Summary
Mit beiden Methoden, die Genexpression in den großen Geschmacks Anhängsel Aedes aegypti schätzen, haben wir den Satz von Genen, die mutmaßlich zugrunde liegenden neuronalen Antworten zu bitter und abstoßend Verbindungen identifiziert, wie durch elektrophysiologische Untersuchung bestimmt.
Introduction
Verbindungen wie DEET, Picaridin, Citronellal und IR3535 wurde gezeigt, dass Mücken, einschließlich der wichtigen Krankheitsüberträger Aedes aegypti 1,2 wirksam abwehren. Wir erfassen Aktionspotentiale aus sensorischen Neuronen mit bestimmten Geschmacks Sensillen verbunden, um die Zellen mit Moskitoabweisung beteiligt zu bestimmen. Mit nachgeschaltetem Sequenzierung der exprimierten Gene in diesen Geweben gekoppelt ist, können wir die Gene wahrscheinlich Vermittlung der Reaktionen dieser Zellen, um neue Verbindungen zu verbessern abweisende Fähigkeiten Bildschirm identifizieren.
RNA-seq ist ein mächtiges Werkzeug, schnell zum Standard für die Verfolgung von zeitlichen und räumlichen Veränderungen in der Genexpression. RNA-seq-Analysen von Insekten chemosensory Anhängsel und Organe wurden zur molekularen Rezeptoren in verschiedenen Insektenarten 3-5 aufzudecken, stark von herkömmlichen PCR-basierte Suche Gen Verbesserung von Gen 6. Insekten stellen die verschiedensten Tierklasse, vor,senting viele Möglichkeiten die Verbindung zwischen Genen und einzigartige Phänotypen zu studieren. RNA-seq-Technologie kann auf jedem lebenden Insektengewebe eingesetzt werden. Ebenso können elektrophysiologische Ableitung von Sinneszellen im uniporous Geschmacks Sensillen in vielen verschiedenen Insektenarten erreicht werden. Die Paarung dieser beiden Techniken ermöglicht es den Forschern, die in einem beobachteten chemosensory Phänotyp beteiligt Satz Gene einzugrenzen. Verschiedene Arten werden spezifische Herausforderungen stellen, kann aber die Verbindung zwischen chemosensorischen Rezeptorgene und einer chemosensorischen Anpassung zu informieren. Die Größe und die Morphologie der chemosensorischen Sensillen ist variabel und kann bei der Aufnahme von Aktionspotentialen, um Lärm zu reduzieren und identifizieren reproduzierbare Signale erfordern eine umfangreiche Fehlersuche. Dissektionen chemosensorischer Organen kann trivial oder schwierige und zeitaufwendig, in Abhängigkeit von der Morphologie und Größe des Insekts. Rückgewinnung von hochwertigen RNA kann einige Fehlersuche sowie erfordern, wie beispielsweise die Vermeidung bestimmter Pigmente inGewebesammlung.
Zwar zeigen die Auswirkungen der abweisende Verbindungen durch Verhaltensversuche ist direkt und informativ ist dieser Ansatz Zeit intensive und breit in Bezug auf Wirkmechanismus. Elektrophysiologie in Verbindung mit RNA-seq ermöglicht eine spezifische Analysen dessen, was treibt Vermeidungsverhalten in Insekten. Sobald das "Toolkit" von chemischen Diskriminierung in einer Insektenart identifiziert worden, um genauere Versuche verbessern bekannten Repellents sind möglich. Rezeptoren und assoziierten Proteinen in Sinneszellen für diese Verhaltensweisen verantwortlich sind, können heterolog für direkte chemische Screening ausgedrückt werden. Weiterhin können molekulare Modellierung vorherzusagen, welche Chemikalien starken Antworten von diesen Rezeptoren 7 zu entlocken.
