Summary
Bu sunumun amacı in vivo ve entomopatojen nematodların yetiştirmesi için in vitro teknikleri göstermektir., In vitro yöntemler zengin ağar medya kullanmak ise in vivo yöntemler, bir böceğin bu nematodların yetiştirme düşünün.
Abstract
Photorhabdus heterorhabditids arasında simbiont ise entomopatojenik nematod (EPN) (Steinernematidae ve Heterorhabditidae) Enterobacteriaceae. Ksenorhabdus bakteri steinernematids nematodlar ile ilişkili aile, Gram-negatif Gamma Proteobacteria bir Mutualistik ortaklık var. Birlikte nematodlar ve bakteriler, bir yakın ve belirli ortak olarak böcek türlerinin geniş bir yelpazede öldüren da güçlü bir insektisid kompleksi oluşturur. Bu yazıda, in vivo ve yaygın laboratuar koşullarında bu nematodlarının yetiştirilmesinde kullanılan in vitro teknikler göstermektedir. Dahası, bu teknikler EPN'dir kültürlerin başarılı kurulması için önemli adımlar temsil ve ayrıca araştırma bu organizmaları kullanan diğer biyoanalizlerin için temelini oluşturur. Aposymbiotic (symbiont-serbest) nematod üretim genellikle ortak yaşam çalışmaya derinlemesine bir ve çok yönlü bir yaklaşım için önemlidir. BuProtokol antibiyotik eklenmesini gerektirmez ve standart laboratuar ekipmanı ile kısa bir miktarda yapılabilir. Muhafaza açısından hayatta kalma kullanılan türlere bağlı olarak değişebilir, ancak bu şekilde üretilen Nematodlar nispeten sağlamdır. Bu sunumda ayrıntılı teknikler P. Hazır Laboratuvarı, Arizona Üniversitesi (Tucson, AZ, ABD) çeşitli yazarlar tarafından açıklanan ve rafine karşılık gelir. Bu teknikler, haşere yönetimi için, bu organizmaların seri üretiminde kullanılan tekniklerin gövdesinden ayrıdır.
Introduction
Entomopatojenik nematodlar (EPN) Steinernema ve Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterohabditidae) ve bakteriyel simbiont, Ksenorhabdus ve Fotorhabdus spp (Enterobacteriaceae) karasal hayvan-mikrop simbiyotik ilişkiler 2-4,6,10,19. Ksenorhabdus ve Fotorhabdus spp acil bir model olarak kabul edilir. Ayrıca, enfeksiyon juvenil (IJ) veya 3. aşamasında genç 8,10,13 infektif olarak bilinen nematodların sadece serbest yaşayan aşamasının bağırsakta simbiont olarak harbored. Bakteri-nematod çifti böceklerin geniş bir yelpazede için patojen olduğunu ve başarılı biyolojik kontrol ve entegre zararlı yönetimi programlarında, dünya çapında 6,8 uygulamaya konmuştur.
Bu yazıda in vivo ve sık sık laboratuar koşullarında EPN beslenmesinde icra in vitro teknikleri bir seçim göstermektedir. Iin vivo koşullarda yöntem nematodların yetiştirmesi için bir böcek ev sahibi tasarlamaktadırlar. Genellikle, çeşitli böcek emir (yani Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, vb.) Olgunlaşmamış aşamaları uygun ana olarak kabul edilir. Yöntemler genellikle laboratuvarda nematod kültürlerin bakım için kabul edilir in vivo. Nematodların seri üretim söz konusu olduğunda, bu yöntem uygun olmayabilir. Haşere büyük miktarlarda daha fazla zaman ve böcek yetiştirme ile ilgili ek bir maliyet gerektiren bu amaç için gerekli olabilir.
