C, C ') olarak aktarılır. EGFP etiketli kalpler (C, C '; ok) elle tür lensler (C, ok ucu) olarak, kalan enkaz sıralanır ve RNAlater (A6) toplanır. Bu prosedür, en az 5 kez tekrarlanmış ve kalpler daha sonraki işlemler için bir araya toplanmıştır. (M.Ö. ') floresan Yerleşimi (yeşil EGFP) ve DIC canlı transgenik Tg (myl7: EGFP) görüntüleri twu34 embriyo 56 hpf (B, C) ve 36 hpf (B', C ') kalbin iki aşamada Diseksiyon işlemi: embriyo diseksiyon (B, B ') önce ve hemen önce petri (C, C enkaz gelen kalpleri sıralama için, 30 mikron filtreden kızarma sonra'). Ölçek çubuğu: 500 mikron.
Analiz sırasıyla elektroforez ve RT-qPCR, RNA kalite ve saflık Şekil 2.. (A) Toplam RNA "kalbi" örnek (2 ul) ve dan numune (1 ul) "embriyo kalp olmadan", 56 türetilen bir% 1 agaroz jeli üzerinde çözüldü HPF embriyoları. Tanınmış S18 ve S28 rRNA bantları RNA'lar bozunmayan olduğunu göstermektedir. (B), dokuya özgü belirteçleri myl7 (miyokard) "göbek" numune için RT-qPCR ile belirlendiği gibi, kdrl (endotelyum), hbbe1.1 (eritrositler) cryaa (objektif) ve GFAP (CNS) göreli ekspresyon seviyeleri örnek "kalp olmayan embriyo" normalize. RT-qPCR deneyleri teknik üçlü olarak gerçekleştirilmiştir ve veriler ortalama ± SEM olarak verilmiştir. Bir t-test analizi yapılmıştır. **** P <0,0001; ** P <0,005. bp, baz çifti.
| Örnek Kimliği | ng / | il | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | abs imleç. | 340 ham |
| kalpleri | 32.97 | 0.82 | 0.41 | 2.01 | 0.35 | 2,355 | 0.031 |
| kalpleri olmadan embriyolar | 568,82 | 14.22 | 7.00 | 2.03 | 2.04 | 6,965 | 0.018 |
Spektrofotometrik ölçüm Tablo 1. RNA miktar ve kalite. 56 hpf embriyolar elde edilen örneklerde "kalp olmadan embriyo" miktar ve "kalp" ve RNA kalite spektrofotometre ile ölçülen.
| gene | GenBankası # | primer sekans | PCR ürün hacmi (bp) | Dokuya özel markör |
| myl7 | BX248505 | F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' | 163 | kâlp kası |
| R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 ' | ||||
| kdrl | CR759732 | F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' | 170 | endotel / endokardiyumu |
| R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 ' | ||||
| GFAP | BX324157 | F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' | 247 | merkezi sinir sistemi |
| R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 ' | ||||
| cryaa | BX248514 | 190 | Göz merceği | |
| R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 ' | ||||
| hbbe1.1 | BC095024 | F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 | 102 | alyuvar |
| R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8 | ||||
| eif1b | BX323079 | F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 | 195 | referans gen |
| R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12 |
RT-qPCR deneyleri için kullanılan Tablo 2. astarlar. Adı GenBank erişim numarası sekans, PCR ürünü, boyutları ve doku spesifikliği analiz edilen tüm genler için gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol gen ifadesi için Zebra balığı Embriyonik kalp dokusunun hızlı zenginleşme analizleri verir. RNA arıtma sadece yeterli çalışır çünkü, kalplerin kaybı protokolü her aşamasında önlenir, ilk numune miktarı büyük ölçüde artırıldı: kardiyak spesifik RNA örnek miktarı ve kalitesi büyük ölçüde bir kaç önemli adımlar bağlıdır başlangıç malzemesi. İkinci olarak, deneyi ile tamamen bağlıdır numune saflığı, sıralama ve sıkı bir şekilde diğer dokuları hariç tutulduğunda petri çanağı içinde kalpleri toplayarak tespit edilir. Üçüncü olarak, örnek kalitesi eleştirel embriyoların bozulması üzerine oluşabilir RNA bozulmasını sınırlandırılması bağlıdır; Bu hücre ölümünü önlemek için hücre kültürü ortamı kullanılarak buz üzerinde örneklerin tutarak elde edilir. Kalpler RNAlater veya Trizol içine aktarıldıktan sonra RNA bozulması durdurulur. Kalpleri petri yenerek olduğunu güçlü gösteriyor ki kalp tSorun diseksiyonu sonrası fizyolojik normal.