Die Momentaufnahme aller aktiven Gene in einer engen Gruppe von chemosensorischen Gewebe können auch nützlich bei der Identifizierung von ähnlichen Genen in anderen Spezies. Mit Sequenzhomologie und Ausdruck similarities Forscher können Sätze von molekularen Rezeptoren wahrscheinlich Vermittlung antwortet Repellentien, die breitenwirksame auf Insekten zu bilden. Wir präsentieren den folgenden Protokoll, um Forscher in die Dekonstruktion Insekten chemosensory Wege zu helfen und mehr zu überreden, in die Neuroethologie von nicht-Modell und wirtschaftlich wichtigen Insekten zu vertiefen.
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Protocol
1. Aufzucht Ae. aegypti Erwachsene
- Hatch Eier in etwa ¾ Zoll Wasser in flache Schale. Überbelegung wird die Größe des Erwachsenen zu reduzieren.
- Rück Larven bei 25 ° C (12-hl: 12-HD) und führen mit Grundfischfutter.
HINWEIS: Überfütterung kann die Überlebensraten zu reduzieren. - Entfernen Puppen einzeln von Pasteur-Pipette täglich und Transfer in Plastikschalen (9 cm x 5,5 cm) in kleinen Contain Eimer mit feinmaschigen Deckel und schafft so 24 Stunden Altersgruppen.
- Feed erwachsenen Mücken 10% Saccharose-Lösung mit Wattebausch auf den Bildschirm Wände eines Käfiggehäuse platziert die Mücken in einer Klimakammer bei 27 ° C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit unter dem gleichen Photoperiode als Larven.
- Für Elektrophysiologie, verwenden 5-10 Tage alten Tieren. Im Allgemeinen werden größere Tiere zu besseren Ergebnissen führen. Für die RNA-Isolierung, verwenden Sie Tiere, die in einem einzigen 24-Stunden-Alter Gruppierung in der 5-10 Tage alten Reihe sind.
- Bestimmen eines geeigneten Elektrolytkonzentration (zB 1-10 mM), die minimale Aktivität von ausgewählten sensorischen Neuronen auslöst. 10 mM NaCl und 1 mM KCl, vernünftig sind Elektrolyte zur Baseline-Aktivität zu testen, wenn zu Beginn eines Experiments.
- Löse jede Versuchschemikalie geeigneten Lösungsmittel (wenn nicht Wasser, mit Ethanol oder DMSO), die wenig oder keine Wirkung auf Spike-Aktivität im Vergleich zu allein Elektrolyten. Endkonzentrationen von 10% Ethanol oder 1% DMSO, vernünftig sind Ausgangskonzentrationen.
- Wählen Sie die entsprechende (zB Chinin für bitter oder Saccharose süß) Steuer Chemikalien, die gut beschrieben sind Fütterung Abschreckung oder Stimulanzien in Insekten.
3. Elektrophysiologie (Spitze Aufnahme 8, Abbildung 1)
- Form-Glaselektroden durch mechanisches Ziehen von Glaskapillaren. Optimieren Wärme und ziehen Sie die Einstellungen auf Glas zu ziehen, um entsprechend geformte recordi bildenng Elektroden. Vorsichtig abbrechen Ende Glaselektrode mit einer Pinzette unter einem Binokular zu Elektrodenspitze Öffnung, die breit genug ist, um die Ziel Sensillum Umschlag, aber klein genug, um den Kontakt mit benachbarten Strukturen zu vermeiden erstellen.
- Unter dem Mikroskop visuell durch Morphologie identifizieren und positionieren Sie den Ziel Sensillen / Sensillum, um die Wiederholbarkeit der Spitze Aufnahme zu gewährleisten. Prep Tiere freien Zugang zu Sensillen von Winkel Elektroden Eintrag kann.
- Kalte Anesthetize erwachsenen Insekten in Gefrierschrank bei -20 ° C. Schäden an peripheren Neuronen durch übermäßige Kälte zu vermeiden. Schneiden Sie schmale Streifen Klebeband mit Rasierklinge auf Glasobjektträger. Immobilisieren ganze Insekt auf einem Glasobjektträger mit schmalen Streifen.
