Summary
이 프레젠테이션의 목표는 생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 양육을위한 체외 기술에 증명하는 것입니다. 체외 방법이 풍부한 한천 미디어를 활용하는 반면, 생체 내 방법, 곤충 호스트와이 선충의 양육을 고려하십시오.
Abstract
Photorhabdus가 heterorhabditids의 공생 동안 곤충 병원성 선충 (EPN) (Steinernematidae 및 Heterorhabditidae)은 장내 세균. Xenorhabdus 박테리아가 steinernematids 선충과 관련된 가족의 그람 음성 감마-Proteobacteria와 의존형 협력 관계를 가지고있다. 함께 선충 및 박테리아는 친밀하고 구체적인 협력 곤충 종의 넓은 범위를 죽이는 강력한 살충 복합체를 형성한다. 여기서, 우리는 생체 내에서 일반적 실험실 조건에서이 선충의 양육에 사용되는 체외 기법을 보여줍니다. 또한,이 기술은 EPN 문화의 성공적인 설립을위한 주요 단계를 대표하고 또한 연구에 대한 이러한 생물을 활용, 다른 생물 검정을위한 기초를 형성한다. aposymbiotic (공생 무료) 선충의 생산은 종종 공생의 연구에 대한 심층와 다각적 인 접근 방법에 대한 중요합니다. 이프로토콜은 항생 물질의 첨가를 필요로하지 않고, 표준 실험실 장비와 짧은 시간에 달성 될 수있다. 저장 영역에서의 생존율이 사용 종에 따라 다를 수 있지만,이 방법으로 제조 선충은 비교적 견고. 이 프레젠테이션에 자세히 기술은 P. 주식의 연구소, 애리조나 대학 (투싼, AZ, USA)에 의해 다양한 저자에 의해 기술과 세련된 사람들에 해당합니다. 이러한 기술은 해충 관리 목적을 위해 이들 유기체의 대량 생산에 사용되는 기술의 본체로부터 구별한다.
Introduction
곤충 병원성 선충 (EPN) Steinernema와 Heterorhabditis 종. (Steinernematidae, Heterorhabditidae)과 세균의 공생, Xenorhabdus 및 Photorhabdus 종 (장내 세균)이 육상 동물 - 미생물의 공생 관계 2-4,6,10,19. Xenorhabdus 및 Photorhabdus 종의 응급 모델로 간주됩니다. 또한 감염 청소년 (IJ) 또는 제 3 단계 청소년 8,10,13 감염성로 알려져있는 선충의 유일한 자유 생활 단계의 장내 공생로 숨겨있다. 박테리아 - 선충 쌍 곤충의 광범위한 병원성이고 성공적 생물학적 해충 제어 및 통합 관리 프로그램 6,8 전세계에서 구현되었다.
여기에서 우리는 생체 내에서 자주 실험실 조건에서 EPN의 양육을 위해 행사 될 체외 기술에의 선택을 보여줍니다. 나는N 생체 방법은 선충의 양육에 대한 곤충 호스트를 찬찬히. 일반적으로, 다양한 곤충 주문 (즉 나비목, 딱정벌레 목, 파리목, 등.)의 미성숙 단계에 적합한 호스트로 간주됩니다. 방법은 일반적으로 실험실에서 선충 문화의 유지 보수를 위해 간주됩니다 생체 내. 선충의 대량 생산을 고려할 때이 방법은 적합하지 않을 수 있습니다. 곤충 호스트의 많은 양이 더 많은 시간과 곤충 사육에 관련된 추가 비용을 요구하고이 목적을 위해 요구 될 수있다.
곤충 병원성 선충은 여러 매체에 체외에서 배양 할 수있다. 연구의 목표에 따라 시험 관내 방법에하는 것은 미디어의 공생 박테리아의 통합을 고려하거나. 이 프레젠테이션에서는 EPN의 전파 널리 사용되는 두 가지 방법을 설명합니다. 미디어 성분 공생 박테리아 용 영양소 원을 제공차 선충에 대한 스테롤 소스. 체외 방법은 곤충 호스트없이 장점에게 EPN의 양육을 제공합니다.
적합한 곤충 호스트가 이용할 수없는 경우에 원래 개발 된 체외 미디어의 많은 EPN의 승산을 위해 사용되었다. 그러나 지난 몇 년 동안, 시험관 양육 방법이 널리 EPN과 공생 세균 (17, 19) 사이의 의존형 관계를 이해하는 것을 목표로 연구에 이용되고있다.
