Summary
באמצעות שתי שיטות להערכת ביטוי גנים בנספחים התעוררו אצל הגדולים של Aedes aegypti, זיהינו הקבוצה של גני putatively בסיס התגובות עצביות לתרכובות מרות ודוחות, כפי שנקבע על ידי בדיקת אלקטרו.
Introduction
תרכובות כמו DEET, Picaridin, Citronellal וIR3535 הוכחו ביעילות להדוף יתושים, כולל Aedes וקטור מחלה החשוב aegypti 1,2. אנו רושמים פוטנציאל פעולה מתא עצב תחושתי הקשורים sensilla התעורר אצל ספציפי כדי לקבוע את התאים מעורבים עם דחיית יתושים. בשילוב עם רצף במורד הזרם של גנים המתבטאים ברקמות אלה, אנו עשויים לזהות את הגנים סביר להניח תיווך התגובות של תאים אלה כדי להקרין תרכובות חדשות ליכולות דחייה השתפרו.
RNA-seq הוא כלי רב עוצמה, הופך סטנדרטי למעקב אחר שינויים של זמן ומרחב בביטוי גנים במהירות. RNA-seq ניתוחים של איברים chemosensory חרקים ואיברים שימשו לחשוף קולטנים מולקולריים בכמה מיני חרקים 3-5, שיפור משמעותי בגן מבוסס PCR קונבנציונלי חיפושים על ידי גן 6. חרקים מייצגים את מעמד בעלי החיים המגוון ביותר, מראשsenting הזדמנויות רבות ללמוד את הקשר בין גנים ופנוטיפים ייחודיים. טכנולוגית RNA-seq יכולה להיות מועסק על כל רקמת חרקים חיים. כמו כן, הקלטת אלקטרו מתאי חישה בתוך sensilla התעורר אצל uniporous ניתן להשיג במינים חרקים רבים ושונים. הזיווג של שתי הטכניקות הללו מאפשר לחוקרים כדי לצמצם גני הסט מעורבים בפנוטיפ chemosensory נצפה. מינים שונים יציגו אתגרים ספציפיים, אך עשוי להודיע על הקשר בין גני קולט chemosensory והסתגלות chemosensory. הגודל והמורפולוגיה של sensilla chemosensory משתנה ועשוי לדרוש פתרון בעיות נרחבות בעת הקלטת פוטנציאל פעולה כדי להפחית את הרעש ולזהות אותות הדיר. ניתוחים של איברי chemosensory עשויים להיות טריוויאלי או עדין וזמן רב, בהתאם למורפולוגיה וגודל של החרק. שחזור של RNA באיכות גבוהה עשוי לדרוש כמה פתרון בעיות, כמו גם, כגון הימנעות פיגמנטים מסוימים במהלךאוסף רקמות.
תוך שהם מפגינים את ההשפעות של תרכובות דוחה באמצעות ניסויים התנהגותיים הוא ישיר ואינפורמטיבי, גישה זו היא זמן אינטנסיבי ורחב ביחס למנגנון פעולה. אלקטרופיזיולוגיה בשילוב עם RNA-seq מאפשרת לניתוחים ספציפיים יותר של מה שמניע את התנהגויות הימנעות בחרקים. ברגע ש" ארגז הכלים "של אפליה כימית זוהה במיני חרקים, ניסיונות ספציפיים יותר על מנת לשפר את דוחי ידועים הם אפשריים. קולטנים וחלבונים הקשורים בתאי חישה אחראים להתנהגויות אלה עשויים לבוא לידי ביטוי heterologously להקרנה כימית ישירה. יתר על כן, הדמיה מולקולרית יכולה לנבא איזה כימיקלים יהיו לעורר תגובה חזקה מקולטנים אלה 7.