- Legen Sie eine chemisch geschärft Wolframdraht in die dorsalen Thorax oder Augen als indifferent (Masse) Elektrode dienen.
- Füllen Glaselektrode in Schritt 3.1 mit einer anregenden Lösung von Interesse gemacht. Mit einem einge Spritze, füllen KappeIllary aus zog Ende stumpfen Ende. Streichen Sie alle Luftblasen, halten zog Ende nach unten. Legen Sie eine Silberdraht (chloriding optional) in die Glaselektrode in Schritt 3.1, um als Aufnahme und Stimulationselektrode zu dienen.
- Schließen Elektroden an einen Vorverstärker, der für Aufnahmen von Kontakt chemorezeptiven Sensillen von Insekten ausgelegt ist. Dieser Vorverstärker (300 Hz-3 kHz-Bandpassfilter) wird die Einschwingzeit auf neuronale Aktivität so nah wie möglich Einführung Reiz einzufangen reduzieren. Sammeln, speichern und elektrische Signale mit einem Mikrocomputer mit Spike-Recording-Software ausgestattet analysieren.
HINWEIS: Die Erdung des Aufnahme-Setup richtig kann Signal-zu-Rausch-Verhältnis deutlich verbessern. - Stimulieren Sensillen mit einer Kontrolllösung (Elektrolyt nur), um die Funktionalität zu gewährleisten. Graf Spikes ab 200 msec nach dem Reizartefakt für alle Zubereitungen.
- Zufälliger Reihenfolge Testchemikalien für alle Experimente, außer Dosis-Wirkungs-Studienzum Vorspannen zu beseitigen. Für Dosis-Wirkungs-Studien, aufzudecken sensilla steigenden Konzentrationen der Versuchschemikalie. Warten Sie mindestens 3 Minuten zwischen Stimulationen eine ausreichende Erholung sicherzustellen.
HINWEIS: Diese Anforderung kann je nach Insekten und Sensillen variieren. Threshold ist als die Konzentration, für die Standardfehler nicht mit der Standardfehler für die geringste untersuchte Konzentration lappen definiert.
4. RNA Isolierung und Sequenzierung (Figur 2)
- Bereiten Sie die dicht schließende RNase-freien Stößel durch Abkühlung auf Trockeneis vor Gewebe disruption.Prepare Begleit RNase-freies Stößel, der Schnappdeckel Rohre eng anliegen. Halten Sammelröhrchen, wenn aktiv sezieren, um überschüssige Kondensation zu vermeiden geschlossen.
- Mit gefiltert Sauger, legen 30 bis 40 Kalt betäubt Mücken (15 sec in -20 ° C Tiefkühlschrank) auf Kältestufe und Art von Sex. Platz Tieren dorsalen Seite nach unten, Greifen Flügel Geschmack Anhängsel nicht beschädigen.
- Mit zwei Paaren von feinen Pinzette, sezieren gepaarten labella oder tarsi von Männern oder Frauen unter einem Binokular und Einbeziehung der angrenzenden Gewebe zu begrenzen.
HINWEIS: 500 gepaart labella ergibt etwa 800-1.000 ng Gesamt-mRNA. 400 Einzel tarsi (5 Segmente jeweils) zu erhalten 1.200-1.800 ng Gesamt-mRNA. - Mit einem Paar keuchenden-Pinzette, leicht begreifen Mücke Rüssel proximal labella auszusetzen inneren Mandrins. Mit anderen Paar der Sammlung-Pinzette entfernen labella und fügen Gewebe Seite kalten Sammelröhrchen.
- Mit einer Pinzette, leicht begreifen Moskito Bein an der Kreuzung von Schienbein und Fußwurzelknochen ersten Segment. Mit anderen Pinzette, entfernen tarsi und fügen Gewebe Seite kalten Sammelröhrchen.