Entomopatojenik nematodlar da çeşitli medya üzerinde in vitro kültür edilebilir. Çalışmanın amacına bağlı olarak; in vitro yöntemler medyada simbiyotik bakterilerin katılmasını düşünebilirsiniz ya. Bu sunumda, EPN yayılması için iki yaygın kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. Medyanın maddeler simbiyotik bakteri a için besin kaynağı sağlamaknd nematod için bir sterol kaynağı. in vitro yöntemler bir böcek konak olmadan Advantage EPN bir yetiştirme sunuyoruz.
Uygun böcek ana mevcut olmadığında Başlangıçta, gelişmiş in vitro ortam maddesinin bir çok EPN çoğalması için kullanılmıştır. Ancak, son yıllarda, in vitro yetiştirme yöntemleri yaygın olarak EPN ve simbiyotik bakteriler 17,19 arasındaki Mutualistik ilişkiyi anlamak amacıyla araştırma istihdam haline gelmiştir.
Bu sunumda ayrıntılı teknikler Stock Laboratuvarı, Arizona (Tucson, AZ, ABD) Üniversitesi tarafından çeşitli yazarlar tarafından açıklanan ve rafine karşılık gelir. Bu teknikler, haşere yönetimi için, bu organizmaların seri üretiminde kullanılan tekniklerin gövdesinden ayrıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Onların Symboitic Bakteriler Entomopatojenik Nematodlar 1. in vivo Yetiştiriciliği
- 100 x 15 mm'lik bir plastik Petri kabı ters çevirin ve çanak kapakta filtre kağıdı (90 mm) iki diskler yerleştirin.
- Eşit olarak, filtre kağıdı üzerinde (1.000-2.000 IJ / ml 'lik bir konsantrasyonda), IJ (infektif çocuklar) su süspansiyonundan 1 ml dağıtın.
Not: IJs yüzeyi sterilize edilmiş olması gerekmez. - Çanak daha waxmoth Galleria mellonella 10 son dönem larvaları ekleyin. Hedefi, yaklaşık 100-200 IJs / larva sağlamaktır.
- Petri kabı (Şekil 1) alt kısmı ile kapağı kapalı Petri etiketleyin. Aşağıdaki bilgileri Mansiyon: nematod türlerinin adı (biliniyorsa); kodu / atama izole; tarih enfeksiyon tuzak kuruldu.
- Bir gevşek şekilde kapalı plastik bir torba içine tabağına yerleştirin (nem muhafaza etmek için) ve ya oda sıcaklığında ya da 20-25 ° C arasında bir kuluçka makinesi içinde karanlıkta tutun. Günlük yemekler edin
NOT: topraktaki doğal enfeksiyon koşullarını taklit Darkness, nematod enfeksiyonu kolaylaştırır. - 3-5 gün sonra, modifiye Beyaz tuzak 7 nematod enfeksiyon belirtileri ile kadavra çıkarın.
NOT: kadavra çürük kokusu varsa, bu kültür başarılı değildi ve / veya kirlenme olduğunu bir göstergesi olabilir. Nematod ve böcekler yeni bir parti ile yeni bir enfeksiyon odasını ayarlayın.
Onların Simbiyotik Bakteriler Entomopatojenik Nematodlar 2. in vitro Yetiştiriciliği
- Karaciğer-böbrek Agar Yöntemi 9,19
- Küçük parçalar (2 cm3 veya küçük) olarak karaciğer ve böbrek doğranır ve NaCl, ağar bir karıştırıcı içine koyun ve 300 ml su ve sıvı et hamuru, kalın bir macun veya püre haline gelene kadar karıştırılır. Daha sonra, 1 litrelik bir Erlenmeyer şişesine karışımı aktarın.
- Blender kabına suyun nihai 200 ml ilave edilir ve herhangi bir geri kalan ortam süzünBir Erlenmeyer şişesi. 121 ° C'de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır. Izin Otoklavlamadan sonra ağar dökülmeden önce dokunmak soğumaya.