תמונת המצב של כל הגנים הפעילים בקבוצה צרה של רקמות chemosensory יכול להיות גם שימושית בזיהוי גנים דומים במינים אחרים. באמצעות הומולוגיה ברצף וsi הביטויmilarities, חוקרים עלולים להיווצר סטים של קולטנים מולקולריים סביר להניח תיווך תגובות לדוחים שהם רחב אפקטיביים על חרקים. אנו מציגים את הפרוטוקול הבא כדי לעזור לחוקרים בפירוק מסלולי chemosensory חרקים ולשכנע יותר להתעמק neuroethology של אי-מודל וחרקים חשובים מבחינה כלכלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול Ae. מבוגרים aegypti
- ביצים בוקעים בכ ¾ אינץ 'מים במגש רדוד. צפיפות תקטין את הגודל של מבוגרים.
- זחלים אחוריים במהירות של 25 ° C (12-HL: 12-HD) ולהאכיל עם מזון לדגי קרקע.
הערה: האכלת יתר עלולה להפחית את שיעורי הישרדות. - הסר גלמים בנפרד על ידי פיפטה פסטר היומית ולהעביר לצלחות פלסטיק (9 סנטימטרים × 5.5 סנטימטרים) בתוך דליי בלימה קטנים עם מכסי רשת בסדר, וכך יוצר 24 קבוצות גיל hr.
- 10% תמיסת סוכרוז יתושים בוגרים Feed על ידי כדור צמר גפן שהונחה על קירות המסך של דיור כלוב היתושים בתא סביבתי על 27 מעלות צלזיוס ו -70% לחות יחסית באותם photoperiod כזחלים.
- לאלקטרופיזיולוגיה, להשתמש 5-10 ישנים בעלי חיים יום. באופן כללי, בעלי חיים גדולים יותר יפיקו תוצאות טובות יותר. לבידוד RNA, להשתמש בבעלי חיים הנמצאים בקיבוץ גיל 24 שעות בודדות בטווח הישן 5-10 היום.
התחת = "jove_title"> 2. הכנת כימיקלים
- לקבוע ריכוז מתאים של אלקטרוליטים (למשל 1-10 מ"מ) שמעורר פעילות מינימאלית מתאי עצב תחושתיים שנבחרו. 10 מ"מ NaCl או 1 המ"מ KCl הם אלקטרוליטים סבירים כדי לבדוק את הפעילות בסיסית כאשר מתחיל ניסוי.
- ממיסים כל כימי ניסיוני בממס מתאים (אם לא מים, להשתמש באתנול או DMSO) שיש לו השפעה מועטת, אם בכלל, על פעילות ספייק בהשוואה לאלקטרוליט לבד. ריכוזים סופיים של 10% אתנול או DMSO 1% ריכוזים התחלה סבירים.
- בחר מתאים (למשל כינין למר או סוכרוז למתוק) כימיקלים שליטה המתוארות היטב הרתעה האכלה או ממריצים בחרקים.
3. אלקטרופיזיולוגיה (הקלטת טיפ 8; איור 1)
- אלקטרודות זכוכית טופס מכאני מושך נימי זכוכית. לייעל חום ולמשוך הגדרות למשוך זכוכית כדי ליצור recordi בצורה הולמתאלקטרודות ng. לשבור בזהירות את סוף אלקטרודת זכוכית באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח כדי ליצור קצה האלקטרודה פתיחה שהוא רחב מספיק כדי לעטוף Sensillum היעד, אך קטן מספיק כדי להימנע ממגע עם מבנים שכנים.
- תחת מיקרוסקופ, מבחינה ויזואלית לזהות על ידי מורפולוגיה ומקם את sensilla / Sensillum היעד כדי להבטיח את דירות של הקלטת קצה. בעלי החיים Prep כדי לאפשר גישה חופשית לsensilla מזווית כניסת האלקטרודה.