Hinweis: Beachten Sie die Zelltypen an der Schnittstelle zwischen erwünschten und unerwünschten Gewebe. Während es wichtig ist, die Aufnahme benachbarte Gewebe zu begrenzen, ist es ebenso wichtig, keine Abschnitte von gewünschten Gewebe wegzulassen. Der final Probe muss genau darzustellen das ganze Organ von Interesse. Erstellen Sie eine genaue Grenze mit den Greifzangen, dass Sammelzange präzise durch Schaben oder greifen nur das gewünschte Gewebe zu befreien. - Von Zeit zu Zeit, Spin-down Sammelröhrchen kurz in 0 ° C Zentrifuge bei 9000 xg, um Gewebe auf dem Boden des Röhrchens zu halten. Wenn sich Feuchtigkeit sammelt sich im Sammelröhrchen beim Präparieren, fügen Sie 50 ul kaltem Trizolreagenz gesammelte Gewebe zu bedecken.
- Mit Anti-Schmutz Labormarker, eindeutig zu kennzeichnen ein RNase-freies 1,5 ml Schnappdeckel Rohr für jeden Gewebetyp für die Sammlung. Mit 1,5-ml-Röhrchen Rack und flüssigem Stickstoff gefrier dann schleifen Gewebe zu feinem Pulver (feine Stücke, wenn in Trizol). Wiederholen Sie einmal. Bringen Gesamtvolumen von 1 ml Trizol zu resuspendieren und Grundgewebe durch Vortexen.
- Geben Sie 200 ul Chloroform und gründlich mischen. Nach 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren in Zentrifuge bei 4 ° C und 11.000 × g für 15 min. Vorsichtighinzuzufügen wässrige Schicht direkt an eine genomische DNA Filtersäule. Spin down bei 11.000 x g für 5 min. Hinzufügen gleichen Volumen RNase-free 70% Ethanol Durchflußrichtung und Mischen mit einer Pipette. Übertragen Flüssigkeit zu einer RNA Sammlung Spalte und weiter RNA-Extraktion gemäß den Anweisungen.
- Messen und bewerten die Reinheit der Gesamt-RNA auf einem Präzisions-Spektralphotometer und fahren mit jedem Standard-RNA-Sequenzierungsmethode.
5. Quantitative RT-PCR-Validierung von RNA Sequencing (Figur 3)
- Auszuwählen, wie viele Gene wie möglich, um die relative Genexpression über einen Dynamikbereich zu vergleichen, die beide in vorhergesagten Sequenz Fülle und vermuteten chemosensory Genfunktion.
- Design-Primerpaare für jedes Zielgen eine bestimmte 100-180 Basenpaar-PCR-Produkt zu verstärken. Ausschließen unspezifische gDNA Verstärkung durch, die mindestens ein Primer pro Satz umfasst ein Intron-Grenze. Alternativ können Sie DNase-Behandlung, um genomische Kontamination zu verringern.
- SammelnInsektengewebe wie in vorhergehenden Abschnitt beschrieben. Berechnen Sie, wie viel Gewebe ist erforderlich, um genügend RNA bieten alle qRT-PCR-Reaktionen durchzuführen.
HINWEIS: Biologische dreifacher Ausfertigung und technische dreifach Reaktionen maximale Vertrauen in Ergebnisse zu liefern. - Berechnen relativer Genquantifizierung als X Ziel - (Ct [target] -Ct [Referenz]) für jedes Zielgen und Durchschnitt für jede Wiederholung, sowohl biologische und technische. Verwenden Housekeeping-Gen (en) Ct-Werte zwischen biologischen Replikaten zu normalisieren und die Y-Achse Skala im Vergleich der relativen Expression verankern.
- Beurteilen Sie die Ähnlichkeit der RNA-seq und qRT-PCR Datensätze mit dem Regressionsbasis, Bootstrap Gleichwertigkeit Verfahren 9, iterativ angewendet, um die Daten aus jedem Gewebe.
HINWEIS: Dieses Verfahren identifiziert das kleinste "Ähnlichkeitsregion", die sich um die beobachtete RNA-seq und qRT-PCR-Daten konstruiert werden können, und lassen Sie die relative Genexpression durch qRT- gemessenPCR als statistisch äquivalent zur Messung der relativen Genexpression durch RNA-seq werden.