이 프레젠테이션에 자세히 기술은 증권 연구소, 애리조나 (투싼, AZ, USA)의 대학에서 다양한 저자에 의해 기술 및 정제에게 해당합니다. 이러한 기술은 해충 관리 목적을 위해 이들 유기체의 대량 생산에 사용되는 기술의 본체로부터 구별한다.
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Protocol
자신의 Symboitic 박테리아와 곤충 병원성 선충의 1 생체 양육
- 100 × 15mm 플라스틱 페트리 접시 전환과 접시의 뚜껑에 종이 필터 (90mm)의 두 디스크를 넣습니다.
- 균등 여과지에 (1,000-2,000 IJ / ㎖의 농도에서) IJ (감염성 유하) 현탁액 1 ㎖를 분산.
참고 : IJS 표면 살균 할 필요가 없습니다. - 접시에 큰 waxmoth의 갤러리아 mellonella의 10 마지막 령 유충을 추가합니다. 목표는 약 100-200 IJS / 유충을 제공하는 것이다.
- 페트리 접시 (그림 1)의 바닥과 뚜껑을 덮고 페트리 접시 레이블을 지정합니다. 다음의 내용을 언급 : 선충 종 명 (알려진 경우); 코드 / 지정을 분리; 날짜 감염 트랩이 설치되었다.
- 느슨하게 밀봉 된 비닐 백에 접시를 놓고 (수분을 보존하기 위해) 및 하나 실온 또는 20 ~ 25 ° C 사이의 배양기에서 어둠에 보관. 매일 요리를 확인
참고 :이 토양에 자연 감염 상태를 모방으로 어둠이 선충의 감염을 용이하게한다. - 3~5일 후, 수정 된 화이트 트랩 7 선충 감염의 징후와 함께 시체를 제거합니다.
참고 : 시체가 부패하는 냄새가있는 경우,이 배양에 성공하지 않은 및 / 또는 오염이 있다는 것을 표시 할 수있다. 선충과 곤충의 새로운 배치와 새로운 감염 챔버를 설정합니다.
자신의 공생 박테리아와 곤충 병원성 선충의 2 체외 양육
- 간 - 신장 한천 방법 9,19
- 작은 조각 (2cm 세 이하)로 간과 신장을 잘라 및 염화나트륨, 한천과 함께 믹서에 넣고 물 300 ㎖의 고기가 액체 펄프, 두꺼운 붙여 넣기 또는 퓨레가 될 때까지 혼합. 그런 다음, 1 L 삼각 플라스크에 혼합물을 전송합니다.
- 블렌더 용기에 물을 최종 200 mL를 넣고에 남은 용지를 가만히 따르다삼각 플라스크. 121 ℃에서 15 분간 고압 증기 멸균한다. 수 고압 증기 멸균 후 한천 쏟아져 전에 터치 식입니다.
참고 :이 매체는 고기 덩어리를 가지고 경향이 있기 때문에 매체의 피펫은 사용하지 않는 것이 좋습니다. - 손 교반 또는 사이의 삼각 플라스크 소용돌이가 더 균일 한 미디어 쏟아지는 동안 5 (또는 6) cm 페트리 접시에 한천 ~ 20 ㎖에 붓고. 필요할 때까지 한천은 4 ° C에서 고화 및 저장 요리를 할 수 있도록 허용
참고 : 고기는 페트리 접시에 부어있는 큰 덩어리를 깨고 불꽃 살균 금속 주걱을 사용합니다.
- 지질 한천 방법 9,19
- 영양 배지, 한천 및 효모 추출물을 함께 혼합하여 지질 한천 배지를 준비하고 2 L 삼각 플라스크에 섞어 붓는다. 121 ° C에서 15 분 동안 H 2 O 및 MgCl2를 • 6H 2 O와 오토 클레이브를 증류 추가.
- 옥수수 기름, 옥수수 시럽 믹스의 무균 혼합을 추가하고 균일하게 기름 방울을 분산하는 것이 저어 또는 격렬하게 소용돌이합니다.
- 5 (또는 6) cm 페트리 접시에 ~ 20 ㎖의 한천을 붓고 필요할 때까지 한천은 4 ° C에서 고화 및 저장 요리를 할 수 있습니다.
- 킬은 지질 한천 플레이트에 공생하는 박테리아를 원하는 및 24 ~ 48 시간 동안 28 ° C에서 번호판을 품어.