NOT: Bu orta et parçalarını sahip olma eğilimi gösterir, çünkü orta Pipetleme tavsiye edilmez. - Elle ya da karıştırma ile Erleni dönen daha homojen bir ortam dökülür, 5 (veya 6) cm Petri kapları üzerine agarı ~ 20 ml dökün. Kadar gerekli ağar 4 ° C'de katılaşır ve mağaza yemekleri izin ver
NOT: Etin Petri kabı içine dökülmüş herhangi bir büyük parçalarını kırmak için bir alev sterilize metal bir spatula kullanın.
- Lipit 9,19 ağar yöntemi
- Besleyici et suyu, agar ve maya özütü karıştırılarak bir yağ agar ortamı hazırlamak ve 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içine karıştırmak dökün. 121 ° C'de 15 dakika boyunca H2O ve MgCl2 • 6H 2 O ve otoklav damıtılmış ekleyin.
- Mısır yağı ve mısır şurubu karışımı steril karışımı eklenir ve eşit bir şekilde dağıtmak için yağ damlacıklarını, genellikle ya kuvvetli bir şekilde karıştırıldı ve girdap.
- 5 (veya 6) cm Petri kapları üzerine ~ 20 mi agar dökün ve ihtiyaç duyulacak zamana kadar ağar, 4 ° C'de katılaşmaya ve mağaza yemekler için izin verir.
- Şerit lipid agar plakası üzerinde simbiyotik bakteriler, istenen ve 24-48 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
NOT: gecede (12-16 saat) LB altkültür 100-200 ul yayıldı. - Bir gün sonra, yaklaşık olarak 0.4 mi yüzeyi sterilize nematod süspansiyonuna (yumurta ya da infektif juvenil) ekleyin ve karanlıkta ve 22 ± 3 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde, oda sıcaklığında inkübe edin.
NOT: nematod büyüme olumsuz bir aşırı ıslak ortam oluşturmak gibi nematod süspansiyonun fazla 0,4 ml katmayın. - Günlük kültürleri izleyin. Kültürler yaklaşık 12 gün (Şekil 2) Ijs yeni nesil üretmek gerekir.
- Nematodlar, modifiye edilmiş beyaz yakalamak için çanak (Şekil 3A) yanlarını tarama görüldüğünde agar ile alt çanak aktarın IJs (Şekil 3B) toplanması için (Orozco ve arkadaşları. 12). Ortamın kirlenmesini azaltmak için bir laminar akış başlığı altındaki bu adımı gerçekleştirin.
- Ortaya çıkması üzerine modifiye Beyaz tuzak Ijs toplayın ve herhangi bir ortamda enkaz kaldırmak için IJ süspansiyon durulayın. Deposu (soğuk ısı enkübatör ya da soğuk bir odada), 10 ° C'de steril damıtılmış su içinde, IJ ya da gerektiğinde, hemen kullanın.
NOT: Araştırmanın amacına bağlı olarak, ya symbiont-kolonize veya aposymbiotic nematodlarla plakaları tohum.
3. in vitro Aposymbiotic arasında Yetiştirme (Symbiont-serbest) Entomopatojenik Nematodlar
- 10-20 G. bulaştırmak İstediğiniz nematod türlerinin Ijs ile mellonella larvaları (bakınız bölüm 1). 3 veya 4 gün sonra (bu zamanda IJs olgunlaştı gerekirdiBirinci nesil yetişkinlere) kadavra toplar.
NOT: vade ve türe göre değişir yumurta yeterli sayıda elde etmek için gerekli kadın sayısına zamanı. Daha fazla G. bulaştırmak Mellonella gerekirse larva ve erken onlar doğru gelişim aşamasında olup olmadığını değerlendirmek için 48 saat sonrası enfeksiyon gibi diseksiyonu başlar. - Tuzlu su çözeltisi (M9 tampon 18) ile bir Petri kabı içinde tek tek her bir kadavradan yerleştirin. Bir ince uçlu forseps ile başını çekerek bir kadavra ayır.
- (Tercihen L-şekil) ince bir iğne ile kadın (iç yumurta) en az 20 Hastaların gravida toplayın ve M9 tampon (Şekil 4A) 10 ml içeren bir saat camı koyun.