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Representative Results
Die Trace-Aufzeichnungen von Aktionspotentialen von Ae. aegypti Geschmacks Sensillen (Abbildung 1) zeigen die Wirksamkeit der direkten Stimulation mit einer Reihe von Chemikalien. Diese Technik kann verwendet werden, um Antworten auf jede Stimulierung chemischen durch Zählen Spitzen einer gegebenen Amplitude und Dauer über einen angemessenen Zeitraum (im allgemeinen weniger als 500 ms) zu quantifizieren. Trace-Aufzeichnungen müssen unter einem gegebenen Satz von experimentellen Bedingungen leicht reproduzierbar sein. Ansonsten können die beobachteten physiologischen Reaktionen ungewöhnlich Phänotypen zwischen Individuen der geprüften Spezies darstellen.
Rohe RNA-seq Daten erfordert Filtration und genaue Zuordnung, bevor sie als abgerundete RPKM dargestellt (die Anzahl der zugeordneten Lesevorgänge pro Kilobase Länge des Transkripts pro Million liest abgebildet) oder FPKM (die Anzahl der gelesenen Fragmente pro Kilobase Länge des Transkripts pro Million liest abgebildet) Zahlenwerte (Abbildung 2). Die Unterscheidung zwischendiese beiden RNA-seq Normalisierungsmethoden wurde in zwei wegweisenden Werke 10,11 beschrieben. Ein Vorteil der gesamten mRNA-Sequenzierung ist die Fähigkeit, die Expression von großen Genfamilien gleichzeitig erfassen. Die visuelle Darstellung der Expression einer Vielzahl von Genen erlaubt gleichzeitig eine einzigartige Verständnis der molekularen Werkzeuge für ein gegebenes Gewebe. Vergleiche zwischen den Geschlechtern, Entwicklungsstadien oder Gewebetypen kann schnell durchgeführt werden.
Biologische Wiederholungen für RNA-seq Datensätzen kann durch kostspielig oder schwierig, Gewebesammlung beschränkt. qRT-PCR bietet die Fähigkeit, kleine Teilmengen der gesamten Genexpression zu geringeren Kosten zu validieren und erfordert weniger Quelle RNA. Seite an Seite Datenvergleiche (3A) ermöglichen eine größere Vertrauen in RNA-seq Ergebnisse, wie die beiden Verfahren beruhen auf unterschiedlichen chemischen für Gen Fülle Schätzung. Statistische Äquivalenz Funktionen (3B) zeigen die Grenzen der Sicherheit in jedem Fall.
Bild 1: Elektrophysiologische Aufnahmen von einem mittelständischen Sensillum auf der Lippe von Ae. aegypti Weibchen von zitierten Arbeit 12 modifiziert. Die Spuren zeigen Antworten auf 100 mM NaCl, 100 mM Saccharose, 1 mM Chinin, 0,8% DEET, 0,8% Picaridin, 0,8% und 0,8% Citronellal IR3535. Die drei Spitzen mit unterschiedlichen Amplituden oder Formen A, B oder C bezeichnet. Diese drei Spitzen entsprechen drei sensorischen Neuronen-Subtypen mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten: Salz, Zucker, und bitter auf.
