Summary
Målet med denne presentasjonen er å vise in vivo og in vitro teknikker for oppdrett av entomopathogenic nematoder. In vivo metoder vurdere oppdrett av disse nematoder med et insekt vert, mens in vitro metoder utnytte rik agar medier.
Abstract
Entomopathogenic nematoder (UPN) (Steinernematidae og Heterorhabditidae) har en mutualistic samarbeid med Gram-negative Gamma-Proteobacteria i familien Enterobacteriaceae. Xenorhabdus bakteriene er assosiert med steinernematids nematoder mens Photorhabdus er symbionter av heterorhabditids. Sammen nematoder og bakterier danner en potent insekticid kompleks som dreper et bredt spekter av insektarter i en intim og spesifikk samarbeid. Heri viser vi in vivo og in vitro-teknikker som vanligvis anvendes ved oppdrett av disse nematoder under laboratorieforhold. Videre disse teknikkene representerer viktige skritt for vellykket etablering av EPN kulturer og også danne grunnlag for andre biologiske tester som utnytter disse organismene for forskning. Produksjonen av aposymbiotic (symbiont-free) nematoder er ofte avgjørende for en grundig og mangefasettert tilnærming til studiet av symbiose. Detteprotokollen krever ikke tilsetning av antibiotika, og kan oppnås i løpet av kort tid med standard laboratorieutstyr. Nematoder som produseres på denne måte er forholdsvis robuste, selv om deres overlevelse i lagring, kan variere avhengig av arten som brukes. Teknikkene er beskrevet i denne presentasjonen tilsvarer de som er beskrevet av ulike forfattere og raffinert av P. Stock Laboratory, University of Arizona (Tucson, Arizona, USA). Disse teknikkene er adskilt fra hoveddelen av teknikker som benyttes i masseproduksjon av disse organismene for skadedyrstyringsformål.
Introduction
Entomopathogenic nematoder (UPN) Steinernema og Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) og deres bakterielle symbionter, Xenorhabdus og Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) er ansett som et emergent modell av terrestriske dyre mikrobe symbiotiske forhold 2-4,6,10,19. Xenorhabdus og Photorhabdus SPP. er næret som symbionter i tarmen av det eneste frittlevende stadium av nematoder, også kjent som den infeksiøs juvenile (IJ) eller 3. etappe infeksiøs juvenile 8,10,13. Bakterien-nematode paret er patogene for et bredt spekter av insekter og har med hell blitt implementert i biologisk bekjempelse og integrert plantevern ledelse programmer over hele verden 6,8.
Heri vi viser et utvalg av in vivo og in vitro-teknikker som er vanlige utøves for oppdrett av EPN under laboratorieforhold. In vivo metoder tenke et insekt vert for oppdrett av nematoder. Vanligvis er umodne stadier av ulike insekt bestillinger (dvs. Lepidoptera, Coleoptera, tovinger, etc.) Anses egnede verter. In vivo metoder er vanligvis betraktet for vedlikehold av nematode kulturer i laboratoriet. Denne metoden kan ikke være egnet når de vurderer masseproduksjon av nematoder. Store mengder insekt verter kan være nødvendig for dette formålet krever mer tid og ekstra kostnader knyttet til insekt oppdragelse.
Entomopathogenic nematoder kan også dyrkes in vitro ved flere medier. Avhengig av målet med studien, in vitro metoder kan eller vurdere inkorporering av det symbiotiske bakterier i media. I denne presentasjonen, beskriver vi to vanlige metoder for forplantning av EPN. Ingrediensene i media gi en kilde til næringsstoffer for det symbiotiske bakterien ennd en sterol kilde for nematoder. In vitro-metoder tilbyr fordelen oppdrett av EPN uten et insekt vert.
Opprinnelig ble mange av in vitro media utviklet brukes for multiplikasjon av EPN når egnede insekt verter er ikke tilgjengelig. Men de siste årene har in vitro oppdrettsmetodene blitt mye brukt i forskning som mål å forstå mutualistic forholdet mellom EPN og deres symbiotiske bakterier 17,19.