- חרקים קרים מבוגרים להרדים במקפיא ב -20 ° C. למנוע נזק לתאי עצב היקפי על ידי חשיפה לטמפרטורות קרות. חותך רצועות צרות של קלטת צלופן עם סכין גילוח על שקופיות זכוכית. לשתק חרקים שלמים בשקופית זכוכית באמצעות רצועות צרות.
- הכנס תיל טונגסטן חידד כימי לתוך בית חזה הגב או עין לשמש את האלקטרודה אדישה (קרקע).
- מלא אלקטרודת זכוכית נעשתה בשלב 3.1 עם פתרון מגרה של עניין. באמצעות מזרק הוכנס, למלא כובעillary מקצה משך להקהות סוף. גרור את כל בועות האוויר, מחזיק סוף הוריד. הכנס חוט כסף (chloriding אופציונאלי) לאלקטרודת הזכוכית נעשתה בשלב 3.1 לשמש הקלטה והאלקטרודה מגרה.
- חבר אלקטרודות למגבר קדם שנועד להקלטות מsensilla chemoreceptive קשר בחרקים. מגבר קדם זה (300 הרץ-3 מסנן bandpass kHz) יפחית את הזמן להתיישב כדי ללכוד פעילות עצבית קרובה לגירוי הקדמה ככל האפשר. לאסוף, לאחסן ולנתח אותות חשמליים באמצעות מייקרו-מחשב מצויד בתוכנת הקלטת ספייק.
הערה: הארקת הגדרת ההקלטה כראוי עשויים לשפר בצורה דרסטית יחס אות לרעש. - לעורר sensilla עם פתרון שליטה (אלקטרוליט בלבד) כדי להבטיח פונקציונליות. רוזן קוצים מתחילים 200 אלפיות שניים הבאים חפץ הגירוי לכל ההכנות.
- אופן אקראי את סדר הכימיקלים מבחן עבור כל הניסויים, למעט מחקרי מנה-תגובה,לחסל את ההטיה. ללימודי מנה-תגובה, לחשוף sensilla להגדלת ריכוזים של חומר כימי ניסיוני. לאפשר מינימום של 3 דקות בין גירויים כדי להבטיח התאוששות נאותה.
הערה: דרישה זו עשויה להשתנות בהתאם לחרקים וsensilla. סף מוגדר כריכוז שבי שגיאה סטנדרטית אינה חופפת עם שגיאת התקן לריכוז הנמוך ביותר שנבדק.
4. בידוד RNA ורצף (איור 2)
- הכן את עלי RNase ללא הדוק שלבש על ידי קירור אותם על קרח יבש לפני עלי RNase ללא ליווי הרקמה disruption.Prepare שמתאימים צינורות כובע הצמד בחוזקה. שמור צינורות איסוף סגורים, אלא אם כן באופן פעיל לנתח כדי למנוע התעבות עודפת.
- באמצעות aspirator המסונן, מקום 30 עד 40 יתושים-הרדים קרים (15 שניות ב-20 ° C במקפיא) על במה קרה ולמיין לפי מין. בעלי חיים מקום מגבים בצד למטה, לתפוס כנפיים לא לפגוע נספחים טעם.
- השימוש בשני זוגות מלקחיים עדינים, לנתח labella זיווג או טרסי מזכרים או נקבות תחת מיקרוסקופ לנתח ולהגביל את ההכללה של רקמות סמוכות.
הערה: 500 labella לזווג תשואה של כ 800-1,000 ננוגרם של mRNA הכולל. 400 טרסי הבודד (5 מגזרים כל אחד) להניב 1,200-1,800 ננוגרם של mRNA הכולל. - עם זוג אחד של התנשמות-מלקחיים, קל לתפוס חוטם יתושים רק הפרוקסימלי לlabella חושף stylets הפנימי. באמצעות זוג אוסף-מלקחיים אחרים, להסיר labella ולהוסיף רקמה לצד שני של צינור איסוף קר.