Biz yeterince RNA güvenle (birlikte 5-10 mikrogram glikojen) ile çöktürülmüş olabilir hangi en az 300 kalpleri (yani yaklaşık 500 embriyo), ile başlayan öneririz. Az kalpler, küçük ölçekli deneyler için yeterli olandan Ancak, biz dışarıda değil. Bu numunenin konsantrasyonu, saflık ve bütünlüğünü belirlemek için yeterli RNA olması sadece önemlidir. RNA içeriği gelişim aşamasında ve (anormal kalpleri ile mutantlar durumunda örneğin) embriyonun genetik zeminine bağlı olarak değişebilir lütfen unutmayın. Bu nedenle, bir deney için gerekli olan embriyoların en az miktarı, her bir durumda tespit edilmesi gerekir.
Orada bu protokol ve Burns ve MACRAE tarafından bir önceki protokol arasındaki birkaç teknik farklılıklar vardır ve biz iki protokol arasındaki verimlilik ve hız önemli bir fark olduğunu düşünmüyorum.Ancak, iyileştirmeler girmiştik: En önemlisi, biz RNAlater stabilizasyon çözeltisinin kullanımını önermektedir. Önce, RNAlater hemen RNaz'larına inaktive ve dokular ya da hücre içinde RNA sabitlenene kadar, en az bir RNA bozulmasını azaltarak RT-qPCR olarak, daha başka deneyler için yüksek kalitede RNA toplamak için: Bu iki nedenden dolayı önemlidir. İkinci olarak, RNAlater embriyo sayısı sınırlayıcı bir faktör olduğunda, önemli olan, farklı günlerde, kupa toplama izin vermek için çok önemlidir. Ayrıca, Trizol ile yüksek kalitede RNA etkili izolasyonu için, başlangıç malzemesinin yeterli bir miktarını elde etmek için gerekli olabilir kalplerin havuzu sağlar. Trizol doğrudan kalpleri aktarılması RNAlater kullanımını atlamak istiyorum, ancak bağlı sağlık tehlikeleri, bu adım, tüm deneyselciler için floresan mikroskop doğrudan çevresinde bulunduğu için kabul edilemez bir kimyasal kaput altında yapılmalıdır olurdu .
Biz t bulunduKalp diseksiyonu 12 20-72 hpf [arası embriyolar ile iyi çalışır şapka; 72 hpf] için yayınlanmamış veriler. Ek ve daha güçlü pipetleme başarılı uzun ucu içine embriyo tanıtmak ve diğer embriyonik dokulardan kalpleri ayırmak için gereklidir: Ancak, ekstraksiyon işlemi embriyonik yaş ve uzunluğu arttıkça daha zor hale gelir. Sonuç olarak, daha embriyonik enkaz (Şekil 1C, C 'bakınız) numune hazırlama içinde mevcut olan ve deneyci petri kalpleri sıralama daha dikkatli olmak zorunda.
Burada yer alan kalp diseksiyon protokolü miyokard ve endokard de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin tüm kardiyak ifade profilinin bir analizini sağlar. (GFP myl7) twu34, Tg (kdrl kardiyak hücre tiplerinin daha da ayrılması endocardial- ve miyokardiyal spesifik-raportör hatları [örneğin Tg kullanılarak elde edilebilir MCherry IS5] FACS sıralama ile kombine kalp çıkarılması için 9, 17. Doku diseksiyonu olmadan doku-spesifik transkripsiyon analiz sağlar Tercüme Ribozom Affinity Arıtma (TRAP) yöntemine 18,19, aksine, bizim yaklaşım aktif tercüme mRNA'lara sınırlı değil, aynı zamanda aktif olarak tercüme mRNA'ları veya kodlayıcı olmayan RNA'lar kapsamaktadır. Kalp diseksiyon protokolünün bir alternatif uygulama kalplerinde protein ifadesini analiz etmek: protein seviyelerinin kalp anatomisi diseksiyon işlemi sırasında korunur olarak, immünohistokimya ile analiz edilebilir, Western blot ve protein lokalizasyonu ile tespit edilebilir.
Özet olarak, burada daha ayrıntılı analiz için yüksek saflıkta kalp spesifik RNA (veya proteini) örnekleri elde etmek için kullanılabilecek bir kısa bir süre içinde embriyo, yüzlerce işlevsel / kalpten kesme ayrıntılı protokol mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 ml centrifugation tubes | |||
| 15 ml and 50 ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µl in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al.
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