Teknikkene er beskrevet i denne presentasjonen tilsvarer de som er beskrevet av ulike forfattere og raffinert av Stock Laboratory, University of Arizona (Tucson, Arizona, USA). Disse teknikkene er adskilt fra hoveddelen av teknikker som benyttes i masseproduksjon av disse organismene for skadedyrstyringsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vivo oppdrett av Entomopathogenic nematoder med sine Symboitic Bakterier
- Invertere en 100 x 15 mm plast petriskål og legg to skiver av filterpapir (90 mm) i lokket av fatet.
- Jevnt fordele 1 ml av IJ (infektive yngel) suspensjon vann (ved en konsentrasjon på 1000-2000 IJ / ml) på filterpapiret.
MERK: IJs trenger ikke å være overflate steriliseres. - Legg til 10 siste stadium larver av større waxmoth Galleria mellonella til parabolen. Målet er å gi ca 100-200 IJs / larve.
- Dekk lokket med bunnen av petriskålen (figur 1), og merker den petriskål. Nevne følgende informasjon: nematode artsnavnet (hvis kjent); isolere kode / betegnelse; dato infeksjon fellen ble satt.
- Sett fatet i en løst forseglet plastpose (for å bevare fuktighet) og holde den i mørket på enten romtemperatur eller i en inkubator mellom 20-25 ° C. Sjekk retter daglig
MERK: Darkness forenkler nematode infeksjon, som det etterligner naturlig infeksjon forholdene i jorda. - Etter 3-5 dager, fjerner kadavre med tegn på nematode smitte til en modifisert Hvit felle 7.
MERK: Hvis kadavrene lukte råtten, kan dette være en indikasjon på at dyrking var ikke vellykket, og / eller det var forurensning. Sett en ny infeksjon kammer med en ny gruppe med nematoder og insekter.
2. In vitro oppdrett av Entomopathogenic nematoder med sine symbiotiske bakterier
- Liver-nyre Agar Metode 9,19
- Hakk lever og nyre i små biter (2 cm 3 eller mindre) og plasser i en blender med NaCl, agar og 300 ml vann, og bland til kjøttet blir en flytende masse, tykk pasta eller puré. Deretter overføres blandingen til en 1 L Erlenmeyer-kolbe.
- Legg de siste 200 ml vann til blender fartøyet og dekanter eventuelle gjenværende materiale iErlenmeyer kolbe. Autoklaver i 15 min ved 121 ° C. Etter autoklave tillate agar å kjøle å røre før strømme.
MERK: Pipettering av medium anbefales ikke fordi dette mediet har en tendens til å ha biter av kjøtt. - Hell ~ 20 ml agar på 5 (eller 6) cm petriskåler mens hånden omrøring eller virvlende erlenmeyerkolben mellom pours for en mer homogen medier. Tillat agar å stivne og lagre retter ved 4 ° C inntil nødvendig
MERK: Bruk en flamme-sterilisert metall slikkepott for å bryte opp noen store biter av kjøtt helles i petriskål.
- Lipid Agar Metode 9,19
- Forbered lipid agarmedium ved å blande sammen næringsbuljong, agar og gjærekstrakt og hell blande inn i en 2 liters Erlenmeyer-kolbe. Tilsett destillert H2O og MgCl 2 • 2 6H O og autoklav i 15 min ved 121 ° C.
- Legg steril blanding av maisolje og maissirup mix og røre eller virvle kraftig og ofte for å spre oljedråper jevnt.
- Hell ~ 20 ml agar på en 5 (eller 6) cm petriskåler og la agar å stivne og lagre retter ved 4 ° C inntil nødvendig.
- Serie ønsket symbiotiske bakterier på lipid-agar-plate og platene inkuberes ved 28 ° C i 24-48 timer.
MERK: Spre 100-200 mL av natten (12-16 timer) LB subkultur. - Dagen etter, tilsett ca 0,4 ml av overflatesterilisert nematode suspensjon (egg eller infektive yngel), og platene inkuberes ved romtemperatur i mørke eller i en inkubator ved 22 ± 3 ° C.