- עם זוג אחד של מלקחיים, קל לתפוס רגל יתוש בצומת של עצם השוק ומגזר tarsal הראשון. באמצעות זוג מלקחיים אחר, להסיר טרסי ולהוסיף רקמה לצד שני של צינור איסוף קר.
הערה: קח בחשבון את סוגי התאים בממשק של רקמה רצתה ולא רצוי. אמנם חשוב להגביל את הכללת השכנה רקמה, זה חשוב לא פחות לא להשמיט חלקים מרקמה רצויה. Fiמדגם סופי חייב לייצג במדויק את כל האיבר של עניין. צור גבול מדויק עם המלקחיים האחיזה כך שמלקחי אוסף דווקא יכולים לשחרר על ידי גירוד או תופסים רק את הרקמה הרצויה. - מעת לעת, ספין למטה צינור איסוף בקצרה בצנטריפוגה C ° 0 ב9,000 XG לשמור רקמות בחלק תחתון של צינור. אם לחות מצטברת בצינורות איסוף במהלך נתיחה, להוסיף 50uL של מגיב Trizol הקר לכיסוי רקמה שנאספו.
- באמצעות סמן מעבדה אנטי כתם, באופן ברור לתייג מיליליטר RNase ללא אחד 1.5 להצמיד צינור כובע לכל סוג רקמה לאוסף. שימוש במתלת צינור 1.5 מיליליטר וחנקן נוזלי, להקפיא אז לטחון רקמות לאבקה דקה (חתיכות בסדר אם בTrizol). חזור פעם אחת. תביא נפח כולל של Trizol 1 מיליליטר ו resuspend רקמת קרקע על ידי vortexing.
- הוספת 200 ul של כלורופורם ומערבבים היטב. אחרי 5 דקות בטמפרטורת חדר, ספין למטה בצנטריפוגות ב 4 ° C ו11,000 XG במשך 15 דקות. זהירותלהוסיף שכבה מימית ישירות לעמודת מסנן הדנ"א הגנומי. ספין למטה ב11,000 x ז במשך 5 דקות. הוספת נפח שווה של אתנול 70% RNase ללא לזרום דרך ומערבבים על ידי pipet. העבר את הנוזל לעמודת אוסף RNA ולהמשיך הפקת RNA להוראות שסופקו.
- לכמת ולהעריך את טוהר של RNA הכולל על ספקטרופוטומטר דיוק ולהמשיך בכל שיטת רצף RNA סטנדרטית.
5. כמותי RT-PCR אישור של RNA רצף (איור 3)
- בחר גנים רבים ככל האפשר כדי להשוות רמות ביטוי גנים יחסי על פני טווח דינמי, הן בשפע רצף חזה ותפקוד גן chemosensory חזקה.
- זוגות פריימר עיצוב עבור כל גן המטרה להגביר מוצר PCR 100-180 basepair ספציפי. תכלול ההגברה gDNA שאינו ספציפית על ידי הבטחת פריימר אחד לפחות לכל סט משתרע על פני גבול אינטרון. לחלופין, להשתמש בטיפול DNase כדי להפחית זיהום גנטי.
- אסוףרקמת חרקים כפי שתואר בסעיף קודם. לחשב כמה רקמות נדרש לספק מספיק RNA להשלים את כל תגובות qRT-PCR.
הערה: בשלושה עותקים ביולוגיים ותגובות שלושה עותקים טכניים יספק ביטחון מרבי בתוצאות. - לחשב כימות גן יחסי כיעד X - (CT [היעד] -Ct [התייחסות]) עבור כל גן המטרה וממוצע לכל לשכפל, ביולוגי וטכני. השתמש בגן משק (ים) לנרמל ערכי ה- CT בין משכפל ביולוגי ולעקור את היקף ציר Y בהשוואות של ביטוי יחסי.
- להעריך את הדמיון של RNA-seq ומערכי נתוני qRT-PCR באמצעות מבוסס רגרסיה, הליך bootstrap שקילות 9, איטרטיבי מיושם, לנתונים מכל רקמה.