참고 : 하룻밤 (12-16 시간) LB의 하위 문화의 100 ~ 200 μl를 확산. - 일 후, 약 0.4 ml의 표면 살균 선충 현탁액 (계란 또는 감염성 청소년)의 추가와 어둠 속에서 또는 22 ± 3 ° C의 배양기에서 실온에서 번호판을 품어.
참고 :이 선충의 성장에 불리한 지나치게 습윤 환경을 만들 수 선충 현탁액의 이상 0.4 ML을 추가하지 마십시오. - 매일 문화를 모니터링합니다. 문화는 약 십이일 (그림 2)에 IJS의 새로운 세대를 생성해야한다.
- 선충이 수정 된 화이트 트랩 접시 (그림 3A)의 측면을 크롤링 볼 때 한천로 아래 접시를 전송 IJS (그림 3B)를 수확 (로스코 외. 12 참조). 매체의 오염을 감소시키기 위해 층류 후드 하에서이 단계를 수행한다.
- 등장에 수정 된 화이트 트랩에서 IJS를 수집하고 모든 매체 파편을 제거하기 위해 IJ 현탁액을 헹군다. 저장소 (차가운 온도 인큐베이터 또는 차가운 방에) 10 ° C에서 멸균 증류수 IJ 또는 필요한 경우 즉시 사용합니다.
참고 :이 연구의 목적에 따라 하나 공생 - 식민지 또는 aposymbiotic 선충으로 판을 시드.
3 시험관 Aposymbiotic의 양육 (공생 무료) 곤충 병원성 선충
- 10 ~ 20에게 G.를 감염 원하는 선충 종의 IJS와 mellonella 유충 (섹션 1 참조). 3 ~ 4 일 후 (이 때 IJS은 성숙한다1 세대 성인) 시체를 수집합니다.
참고 : 성숙과 종에 따라 다릅니다 계란의 적절한 수를 얻기 위해 필요한 여성의 수와 시간. 더 G.를 감염 mellonella 필요한 경우 애벌레 빠르면가 오른쪽 발달 단계에 있는지 여부를 평가하기 위해 48 시간 게시물 감염 등의 해부를 시작합니다. - 생리 식염수 (M9 버퍼 18)와 페트리 접시에 각각 개별적으로 시체를 놓습니다. 좋은 팁 집게로 머리를 잡아 당겨 시신을 해부하다.
- (바람직하게는 L 자형) 미세 바늘로 여성 (내부 계란) 적어도 20은 임신을 수집하고 M9 버퍼 (그림 4A) 10 ㎖를 포함하는 시계 유리에 배치합니다.
- 하기 성분을 고려하여 axenizing 용액을 준비 : 증류수 6.75 ㎖, 1.25 ㎖의 5 N NaOH를, 및 2.25 ml의 시판 표백제 용액을 3 % 차아 염소산로 희석.
참고 : 수산화 나트륨은 솔루션 장갑, 고글 기본 및 보호 적절한 다른입니다옷을 착용해야합니다.
참고 : 표백제 빛으로 감소함에 따라, 신선한 axenizing 솔루션마다를 준비합니다. axenizing 솔루션의 여러 배치를 준비하고 여러 시계 안경 계란의 표면 살균 및 수확을 수행합니다. - M9 버퍼가 완충 용액으로 시계 유리를 작성하고 피펫 버퍼를 빨아과 여성에게 적어도 세 번 씻어. 여성이 시계 유리에 남아 있는지 확인합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 즉시 axenizing 솔루션을 추가하고, 여성은 10 ~ 15 분 이상 더 이상이 솔루션에 남아 할 수 있습니다. (axenizing 솔루션에 저항) 계란은 그대로 유지하면서 붕괴하기 시작 선충 조직을 관찰한다.
- 수동 니들 또는 메스 (도 4B, C)로 절단함으로써, 처리 속도를 높이기 위해 여성의 신체를 방해. , 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 피펫 팅 분해되지 않은 조직을 추가 피함으로써 알을 제거합니다.
참고 : m로 사용모든 마이크로 원심 튜브는 필요에 알을 수집하고 난의 생존력이 axenizing 용액에 노출 장기간에 걸쳐 감소하는 바와 같이, 빨리 작동한다. - "고속 설정"을 사용하여 15 초 동안 소용돌이 튜브는 또한 계란에 부착 된 선충 조직을 제거합니다. 소용돌이를 사용할 수없는 경우 또는 최대 피펫 용액을 여러 번 다운.
- 약 18,000g 2 분 동안 원심 분리하여 펠렛 계란입니다. 계란이 충분히 펠렛을하지 않으면 속도를 높입니다. axenizing 솔루션을 제거하고 1 분 동안 900 XG에 멸균 증류수와 원심 분리기를 한 번 더 microcentrifuge 관을 작성하여 두 번 헹군다.