MERK: Ikke legg til mer enn 0,4 ml nematode suspensjon som det kan skape en veldig våt miljø som er ugunstige for nematode vekst. - Monitor kulturer daglig. Kulturer skal produsere en ny generasjon av IJs i ca 12 dager (figur 2).
- Overfør nedre tallerken med agar når nematoder blir sett krypende sider av formen (figur 3A) til en modifisert hvitt felle (se Orozco et al. 12) for å høste IJs (figur 3B). Utfør dette trinnet under en laminær hette for å redusere forurensning av media.
- Samle IJs fra den modifiserte Hvit felle på fremveksten og skyll IJ suspensjon for å fjerne ethvert medium rusk. Lagres IJ i sterilisert destillert vann ved 10 ° C (i en kald-temperatur inkubator eller kaldt rom) eller bruk umiddelbart ved behov.
MERK: Avhengig av målet med studien, frø platene med enten symbiont-kolonisert eller aposymbiotic nematoder.
3. In vitro oppdrett av Aposymbiotic (Symbiont-fri) Entomopathogenic nematoder
- Infisere 10-20 G. mellonella larver med IJs av de ønskede nematode arter (se punkt 1). Etter 3 eller 4 dager (på dette tidspunktet IJs burde ha modnettil første generasjons voksne) samle kadavre.
MERK: Tid til forfall og antall kvinner som trengs for å få et tilstrekkelig antall egg vil variere fra art. Infisere mer G. mellonella larver om nødvendig og begynne disseksjoner så tidlig som på 48 timers post-infeksjon for å vurdere om de er i riktig utviklingsstadiet. - Plasser hver kadaver individuelt i en petriskål med saltoppløsning (M9 buffer 18). Dissekere et kadaver ved å trekke hodet med en fin spiss tang.
- Samle minst 20 gravid (med egg inni) hunner med en tynn nål (L-form helst) og plassere dem i en klokke glass som inneholder 10 ml M9 buffer (Figur 4A).
- Tilbered en axenizing løsning ved å vurdere de følgende bestanddeler: 6,75 ml destillert vann, 1,25 ml 5 N NaOH og 2,25 ml kommersielt tilgjengelig blekeløsningen fortynnet til 3% hypokloritt.
MERK: NaOH er en grunnleggende løsning-hansker, briller og annet egnet beskyttendeklær må benyttes.
MERK: Forbered fersk axenizing løsning hver gang, som blekemiddel forringer i lys. Forbered flere partier axenizing løsning og utføre overflaten sterilisering og høsting av egg i flere ur briller. - Skyll hunner i det minste tre ganger med M9 buffer fylling urglass med bufferoppløsning og suger opp buffer med en pipette. Sørg for at hunnene forblir i urglass. Gjenta dette trinnet to ganger til.
- Umiddelbart tilsett axenizing løsning og tillate hunnene til å forbli i denne løsningen for ikke mer enn 10-15 min. Observer nematode vev begynner å gå i oppløsning mens egg (som er resistente mot axenizing løsning) forblir intakt.
- Forstyrre manuelt kvinnekropper for å fremskynde prosessen, ved å klippe dem med en nål eller en skalpell (Figur 4B, C). Fjern egg ved å pipettere dem inn i 1,5 ml mikrosentrifugerør, unngå å legge noen uoppløste vev.
MERK: Bruk som meventuelle mikrosentrifugerør som er nødvendig for å samle egg og arbeide raskt, som levedyktigheten av eggene vil avta i løpet av en lengre periode med eksponering for axenizing løsning. - Vortex rør for 15 sek ved å bruke "high speed innstilling" for ytterligere å fjerne nematoder vev festet til eggene. Alternativt, hvis en vortex er utilgjengelig, pipettér opp og ned i løsningen flere ganger.