הערה: הליך זה מזהה את "האזור של דמיון" הקטן ביותר שניתן לבנות סביב נתוני RNA-seq וqRT-PCR שנצפו, ולאפשר ביטוי גנים היחסי כפי שהיא נמדדת על ידי qRT-PCR כדי להיחשב מבחינה סטטיסטית שווה ערך למדידה של ביטוי גנים יחסי על ידי RNA-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הקלטות שמץ של פוטנציאל פעולה מAe. sensilla התעורר אצל aegypti (איור 1) להדגים את היעילות של גירוי ישיר עם מגוון רחב של כימיקלים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לכמת את תגובות לכל גירוי כימי על ידי ספירת קוצים של משרעת ומשך נתון על פני טווח זמן סביר (בדרך כלל פחות מ -500 ms). הקלטות Trace חייבת להיות לשחזור בקלות תחת קבוצת נתונה של תנאי ניסוי. אחרת, התגובות הפיזיולוגיות שנצפו עשויות לייצג פנוטיפים נדירים בקרב אנשיו של מין המבחן.
נתוני RNA-seq גלם דורש סינון ומיפוי מדויק לפני שהוצג כRPKM מעוגל (מספר ממופה קורא לאורך kilobase של תמליל למיליון כניסות ממופות) או FPKM (מספר שברי קריאה לאורך kilobase של תמליל למיליון כניסות ממופים) ערכים מספריים (איור 2). ההבחנה ביןשתי שיטות הנורמליזציה RNA-seq אלה שתוארו בשתי יצירות מכוננים 10,11. אחד יתרונות של כולל רצף mRNA הוא היכולת לזהות את הביטוי של משפחות גנים גדולות בו זמנית. ההצגה החזותית של הביטוי של גנים רבים בבת אחת מאפשרת להבנה ייחודית של הכלים המולקולריים לרקמה מסוימת. השוואות בין מינים, שלבי התפתחות או סוגי רקמות יכולות להתבצע במהירות.
משכפל ביולוגי למערכי נתוני RNA-seq עשוי להיות מוגבל על ידי עלות או קושי של אוסף רקמות. qRT-PCR מציע את היכולת לאמת את תת קטנים בסך הכל ביטוי גנים בפחות עלות ודורש RNA מקור פחות. צד ידי השוואות נתונים צד (איור 3 א) לאפשר לביטחון רב יותר בתוצאות RNA-seq, כשתי שיטות להסתמך על chemistries שונה להערכת שפע גן. פונקציות סטטיסטי שקילות (איור 3) להפגין את גבולות ודאות בכל מקרה ומקרה.
איור 1: קלטות אלקטרו מSensillum בינוני שבפית של AE. נקבות aegypti, ששונו מהעבודה שצוטטה 12. עקבות להראות תגובות 100 מ"מ NaCl, 100 מ"מ סוכרוז, IR3535 כינין 1 מ"מ, 0.8% DEET, 0.8% Picaridin, 0.8% ו -0.8% Citronellal. שלושה קוצים עם אמפליטודות או צורות שונות מסומנים, ב או ג. שלושת קוצים אלה מתאים עם שלושה תת-סוגי נוירון חושיים עם רגישויות שונות: מלח, סוכר, ומריר, בהתאמה.