Abb. 2: Inhaltsgeschmacksrezeptor die Genexpression durch RNA-seq für 8 Gewebeproben bestimmt, aus zitiert Arbeit 13 geändert Einzelne Zellen berichten RPKM Wertejede Geschmacks Gen-Annotation, männlich Gewebe (links) und weiblichen Gewebe (rechts). Numerische Werte werden auf das nächste Zehntel gerundet. Wärme-Karte Farbintensität wird mit höchster RPKM verschlossen und der Mittelpunkt wird für jeden Genfamilie individuell skaliert. Es gibt nur eine in diesem Fall gezeigt Genfamilie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 3: Vergleich der qRT-PCR-Daten und RNA-seq Daten aus zitierte Werk 13 modifizierten (A) Jeder der Chemo Gen der horizontalen Achse wird von zwei Datenspalten dargestellt. Die linke Spalte stellt relativen Expression durch RNA-seq bestimmt; RPKM Werte der Chemorezeption Gene wurden durch die des Haushaltsgens Aaeg LASP unterteilt, um Zahlenverhältnisse in diesem Gewebe zu erzeugen. Das RechtSpalte stellt relativen Expression durch qRT-PCR bestimmt. Zunächst wurden biologische Replikation Ct-Werte für labella Gene mit Aaeg LASP als Standard normalisiert. Zweitens replizieren Ct-Werte für jedes Gen wurden verwendet, um relative Expression-Werte zu berechnen (E Ziel - (Ct [target] -Ct [Referenz])). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung der individuell berechneten relativen Expressionswerte. (B) RNA-seq und qRT-PCR Datensätze wurden in einer separaten Analyse verglichen. Die vertikalen Achsen stellen relative Gen-Überfluss, wie RNA-seq Daten zeigten, mit einem Wert von 1 an Haushaltsgens Aaeg LASP zurückzuführen sind und alle anderen Gen-Expression relativ zu diesem Wert ausgewiesen. Die horizontalen Achsen stellen relative Gen Fluss durch qRT-PCR vorhergesagt, mit einem Wert von 1 an Haushaltsgens Aaeg LASP zurückzuführen sind und alle anderen Gen-Expression relativ zu diesem Wert ausgewiesen. Rote Linien stellen genaue Übereinstimmung. Gestrichelten Linien Grenzen des 'Ähnlichkeitsregion "für die Steigung, die vom statistischen Äquivalenz Algorithmus 9 berechnet. Solid black Linien stellen die kleinsten Quadrate Regression der qRT-PCR Gleichwertigkeit mit RNA-seq Quantifizierung für die 12 Zielgene und Aaeg LASP Housekeeping-Gen, die jeweils von Kreisdatenpunkt dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Die größte Herausforderung bei der Aufnahme von Aktionspotentialen von Geschmacks Sensillen ist zu entscheiden, welche Antworten sind "normal". Bei der Verwendung von einzelnen Geschmacks Sensillum Spitze der Aufnahme das erste Mal für eine bestimmte Insektenarten, die Gesamtzahl und die Empfindlichkeiten der Geschmacksrezeptorzellen (KNS) sind wahrscheinlich unbekannt. Viele vorläufigen Aufzeichnungen werden zunächst erforderlich, den Bereich und die Konzentrationen von Chemikalien zu testen, zu entscheiden. In diesem Fall haben wir mit der Beobachtung, dass eine einzelne GRN sprechen auf geringe Konzentrationen an DEET (Abbildung 1). Anschließend untersuchten wir Reaktionen innerhalb derselben Sensillum auf einen Bereich von Konzentrationen von Chemikalien bekannt bitteren oder unangenehmen um andere Insekten zu sein und beobachteten einen ähnlichen Spitzenform und Amplitude (Abbildung 1). Diese Beobachtungen legten nahe, dass eine einzige GRN Subtyp reagiert auf diese aversive Verbindungen. Zum Vergleich haben wir getestet, zuckerhaltige Verbindungen bekannt, Fütterung in MOSQU stimulierenitoes zu sehen, ob eine ähnliche Spitze aufgetreten ist. Wir beobachteten eine andere, größere Spitze in diesem Fall. Ebenso konnten wir eine dritte Zwischenstand Spitze in Reaktion auf Salz Stimulation, womit sich die Gesamtzahl GRN-Subtyp zu drei.