- Pellet egg ved sentrifugering ved ca 18 000 g i 2 min. Øk hastigheten hvis eggene ikke tilstrekkelig pellet. Fjern axenizing løsning og skyll to ganger ved å fylle mikrosentrifugerør med sterilt destillert vann og sentrifugering en gang til ved 900 x g i 1 min.
- Etter siste vask, resuspender egg i 300-500 mL sterilt destillert vann og legg dem i en steril 3 cm petriskål eller sterilisert urglass. Husk at egg er nå overflate sterilisert, så bruk sterile pipetter og / eller pippetter tips og vann for å opprettholde renheten av egg.
- Undersøke egg under a dissekere mikroskop (30-50X forstørrelse) for å bekrefte at de er intakte (figur 4D) og overføre dem til en 5 cm plate med lever-nyre agar (se kapittel 2.1)
MERK: Ikke legg til mer enn 400 mL av egg suspensjon på platene som det vil gjøre agar veldig våt. - Etikett plater med riktig informasjon og lagre dem stående i mørke ved 28 ° C. Klekking av egg bør være tydelig over natten.
MERK: Vann kan kondensere på lokket av fatet, men det vil fordampe etter 1 eller 2 dager. På denne tiden, sett formen i plastpose for å holde på fuktigheten i agar og unngå sin tørking. - Observere retter med jevne mellomrom og kast eventuelle retter som viser tegn på sopp eller bakteriell forurensning. Når IJs ses migrerer opp veggen av petriskålen, fjernes lokket og overføre den nederste tallerken med agar til en modifisert hvitt felle 12.. Tenk sterile forhold ved overføring av fatet inn i modified hvitt felle for å unngå forurensning av den eksponerte media.
- Fortsett å overvåke den hvite feller og høste IJ etter behov.
MERK: Aposymbiotic nematoder vil fortsette å migrere i vannet av White felle for mange dager og uker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo oppdrett metoden bruker levende insekter som verter for nematode vekst og reproduksjon. Infeksjon kamre er en effektiv metode for å utsette insekter IJs. Dette er den eneste fase i de nematoder livssyklus som vektorer i bakterie symbionter fra en insektverten til en annen. Figur 1 viser den er satt opp for en infeksjon kammeret samt materialer som trengs for å bygge dette kammer. In vitro stell metoder tillater EPN til å vokse uten et insektverts men er også implementert for oppdrett av aposymbiotic (symbiont-fri) nematoder. Figur 2 viser et lipid agarplate med forskjellige nematoder stadier. Lipid agarplater kan også vurderes i krysshybridisering testene som er nødvendig for å validere nematode identitet basert på den biologiske arter konsept. Leveren nyre agar fremgangsmåte ble opprinnelig beskrevet av Poinar & Thomas (1966) 14. Denne metoden gjør at nematoder å modne og reproduserendee uten en insektverten og kan brukes til å bakre nematoder uten deres symbiotiske bakterier (dvs. å produsere aposymbiotic nematoder). En ulempe med denne metoden er at det er utsatt for forurensning på grunn av sin rike natur, slik at uønskede bakterier eller sopp til å vokse. Figur 3A viser lever-nyre-agarplater med ijs kryp på siden av platen. På dette stadiet den nedre delen av petriskålen, kan overføres til en modifisert hvitt felle. Figur 3B viser en lever-nyre-plate med Steinernema nematoder i en modifisert hvitt felle for høsting av IJs avkom. Figur 4A viser et urglass med rognsti Steinernema hunner før deres axenization. Figur 4B viser forstyrrelse av hunnene med en dissekere nål. Figur 4C viser forstyrret hunner i axenizing løsning. Figur 4D viser et intakt egg av nematode Steinernemen carpocapsae.
Figur 1. Still opp av en infeksjon kammer for in vivo oppdrett av EPN. Øverste raden viser en 5 cm petriskål og filterpapir. Den nederste raden viser en 10 cm petriskål og filterpapir. Legg merke til antall insektlarver tilsatt til hvert kammer infeksjon.
Figur 2. Lipid agar metode for in vitro oppdrett av EPN. Bildet viser et nærbilde (20X forstørrelse) av en tallerken med voksne nematoder utvikler på mediet.