- Aşağıdaki maddeleri göz önüne alınarak, bir çözelti hazırlayın axenizing: damıtılmış su 6.75 ml, 1.25 mi, 5 N NaOH ve 2.25 ml ticari olarak temin edilebilen ağartma çözeltisi,% 3 hipoklorit seyreltilmiştir.
NOT: NaOH çözüm eldiven, gözlük, temel ve koruyucu uygun diğer birkıyafetleri giyilmelidir.
Not: ağartma ışık ayrıştığından taze axenizing çözüme her hazırlayın. Axenizing çözümün birkaç toplu hazırlayın ve birden izle gözlük yumurta yüzey sterilizasyonu ve istihsalinde. - M9 tampon tampon çözelti ile izlemek cam dolduran ve bir pipet ile tampon yalakalık kadınlarda en az üç kez durulayın. Kadın saat camı kalır emin olun. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
- Hemen axenizing bir çözeltisi eklenmekte ve dişi 10-15 dakika fazla bu çözelti içinde kalmasını sağlar. (Axenizing çözeltisine dayanıklı olan) yumurta sağlam kalırken parçalanmaya başlıyor nematod dokuları gözlemleyin.
- Manuel bir iğne veya bisturi (Şekil 4B, C) ile keserek, süreci hızlandırmak için kadın bedenlerini bozabilir. , Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine pipetle çözülmemiş her türlü doku ekleyerek kaçınarak yumurta çıkarın.
NOT: m olarak kullanHerhangi bir mikrosantrifüj tüpleri gerekli yumurta toplamak için ve yumurtaların yaşama kabiliyetini axenizing çözeltisine maruz uzun bir süre boyunca azalacak şekilde, hızlı bir şekilde çalışır. - "Yüksek hız ayarını" kullanılarak 15 sn vorteks tüpler daha yumurta bağlı nematod dokuları kaldırmak için. Bir girdap kullanılamaz Alternatif olarak, eğer pipetlemeyin yukarı ve çözüm birkaç kez aşağı.
- Yaklaşık 18.000 g 2 dakika boyunca santrifüj ile pelet yumurta. Yumurta yeterince pelet yapmazsan hızını artırın. Axenizing çözeltisini çıkarın ve 1 dakika boyunca 900 x g hızında steril damıtılmış su ve santrifüj ile bir kez daha mikrosantrifüj tüpü doldurmak suretiyle iki kez yıkayın.
- Son yıkamadan sonra, steril damıtılmış su içinde 300-500 ul yumurta tekrar süspansiyon ve steril 3 cm Petri için veya steril saat camı yerleştirin. Yumurta şimdi yüzey sterilize olduğunu unutmayın, bu yüzden yumurta temizliğini korumak için steril pipetler ve / veya pippetter ipuçları ve su kullanın.
- Onlar (Şekil 4D) sağlam olduğunu doğrulamak için bir mikroskop (30-50X büyütme) altında yumurta incelemek ve karaciğer-böbrek agar ile 5 cm plaka aktarabilirsiniz (bakınız bölüm 2.1)
NOT: Agar aşırı ıslak yapacak gibi plakalar üzerinde yumurta süspansiyon fazla 400 ul ekleyin etmeyin. - Ilgili bilgileri etiket plakaları ve 28 ° C'de karanlıkta dik saklayın. Yumurta Kuluçka belirgin bir gece boyunca olmalıdır.
NOT: Su çanak kapağı üzerine yoğunlaşabilir ancak 1 ya da 2 gün sonra buharlaşır. Şu anda, agarı nem tutma ve kurumayı önlemek için bir plastik torba içinde koyunuz. - Periyodik yemekleri gözlemleyin ve mantar veya bakteriyel kontaminasyon belirtisi gösteren herhangi yemekleri atın. IJs Petri kabı duvar göç görülmektedir sonra, kapağı çıkarın ve modifiye Beyaz tuzak 12 ağar ile alt çanak aktarın. Modifie içine çanak aktarırken steril koşullarını dikkated Beyaz tuzak maruz medyanın kirlenmesini önlemek için.