Elektrophysiologische Aufzeichnung Präparate bei Insekten sind von Natur aus variabel. Zielgeschmacks Sensillen sind in der Regel sehr klein und muss im gleichen Winkel angeordnet, um mit der Aufzeichnungselektrode zugreifen ohne sie zu berühren Glas auf die Nagelhaut werden. Um eine leitende Brücke zur Geschmacksnervenzellen herzustellen, muss das Terminal Pore des Sensillum offen für die Lymphe enthalten sein, um den direkten Kontakt mit dem Elektrolyten der Aufnahme Elektrode herzustellen. Wir haben Verstopfung der Sensillen Öffnungen entweder durch Fremdkörper festgestellt oder ausgeschieden und getrocknete Material aus der Ziel Sensillum. Um diese Hindernisse zu vermeiden, müssen Sie beim Umgang mit der Aufzucht und Insekten, um Kontakt mit der Ziel Sensillen vermeiden. Neben Choosingen unbeschädigte, gesunde Testtiere, biologische Faktoren wie Alter, Fütterung Zustand, Paarungszustand und Zeitgeber Zeit sollte bei der Festlegung Kontrollen schwankender Aufnahmen zu reduzieren.
Es kann schwierig sein, eine reagierende Herstellung durchweg erhalten. Viele Studien notwendig sein, um das Signal-Rausch-Verhältnis aus, einzelne Spitzen aufzulösen verbessern. Experimentelle Variationen der oben genannten Präparate können zu besseren Ergebnissen führen. Es ist ratsam, eine robuste Antwort auf Ihrem Aufzeichnungsgerät für die Testspezies mit einem gemeinsamen Insekten Spike Auslöser, wie Saccharose oder Chinin herzustellen. Sobald ein Geschmacks Sensillum reagiert, sollten diese Reaktionen reproduzierbar sein. Die Mindestlänge der Zeit zwischen Stimulationen experimentell zu ermitteln Prüfung Spike Dynamik unter verschiedenen zeitlichen Einschränkungen. Übermäßige Stimulation sollte vermieden werden, um GRN Gesundheit zu erhalten und Sensillum Lymphe Abbau zu verhindern. In dem Fall, That Ansprechempfindlichkeit nimmt schnell nach der ersten Anregung, eine größere Anzahl von PREPS muss erhalten werden, um das Vertrauen, dass diese Reaktionen sind physiologisch typisch für die gegebenen Spezies bereitzustellen.
Die Löslichkeit von einigen Testchemikalien können Schwierigkeiten, Stimulationselektroden zu schaffen, wie es einige Lösungsmittel können GRN-Aktivität auch bei niedrigen Endkonzentrationen beeinflussen. Diese Überlegungen können durch Versuch und Irrtum und mit geeigneten Kontrollen behandelt. Jede verwendete Lösungsmittel sollte auf die Steuer Elektrolyten und anderen Testlösungen hinzugefügt werden, um die Konsistenz der Antworten zu gewährleisten. Immobilisierung von kleinen Insekten, damit Sie direkt zum Sensillen ohne Beschädigung empfindliche Zielgewebe kann Versuch und Irrtum erfordert.
Die wichtigste Einschränkung der Elektrophysiologie ist die unglückliche Trennung beobachteten neuronalen Antworten und potenzielle nachgeschaltete Verhaltensreaktionen. Vorteilhaft ist es deshalb, um Antworten auf Chemikalien, B weisen zu testeneen gezeigt, dass bestimmte Verhaltensreaktionen, um die Bedeutung der Ergebnisse in einem ökologischen Kontext diskutieren zu entlocken. Tipp Aufnahmen ermöglichen sehr präzise Erkennung von Zellaktivität, so dass diese Technik ideal für die Beurteilung der transgenen Tiere oder die phänotypische Unterschiede im Verhalten zeigen. Diese Aufnahmen bieten ebenfalls weitere Informationen zu neuronalen Antworten, wie Zeit- und Amplitudendynamik, als Systeme, die sich auf visuelle Reportern der neuronalen Aktivität. In einigen Fällen kann die neuronalen Antworten leichter quantifizieren als Verhaltensdaten 12.