Figur 3. Liver-nyre agar plate. Image En til venstre viser en tallerken med vellykket vekst av nematoder. Legg merke nematoder krypende på siden av fatet. Bilde B viser en lever-nyre agar plate plassert i en modifisert Hvit felle for innhøsting av IJ nematoder.
Figur 4. Watch glass med av gravid kvinner i axenizing løsning. Bilde A viser av gravid kvinner i axenizing løsning. Bilde B viser sliping av hunnene med en dissekere nål. Bilde C viser forstyrret hunner. Bilde D viser et intakt egg av nematode Steinernema carpocapsae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med en egnet vert er en nøkkelfaktor for en vellykket in vivo oppdrett av EPN. Vanligvis kan både steinernematids og heterorhabditids reprodusere og fullføre sin livssyklus i larver av større voks møll, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Imidlertid kan andre insektarter fra forskjellige familier og / eller ordrer vurderes. Et par av de for tiden beskrevne nematode arter er kjent for å ha spesifisitet for et spesielt insekt-verten. For eksempel, S. kushidai og S. scarabaei er ikke veldig virulente til lepidopteran larver, og trenger biller larver som skarabé bille larver (Scarabaeidae) for vellykket oppdrett i laboratoriet. En annen art, S. scapterisci, foretrekker orthopteran insekter som gresshopper eller jordkreps.
Når en passende vert er ikke tilgjengelig, eller når eksperimentelle forhold krever det, kan in vitro metoder benyttes for oppdrett av EPN. Disse metodene bruker media som tilbyr en rik kilde til næringsstoffer for nematoder og deres bakterielle symbionter. I denne fremstillingen er beskrevet vi to typer agar (lever-nyre-og lipid) som kan utnyttes for vellykket vekst og reproduksjon av EPN med eller uten deres symbiotiske bakterier.
Brukere bør være oppmerksom på at leveren-nyre agar er en rik media, og er derfor lett forurenset. Steril teknikk er anbefalt i å håndtere både axenized egg og de inokulerte plater under alle trinn i prosedyren. Plater som er forurenset med bakterier eller sopp bør kastes umiddelbart.
Når oppdra aposymbiotic Steinernema IJs, bør man sørge for å riktig lyse den kvinnelige nematode vev, som de kunne huse Xenorhabdus bakterier. Også, for å validere at IJ er faktisk fri for symbiotiske bakterier, anbefaler vi sliping av en prøve av nyhøstede IJs i LB med en håndholdt motor-drevet stampe som per (Heungens et al. 2002) 7 og plate suspensjon på NBTA media en. Hvis bakteriekolonier blir funnet (etter inkubering over natten) vil det enten være en indikasjon på en dårlig axenization teknikk eller resultatet av forurensning.
Oppdrett av aposymbiotic Steinernema nematoder er en teknikk som kan også vurderes i et bredt spekter av prosedyrer og eksperimenter. Leserne bør være oppmerksom på at effekten av oppdrett Steinernema nematoder uten symbionter over flere generasjoner kan ha en innvirkning på nematode kondisjon og overlevelse enn generasjonstid. Noen studier tyder på nødvendigheten av deres sammenkobling i naturlige systemer 5,11,15-17. Imidlertid har disse studiene er gjort på et begrenset antall arter og videre leting er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke tidligere medlemmer av Stock lab: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson og Sam-Kyu Kim for deres bidrag til forbedring av mange av disse protokollene. Dette arbeidet ble finansiert delvis av National Science Foundation Grant IOS-0840932 og IOS-0724978 til SP Stock
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M. The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis. Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).
- Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. Entomopathogenic Nematology. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).
- Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera). Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , CRC Press. Raton, FL. (1990).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. Manual of techniques in insect pathology. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).
- Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp. Nematologica. 39, 385-399 (1993).
- Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (89), (2014).
- Poinar, G. O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda). Nematologica. 12, 105-108 (1966).
- Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).
- Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).
- Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus). BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).
- Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).