- Gerektiği gibi Beyaz Tuzakları ve hasat IJ izlemeye devam.
NOT: Aposymbiotic nematod birçok gün ve hatta hafta Beyaz tuzak suya göç devam edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo yetiştirme yöntemi nematod büyüme ve üreme için ev sahibi olarak canlı böcekleri kullanır. Enfeksiyon odaları böcekler Ijs sergilemek için etkili bir yöntemdir. Bu, başka bir böcek ev sahibi hücresi, bakteriyel vektörleri symbionts nematodlara yaşam döngüsünün tek bir aşamadır. 1 bir enfeksiyon bölmesi hem de bu bölme oluşturmak için gereken malzemeler için ayarlanmış göstermektedir. In vitro yetiştirme yöntemleri sağlar EPN Bir böcek ev sahibi olmadan büyümesi, aynı zamanda aposymbiotic (ortak yaşar içermeyen) nematodların yetiştirmesi için uygulanmaktadır. Şekil 2 değişik iplik kurdu etaplı bir lipid agar plakasını göstermektedir. Lipit agar plakaları, aynı zamanda, biyolojik türler kavramına dayanmaktadır nematod kimliğini doğrulamak için gerekli olan çapraz melezleme testleri düşünülebilir. Karaciğer, böbrek ağar yöntemi başlangıçta Poinar ve Thomas (1966) 14 tarafından tarif edilmiştir. Bu yöntem, nematodlar ve olgun çoğalır sağlarBir böcek ev sahibi olmadan E ve simbiyotik bakterilerin olmadan arka nematodlara için kullanılabilir (yani, iplik kurdu aposymbiotic üretmek için). Bu yöntemin bir dezavantajı, istenmeyen bakteri veya mantar büyümesini. Şekil 3A IJS plaka tarafında tarama ile karaciğer-böbrek agar gösterir imkan tanıması zengin doğası kirlenmeye eğilimli olmasıdır. Bu aşamada Petri kabı alt kısım, modifiye edilmiş beyaz tuzak aktarılabilir. Şekil 3B IJs döl toplama için modifiye edilmiş bir beyaz kapanında Steinernema nematod ile bir karaciğer-böbrek plakasını gösterir. Şekil 4A'ya gebe olan bir izleme camı gösterilmektedir önce kendi axenization için Steinernema kadın. Şekil 4B bir diseksiyon iğne ile kadın bozulması görüntüler. Şekil 4C axenizing çözeltide kadın bozulduğu gösterir. Şekil 4D nematod Steinernem bozulmamış bir yumurta gösterirBir carpocapsae.
EPN in vivo yetiştirmesi için bir enfeksiyon odasının Şekil 1. Set up. Üst satır, 5 cm Petri ve filtre kağıdı gösterir. Alt satır 10 cm Petri ve filtre kağıdı görüntüler. Böcek larvalarının Bildirimi sayısı her enfeksiyon bölmeye eklenir.
EPN in vitro yetiştirmesi için Şekil 2. Lipit ağar yöntemi. Görüntü yetişkin Nematodlar ortamda gelişen bir çanak bir close-up (20X büyütme) göstermektedir.
Şekil 3. Karaciğer-böbrek agar. Solda Image nematod başarılı büyüme ile bir tabak gösterir. Yemeğin tarafında tarama nematod dikkat edin. Resim B IJ nematodlarının hasat için değiştirilmiş Beyaz tuzak yerleştirilen bir karaciğer-böbrek agar plaka gösterir.