Tissue-Kollektion für RNA-seq und qRT-PCR ist einfach, erfordert jedoch kontinuierliche Konzentration und Aufmerksamkeit auf die Erhaltung Zellmaterial durch Kühllagerung und die Vermeidung von überschüssiger Feuchtigkeit. RNase-Aktivität kann RNA Qualität beeinträchtigen; daher Gewebe darf nur kontaktieren saubere Oberflächen im gesamten Sammlung und RNA-Extraktion. Obwohl die Problemlösungen für qRT-PCR i erforderlichs gut dokumentiert, treten die wahrscheinlichste Fallstricke frühzeitig in den Prozess bei der Gestaltung und Auswahl von Ziel Primer und Housekeeping-Genen. Gene, die vorhersagbar entlang einer Linie der relativen Expression Ebene zu vertreten gleichmäßig verteilten Punkten sind hilfreich zum Vergleichen RNA-seq und qRT-PCR-Datensätze (Abbildung 3). Zum Beispiel die Auswahl Gene für qPCR, die RPKM Werte von 0, 10, 20, 30, usw., bzw. bieten eine vorhersehbare Reihenfolge des Überflusses zeigen, getestet werden.
RNA-seq war auf die Hervorhebung niedrigen Expression von Genen in unserer Umfrage von Geschmacksgewebe (Abbildung 2) erfolgreich. Die zuverlässige Gen Build für Ae. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) und vor Chemorezeption Genidentifizierung 14 gemacht Scoring Genexpression relativ einfach. Zu diesen Zwecken Insekten mit verfügbaren Gen Anmerkungen und identifizierten Gen-Familien von Interesse sind wertvolle Modellsysteme. Die Bestimmung einer genauen Schwellenfür die Genexpression gegen Hintergrundgeräusche ist spekulativ, aber Methoden zur Bestimmung der angemessenen Abschaltungen sind 15-17. Hier bestimmen wir eine RPKM Niveau vollem Vertrauen und eine niedrigere RPKM Niveau verringert Vertrauen basierend auf Präzedenzfall 9, mit dem wir unsere Diskussion der Ergebnisse umrahmt.
Für die Zukunft hoffen wir, andere chemosensorische Gewebe sowohl in der Mücke und andere wirtschaftlich bedeutende Insekten sezieren, um unser Wissen über die Gene der Vermittlung Insektenabwehr zu erweitern. Wir haben mehrere Kandidaten Geschmacks Gene, die am ehesten zu vermitteln sind Antworten auf aversive Verbindungen durch den Vergleich von Gensequenzen zu Arten mit verfügbaren Funktionsdaten 13 etabliert. Wir Erzeugung transgener Linien fehlen diese individuellen chemosensorischen Gene Mücken. Wir werden Spitze Aufnahmen verwenden, um die Rolle dieser Gene auf die Fähigkeit des Tieres bekannt Repellentien zu erkennen und zu bewerten Verhaltensreaktionen dieser Mutanten zu REPE bewertenllents. Für den Fall, dass diese Kandidaten-Gene nicht signifikant beeinflussen Abweisung kann eine höhere Auflösung erforderlich sein, um die Genexpression oder Protein Vorhandensein genauer zu bestimmen, in einem einzigen Sensillum oder Zelle. Niedrig exprimierter Rezeptoren können wichtige Ziele für das Screening neuartige Repellentien sowie ubiquitär exprimiert Co-Rezeptoren sein. Leider ist in-situ-Hybridisierung und Immunlokalisierung ist unglaublich schwer in Insektengeschmacksgewebe 18 bewährt.
Nachdem wir festgestellt haben, welche Gene vermitteln diese physiologischen Reaktionen und Verhaltensweisen, so können wir diese Gene in Zellsystemen, die zugänglich für Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Repellentien kommen zum Ausdruck bringen. In silico Ansätze, die Strukturmodellierung 7 verwenden, können auch nützlich bei der Vorhersage, welche Arten von Verbindungen werden starke Antworten von spezifischen Rezeptoren hervorzurufen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127 mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5 ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5 ml collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
References
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
- Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
- Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).
- Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
- Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
- Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
- Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
- Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
- Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
- Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
- Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).