- 마지막 세척 후, 멸균 증류수 300 ~ 500 ㎕의 계란을 재현 탁하고 멸균 3cm 페트리 접시 또는 멸균 시계 유리에 배치합니다. 계란은 이제 표면 살균 것을 기억하십시오, 그래서 계란의 청결을 유지하기 위해 멸균 피펫 및 / 또는 pippetter 팁과 물을 사용합니다.
- 그들은 (그림 4D) 그대로 확인 해부 현미경 (30-50X 배율)에서 계란을 검사 및 간 - 신장 한천 5cm 플레이트로 전송 (2.1 절 참조)
참고 :이 한천이 과도하게 젖은 것 같은 접시에 계란 서스펜션의 400 개 이상의 μl를 추가하지 마십시오. - 해당 정보를 라벨 판과 28 ° C에서 어둠 속에서 수직으로 저장합니다. 계란의 부화하는 것은 분명 밤새도록해야한다.
참고 : 물이 접시의 뚜껑에 응축 할 수 있지만 1 ~ 2 일 후 증발됩니다. 이 때, 한천의 수분을 유지하고 그것의 건조를 방지하기 위해 비닐 봉지에 접시를 놓습니다. - 주기적으로 요리를 관찰하고 곰팡이 나 세균 오염의 흔적이 어떤 요리를 폐기합니다. IJS가 페트리 접시의 벽을 볼 이주되면, 뚜껑을 제거하여 흰색 변경됨 트랩 (12)과 하부 한천 접시 옮긴다. 로 변형 된 접시를 전송할 때 멸균 조건을 고려D 화이트 트랩 노출 매체의 오염을 방지한다.
- 필요에 따라 화이트 트랩 및 수확 IJ 모니터링을 계속합니다.
참고 : Aposymbiotic 선충 많은 일, 심지어 주 동안 화이트 트랩의 물에 이주 할 것입니다.
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Representative Results
생체 양육 방법은 선충의 성장과 재생을위한 호스트로 살아있는 곤충을 사용합니다. 감염 챔버 곤충 IJS를 노출시키는 효율적인 방법이다. 이는 다른 하나의 곤충 호스트로부터 세균 공생을 벡터 선충의 생활주기에서 유일한 단계이다. 1 감염 챔버뿐만 아니라이 챔버를 구축하는 데 필요한 재료 설정 보여준다. 체외 사육 방법이 허용 EPN 곤충 호스트없이 성장뿐만 아니라 aposymbiotic (공생 무료) 선충의 양육을 위해 구현된다.이 그림은 서로 다른 선충 단계와 지질 한천 플레이트를 보여줍니다. 지질 아가 플레이트는 생물학적 종 개념에 기초 선충 ID를 검증하는 데 필요한 교차 혼성화 실험에서 고려 될 수있다. 간 신장 한천 방법은 원래 Poinar & 토마스 (1966) (14)에 의해 설명되었다. 이 방법은 선충이 성숙 reproduc 할 수 있습니다곤충 호스트없이 전자와 공생 세균없이 후면 선충에 사용할 수 있습니다 (즉, aposymbiotic 선충을 생산). 이 방법의 단점은 원하지 않는 박테리아 또는 곰팡이가 성장하는 것을.도 3a IJS는 판의 측면에 크롤과 간장 신장 아가 플레이트를 도시하므로 인해 풍부한 자연 오염되는 경향이 있다는 것이다. 이 단계에서 페트리 접시의 바닥 부분이 변경됨 화이트 트랩으로 전송 될 수있다.도 3b는 IJS 자손의 수확 변경됨 백색 트랩 Steinernema 선충과 간장 신장 판을 보여준다.도 4a를 포란와 시계 접시를 도시 이전에 자신의 axenization에 Steinernema 암컷. 그림 (b)는 해부 바늘 여성의 중단을 표시합니다. 그림 4C는 axenizing 용액에 여성을 중단 보여줍니다. 그림 4D는 선충 Steinernem의 손상 달걀을 보여줍니다carpocapsae.
EPN의 생체 내 양육에 대한 감염 챔버의 그림 1 세트입니다. 최고 행은 5cm 페트리 접시 및 필터 종이를 보여줍니다. 맨 아래 행은 10cm 페트리 접시 및 필터 종이를 표시합니다. 곤충 애벌레의 공지 사항 번호는 각 감염 챔버에 추가됩니다.