Axenizing içinde gebe kadınlarda Şekil 4. İzle camı çözeltisi. Image axenizing çözeltisi içinde gebe kadın gösterir. Resim B Diseksiyon iğne ile kadın taşlama gösterir. Resim C görüntüler kadın bozulur. Görüntü D nematod Steinernema carpocapsae bozulmamış bir yumurta gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uygun bir ana bilgisayar kullanarak EPN in vivo yetiştirilmesinde başarılı bir anahtar faktördür. Genellikle, hem steinernematids ve heterorhabditids üretebileceği ve başarıyla büyük bal mumu güvesi Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) larvaları onların yaşam döngüsünü tamamlamak. Ancak, farklı aileleri ve / veya siparişlerin diğer böcek türleri olarak kabul edilebilir. Güncel olarak nematod türlerinin bir kaç özel bir böcek ev sahibi hücresi için özgüllüğe sahip olduğu bilinmektedir. Örneğin S. ve S. kushidai scarabaei lepidopretan larvanın çok virülan değildir ve bu laboratuarda başarılı bir şekilde yetiştirilmesi için bok böceği larvaları (Scarabaeitler) halinde koleopteran larva gerekir. Başka bir türü, S. scapterisci, örneğin cırcır veya danaburunları gibi orthopteran böcekleri tercih.
Uygun bir konakçı mevcut değildir ya da deneysel koşullar gerektirdiğinde, in vitro yöntemler EP yetiştirmesi için kullanılabilecektir zamanN. Bu yöntemler nematod ve bakteriyel simbiont için besin zengin bir kaynak sunan ortamları kullanın. Bu sunumda ya da simbiyotik bakteri olmadan başarılı büyüme ve EPN üreme için kullanılabilir agar (karaciğer-böbrek ve lipid) iki tür nitelendirdi.
Kullanıcılar, karaciğer-böbrek ağar zengin medya ve bu nedenle kolaylıkla kontamine olduğundan farkında olmalıdır. Steril teknik prosedürünün her aşamasında axenized yumurta ve İnoküle plakaları hem ele tavsiye edilir. Bir bakteri ya da mantar ile kirlenmiş olan Tabaklar hemen atılmalıdır.
Aposymbiotic Steinernema Ijs yetiştirme zaman onlar Ksenorhabdus bakteri liman olabilir gibi, bakım, düzgün dişi nematod dokuları parçalamak için alınmalıdır. Ayrıca, IJ gerçekten simbiyotik bakterilerin serbest olduğunu doğrulamak üzere, bir el moto LB içerisinde taze hasat IJs örneğinin taşlama tavsiye(Heungens ve ark. 2002) başı olarak 7 havan r-odaklı ve NBTA medyanın 1 üzerine süspansiyon plaka. Bakteri kolonileri (gece boyu inkübasyondan sonra) bulunursa, bunun zayıf bir axenization tekniğin bir gösterge ya da kirlenme sonucu olarak mevcut olacaktır.
Aposymbiotic Steinernema nematod yetiştirme ayrıca usul ve deneyler geniş bir dizi kabul edilebilir bir tekniktir. Okuyucular birden fazla jenerasyon boyunca simbiont olmadan yetiştirme Steinernema nematodlarının etkisi nesil kere nematod fitness ve sağkalım üzerinde etkisi olabilir farkında olmalıdır. Birkaç çalışmaları doğal sistemlerde 5,11,15-17 kendi eşleştirme gerekliliğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu tür çalışmalar, sınırlı sayıda yapılmış ve daha fazla araştırılması gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Stock laboratuar geçmiş üyelerine teşekkür etmek istiyorum: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson ve Sam-Kyu Kim bu protokollerin birçok iyileştirme katkıları için. Bu çalışma SP Stoku Ulusal Bilim Vakfı Hibe IOS-0840932 ve IOS-0724978 tarafından kısmen finanse edildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M. The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis. Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).
- Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. Entomopathogenic Nematology. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).
- Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera). Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , CRC Press. Raton, FL. (1990).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. Manual of techniques in insect pathology. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).
- Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp. Nematologica. 39, 385-399 (1993).
- Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (89), (2014).
- Poinar, G. O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda). Nematologica. 12, 105-108 (1966).
- Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).
- Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).
- Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus). BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).
- Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).