איור 2:. לוח של ביטוי גני קולט התעורר אצל כפי שנקבעו על ידי RNA-seq במשך 8 דגימות רקמה, ששונה מהעבודה שצוטטה 13 תאים בודדים לדווח ערכי RPKM לכל הסברים התעוררו אצל גן, רקמות זכריות (משמאל) ורקמות נשיות (מימין). ערכים מספריים מעוגלים לעשירית הקרוב ביותר. עוצמת צבע חום-המפה מוגבלת בRPKM הגבוה ביותר ואת נקודת האמצע תשתנה לכל משפחת גן בנפרד. יש רק משפחה אחת הגן מוצגת במקרה זה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. השוואת נתוני qRT-PCR ונתוני RNA-seq, שונה מהעבודה שצוטטה 13 (א) כל גן chemoreception של הציר האופקי מיוצג על ידי שתי עמודות נתונים. העמודה השמאלית מייצגת ביטוי יחסי כפי שנקבע על ידי RNA-seq; ערכי RPKM של גני chemoreception חולקו על ידי זה של גן משק Aaeg LAsP ליצור פרופורציות מספריות ברקמה זו. תקיןעמודה מייצגת ביטוי יחסי כפי שנקבע על ידי qRT-PCR. ראשית, ערכי ה- CT לשכפל ביולוגי לגנים labella היו מנורמלים באמצעות Aaeg LAsP כסטנדרט. שנית, לשכפל ערכי ה- CT לכל גן ששמש בחישוב ערכי ביטוי יחסי (יעד E - (CT [היעד] -Ct [התייחסות])). הברים השגיאה מצביעים על סטיית התקן של ערכי ביטוי יחסי מחושבים בנפרד. מערכי נתונים (B) RNA-seq וqRT-PCR הושוו בניתוח נפרד. הצירים האנכיים מייצגים שפע גן יחסי כפי שהודגם על ידי נתוני RNA-seq, עם ערך של 1 מיוחס לגן משק Aaeg LAsP וכל ביטוי גנים האחר שדווח ביחס לערך זה. הצירים אופקיים מייצגים שפע גן יחסי כפי שחוזים qRT-PCR, עם ערך של 1 מיוחס לגן משק Aaeg LAsP וכל ביטוי גנים האחר שדווח ביחס לערך זה. קווים אדומים מייצגים שקילות מדויקות. קווים מקווקווים מייצגים גבולות "האזור של דמיון" למדרון, המחושב על ידי אלגוריתם השקילות הסטטיסטי 9. קווים שחורים מוצקים מייצגים את רגרסיה הריבועים הפחותים של שקילות qRT-PCR לכימות RNA-seq לגני המטרה 12 וגן משק Aaeg LAsP, כל מיוצג על ידי נקודת נתונים המעגל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההיבט המאתגר ביותר של פוטנציאל פעולת הקלטה מsensilla התעורר אצל הוא להחליט איזה תגובות הם "נורמלים". כאשר העסקת קצה Sensillum התעורר אצל אחת הקלטה בפעם הראשונה לניתנו מיני חרקים, מספר הכולל ורגישויות של תאי עצב קולט התעורר אצל (GRNs) הם סביר להניח לא ידוע. הקלטות ראשוניות רבות נדרשות ראשון להחליט את הטווח וריכוזים של כימיקלים לבדיקה. במקרה זה, שהתחלנו עם התצפית כי GRN יחיד הגיב לריכוזים נמוכים של DEET (איור 1). בהמשך לכך, נבחנו תגובות בתוך אותו Sensillum לטווח ריכוזים של כימיקלים ידועים כמרים או מרתיע לחרקים אחרים, וצפו בצורה דומה ספייק ומשרעת (איור 1). תצפיות אלו הציעו כי תת סוג GRN אחת מגיב לתרכובות אלה מרתיעים. לשם השוואה, בדקנו תרכובות ממותקים ידועות לעורר האכלה בmosquitoes כדי לראות אם ספייק דומה התרחש. אנו הבחנו ספייק שונה, גדול יותר במקרה זה. כמו כן, אנו נצפו עלייה חדה שלישית, בגודל בינונית בתגובה לגירוי מלח, מביאים סך מספר תת סוג GRN לשלוש.