EPN의 체외 양육에 대한 그림 2 지질 한천 방법은. 이미지가 성인 선충이 매체에 개발을 가진 접시의 확대 (20 배 확대)를 보여줍니다.
그림 3 간 - 신장 한천 플레이트. 왼쪽의 이미지는 선충의 성공적인 성장을 가진 접시를 보여줍니다. 접시의 측면에 크롤 링 선충을 알 수 있습니다. 이미지 B는 IJ 선충의 수확을 위해 수정 된 화이트 함정에 배치 간 - 신장 한천 플레이트를 보여줍니다.
axenizing에서 임신하는 여성 그림 4 시계 유리 솔루션입니다. 이미지는 axenizing 솔루션에 임신하는 여성을 보여줍니다. 이미지 B는 해부 바늘 여성의 연마를 보여줍니다. 이미지 C 표시는 여성을 중단. 이미지 D는 선충 Steinernema의 carpocapsae의 손상 달걀을 보여줍니다.
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Discussion
적합한 호스트를 사용하여 EPN의 생체 양육의 성공을위한 핵심 요소이다. 일반적으로, 모두 steinernematids 및 heterorhabditids는 재현 할 수 성공적으로 더 큰 왁스 나방, 갤러리아 mellonella (나비목 : Pyralidae)의 유충에 자신의 라이프 사이클을 완료합니다. 그러나, 다른 가족 및 / 또는 명령에서 다른 종의 곤충이 고려 될 수있다. 현재 설명 선충 종의 몇몇은 특정 곤충 호스트에 대해 특이성을 갖는 것으로 알려져있다. 예를 들어, S. kushidai 및 S. scarabaei는 나비목 유충에 매우 독성이 없으며, 같은 실험실에서 성공적인 양육을위한 풍뎅이 딱정벌레 유충 (풍뎅이과)로 coleopteran 유충이 필요합니다. 또 다른 종, S. scapterisci는 같은 귀뚜라미 또는 땅강아지 등 orthopteran 곤충을 좋아한다.
적합한 호스트를 사용할 수 없거나 실험 상태에 따라 필요할 때, 시험관 방법은 EP의 양육을 위해 이용 될 수있는 경우N. 이러한 방법은 선충과 세균의 공생을위한 영양소의 풍부한 소스를 제공하는 용지를 사용합니다. 이 프레젠테이션에서 우리는 또는 공생 세균없이 성공적인 성장과 EPN의 재생에 이용 될 수있는 한천 (간 - 신장 및 지질)의 두 가지 유형을 설명했다.
사용자는 간 - 신장 한천 리치 미디어이므로 쉽게 오염되어 있는지 알고 있어야합니다. 무균 기술은 절차의 모든 단계에서 axenized 계란과 접종 판을 모두 취급하는 것이 좋습니다. 세균이나 곰팡이에 오염 된 아르 판은 즉시 폐기해야합니다.
aposymbiotic Steinernema IJS를 양육하는 경우가 Xenorhabdus 박테리아를 항구 수 있으므로,주의가 제대로 여성 선충 조직을 용해하기 위해주의를 기울여야한다. 또한, IJ 실제로 공생 세균이 없는지 확인하기 위해, 우리는 휴대용 모토로 LB에서 갓 수확 IJS의 시료의 분쇄 추천(Heungens 외. 2002)에 따라 7 유를 연구 중심 및 NBTA 미디어 1 위에 정지를 접시. 박테리아 식민지가 (하룻밤 배양 후) 발견되면 그것은 가난한 axenization 기술의 표시 또는 오염의 결과가 될 것입니다.
aposymbiotic Steinernema 선충의 양육은 절차와 실험의 다양한 고려 될 수있는 기술이다. 독자들은 여러 세대에 걸쳐 공생없이 양육 Steinernema 선충의 영향이 세대의 시간을 통해 선충의 체력과 생존에 영향을 미칠 수 있다는 것을 알고 있어야합니다. 몇몇 연구는 자연 시스템 5,11,15-17에서의 페어링의 필요성을 제안한다. 그러나, 이들 연구는 종의 제한된 수 행해졌 또한 탐사가 필요하다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 주식 랩의 과거 회원을 감사드립니다 : 명나라 민 리, 캐서린 Plichta, 빅토리아 미란다 - 톰슨과 샘 규 김이 프로토콜의 많은 개선에 대한 그들의 공헌. 이 작품은 SP 주식에 대한 국립 과학 재단 보조금 IOS-0840932 및 IOS-0724978에 의해 부분적으로 투자되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
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