הכנות הקלטת אלקטרו בחרקי מטבעם משתנים. sensilla התעורר אצל היעד הוא בדרך כלל קטן מאוד וחייב להיות ממוקם בזווית המתאימה להיכנס אליו עם האלקטרודה ההקלטה בלי לגעת זכוכית לציפורן. להקמת גשר מוליך לתאי עצב התעורר אצל, נקבוביות המסוף של Sensillum חייב להיות פתוח לימפה הכילה להקים קשר ישיר עם אלקטרוליט של האלקטרודה ההקלטה. אנו צפינו בחסימה של פתחי sensilla או על ידי זרה או פסולת מופרשת ומיובשת חומר מתוך Sensillum היעד. כדי להימנע ממכשולים אלה, יש לנקוט בזהירות בעת גידול וטיפול בחרקים להימנע ממגע עם sensilla היעד. בנוסף לChooלשיר חרקים ניזוק, בריאים בדיקה, גורמים ביולוגיים כגון גיל, האכלת מדינה, הזדווגות זמן מדינה וצייטגבר יש לשקול בעת קביעת בקרות כדי להפחית את השונות בהקלטות.
זה עלול להיות קשה להשגת הכנה מגיבה באופן עקבי. ניסויים רבים עשויים להיות נחוצים כדי לשפר את מספיק יחס אות לרעש כדי לפתור קוצים בודדים. וריאציות ניסיוניות על ההכנות האמורות עלולות להוביל לתוצאות טובות יותר. מומלץ לקבוע תגובה חזקה במכשירי ההקלטה שלך למיני הבדיקה שלך באמצעות elicitor ספייק חרקים נפוץ, כמו סוכרוז או כינין. ברגע שהתעורר אצל Sensillum מגיב, התגובות הללו צריכים להיות לשחזור. האורך המינימאלי של זמן בין גירויים צריך להיקבע באופן ניסיוני בחינת דינמיקת ספייק תחת אילוצי זמן שונים. יש להימנע גירוי מוגזם לשמור על בריאות GRN וכדי למנוע השפלה הלימפה Sensillum. במקרה thaרגישות תגובת t יורדת במהירות לאחר הגירוי ראשון, מספר גדול יותר של preps יש לקבל לספק ביטחון כי תגובות אלה הן מבחינה פיזיולוגית אופייניות למין נתון.
המסיסות של כמה כימיקלים מבחן יכולה ליצור קושי עושה אלקטרודות גירוי, כחלק מממסים עלולים להשפיע על פעילות GRN, גם בריכוזים נמוכים סופיים. ניתן לטפל שיקולים אלה בדרך של ניסוי וטעייה ועם בקרות מתאימות. כל חומר ממס היש להוסיף לאלקטרוליט השליטה ופתרונות בדיקה אחרים על מנת להבטיח עקביות של תגובות. חרקים קטנים משתקים, ובכך לספק גישה ישירה ליעד sensilla מבלי לפגוע ברקמות שבירות, עשוי לדרוש ניסוי וטעייה.
המגבלה העיקרית של אלקטרופיזיולוגיה היא ההפרדה המצערת של תגובות עצביות שנצפו ותגובות התנהגותיות במורד הזרם פוטנציאלית. לכן, זה יתרון כדי לבדוק את התגובות לכימיקלים שbeen מוצג לעורר תגובות התנהגותיות ספציפיות כדי לדון במשמעות של התוצאות בהקשר אקולוגי. הקלטות טיפ מאפשרות זיהוי מדויק מאוד של פעילות תאית, מה שהופך את אידאל טכניקה זו להערכת בעלי חיים מהונדסים או אלה מציגים הבדלים פנוטיפי בהתנהגות. הקלטות אלה מציעים גם מידע נוסף על תגובות עצביות, כגון דינמיקה זמנית ומשרעת, מאשר מערכות הסתמכות על כתבים חזותיים של פעילות עצבית. במקרים מסוימים, ניתן לכמת תגובות עצביות בקלות רבה יותר מאשר נתונים התנהגותיים 12.
אוסף רקמות לRNA-seq וqRT-PCR הוא פשוט אך דורש ריכוז ותשומת לב מתמידים לשימור חומר תאי באמצעות אחסון והימנעות מעודף הלחות קר. פעילות RNase יכולה להשפיע על איכות RNA; לכן רקמה רק צריכה לפנות משטחים נקיים לאורך כל אוסף והפקת RNA. למרות שפתרון הבעיות הנדרשות לqRT-PCR is מתועדת היטב, סביר להניח המלכודות להתרחש בתחילת התהליך בעת תכנון פריימרים ובחירת גני המטרה וניהול משק בית. גנים שצפויים לייצג נקודות מחולקות באופן שווה לאורך קו של רמת ביטוי היחסית שימושיים להשוואת RNA-seq ומערכי נתוני qRT-PCR (איור 3). לדוגמא, בחירת גנים לqPCR שמראים ערכי RPKM של 0, 10, 20, 30, וכו ', בהתאמה, מציעים סדר צפוי של שפע להיבדק.
RNA-seq היה מוצלח בהדגשה שפלה לבטא גנים בסקר של רקמות התעוררו אצלנו (איור 2). לבנות גן אמין עבור AE. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) וגן chemoreception לפני זיהוי 14 גרם ביטוי גני הבקיע בקלות יחסית. למטרות אלה, חרקים עם ביאורי גן זמינים ומשפחות גנים מזוהות של עניין הם מערכות מודל בעל ערך. קביעת סף מדויקלביטוי גנים לעומת רעש רקע הוא ספקולטיבי, אבל שיטות של קביעת הפסקות סבירות זמינות 15-17. כאן אנו קובעים רמת RPKM של ביטחון מלא וברמה נמוכה יותר של אמון RPKM ירד מבוסס על תקדים 9 שבו אנו ממוסגרים הדיון בתוצאות שלנו.
בעתיד, אנו מקווים לנתח רקמות chemosensory אחרות בשני היתושים וחרקים חשובים מבחינה כלכלית אחרים להרחיב את הידע של גני תיווך דחיית חרקים שלנו. הקמנו מספר גנים התעוררו אצל מועמד שככל הנראה תיווך תגובות לתרכובות מרתיעות על ידי השוואת רצפי גנים למינים עם נתונים תפקודיים זמינים 13. אנו מייצרים קווים מהונדסים של יתושים חסרים גני chemosensory הבודדים הללו. אנו נשתמש בהקלטות קצה להעריך את תפקידם של גנים אלה על יכולתו של בעל החיים כדי לזהות דוחי ידועים ולהעריך תגובות התנהגותיות של מוטציות אלה לrepellents. במקרה שגנים המועמדים אלה אינם משפיעים באופן משמעותי דחייה, יותר רזולוציה ייתכן שתהיה צורך לקבוע באופן מדויק יותר ביטוי גנים או נוכחות חלבון בSensillum או תא בודד. צנוע קולטני ביטאו עשוי להיות מטרות קריטיות לסינון דוחי רומן, יחד עם עמיתים לקולטנים הביעו בכל מקום. למרבה הצער, בכלאה באתר וimmunolocalization הוכיח קשה מאוד ברקמה התעוררה אצל חרקים 18.
ברגע שהקמנו אילו גנים לתווך תגובות פיסיולוגיות והתנהגויות אלה, אנו עשויים לבטא את הגנים האלה במערכות סלולריים, כי הם ניתנים להקרנת תפוקה הגבוהה של חומרים דוחים מועמד. בגישות סיליקון המשתמשים במודלים מבניים מאי 7 גם להיות שימושי בחיזוי אילו סוגים של תרכובות יהיו לעורר תגובה חזקה מקולטנים ספציפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127 mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5 ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5 ml collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
References
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
- Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
- Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).
- Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
- Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
- Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
- Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
- Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
- Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
- Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
- Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).
