Abstract
초파리 번데기 개발의 고유 프로세스는 이동 및 라이브 세포 이미징 동안 추적 개별 셀 동작을 어렵게 방법으로 눈의 상피 세포를 왜곡 할 수 있습니다. 이러한 프로세스는 다음과 같습니다 망막 회전, 세포의 성장과 생명체의 움직임을. 번데기가이 도전 하나의 초점면에서 몇 ommatidia, 개안 이상의 포커스에있는 이미지를 수집 할 수 있도록, 이미징을위한 준비로서 또한, 미묘한 범프 등 상피의 토폴로지, 불규칙 자주 소개 주름입니다. 워크 플로는 초파리 번데기 눈 개발하는 동안 세포 과정의 쉬운 분석을 가능하게 구제 여기 이러한 문제를 설명했다. 적절하게 준비된 번데기 용이 대부분 실험실에서 조립 될 수 촬상 장비에 배치되어 유비퀴틴 DE 카데 :. GFP와 GMR-GAL4 구동 형 UAS-α 카테닌 : GFP를 눈 상피 1 셀 경계를 시각화하는데 사용 -3입니다. 디컨 볼 루션은 후다중 초점면에서 촬영 된 형광 화상에 적용된 최대 투사 화상은 각 시점에 대해 생성 및 편집 소프트웨어를 사용하여 강화된다. 정렬 알고리즘은 추적 할 개별 셀의 동작은 더 쉽게, 빠르게 불필요한 움직임을 안정화하는 데 사용됩니다.
Introduction
화합물 초파리의 눈은 액세서리 색소 세포 4,5의 벌집 격자로 구분하여 그 ~ 750 ommatidia, 개안의 틀에 박힌 배열을 특징으로한다. 로컬 셀 움직임 세포 성장, 세포 형상의 변화, 세포 사멸 이러한 색소 세포는 이벤트 코디 조합에 의해 패터닝된다. 이 상피 세포의 실시간 시각화 하나는 생리 학적으로 적절하고 교란 입체 맥락에서 이러한 이벤트를 뒷받침하는 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.
이전의 프로토콜 -6,7- 대조적으로, 여기에 설명 된 기술들은 화상 형성 공정에서 커플 해제 할 수없는 불필요한 조직의 움직임을 안정화시키기위한 효율적인 방법을 포함한다. 영상의 과정을 통해, 성장 회전하는 조직과 변화 -이 방법은 개발 초파리 번데기 눈 상피 세포 행동의 연구를 강화한다. 또한 모션 안정화 기술에서는 드여기에 스 크라이 빙 외부 이동되기 다른 상황에서 세포를 연구하는 데 유용 할 것입니다.
눈 특정 드라이버 GMR-GAL4 1-3의 통제하에 GFP : GFP뿐만 아니라 UAS-α-catenin의를 : 초파리 망막 분야에서 셀 경계를 시각화하기 위해 유전자 변형 플라이 라인은 UBI-DE-cadherin의 발현가 생성되었다. 두 GFP 태그가 막 마커의 사용은 낮은 강도의 빛 셀 경계의 시각화 수 있습니다. 이는 고 에너지의 파장에 반복 노출 활성화, 증가 된 프레임 레이트 및 동영상 구간에 조직 손상을 최소화하고 광표백. UAS-DCR-2는 제 2 플라이 라인 (8)에 통합되었다의 RNAi 유전자의 효능을 강화합니다.
이전의 프로토콜의 세 번째 업데이트에서는 실험실에서 가장 용이하게 조립된다 촬상 간단한 장비를 설명한다. 이 장치는 특수 촬상 R을 갖도록 요구를 미연에 방지IG는 대학의 '기계 공장'또는 이와 유사한 서비스에 의해 생성. 이 영상 장비는 이미지를 다른 번데기 조직 9, 10에 사용되는 것과 유사하다.
직접 17-42 시간 puparium 형성 HR (APF) ~ 후 안구로부터 패터닝에 기여 형태 발생 이벤트를 평가하기 위해 사용될 수있는 단순한 라이브 셀 이미징 프로토콜이 여기에 제시했다. 즉,이 프로토콜은 번데기 개발 중에 유전자 발현을 변경하는 결과를 결정하기 위해 하나를 가능하게한다.
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Protocol
그림 3은 실험 절차의 요약을 보여줍니다.
1. 조직 준비
- C를 중복에 다음 십자가를 설정 관심의 유전자의 변형 된 표현의 결과를 결정하고 25 °로 유지하려면 UAS - 유전자 (수컷) X는 GMR-GAL4; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP; + / SM5-TM6b (처녀 여성) 참고 : 제어 조직 크로스 UAS-의 lacZ를 얻으려면이 GMR-GAL4에 수컷; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP 여성. β - 갈 락토시다 아제는 망막 세포의 행동에 결함을 생성하지 않습니다.
- 의 RNAi 유전자의 효능을 향상시키기 위해 크로스 UAS-의 RNAi는 GMR-GAL4, UAS-DCR-2 수컷; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP; + / SM5-TM6b 처녀 여성.
주 : 이소성 DCR-2 발현이 관찰되었다 망막 세포 거동이 이따금 결함 (데이타 미기재). 각성이 방법을 사용하면 좋습니다. - 에스1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 당선자 흰색 해당 유전자형의 사전 번데기 및 장소. 번데기가 DCR-2를 표현하는 경우, 남성 또는 여성 중 번데기를 선택 UAS-DCR-2, X 염색체에 삽입,의 발현은 남성에 강하다. 번데기는 번데기 경우의 색소 침착 전에 0 시간 APF에서 성별화해야한다 - 남성의 생식기는 번데기 (후방에서 약 3 분의 1)의 측면에 큰 투명 글로브로 볼 수 있습니다.
- 25 ° C에서 깨끗한 플라스틱 팁 상자에 번데기를 포함하는 마이크로 원심 튜브를 품어. 번데기 장소의 팁 상자에 증류수에 담가 조직의 10cm 2 조각, 탈수를 방지합니다.
참고 : 팁 상자에 습도가 너무 높아지면 번데기 경우 다음 단계에서 해부하는 기운이 어려운 경우가 있습니다. - 적절한 시간 동안 품어. 약 17 시간 APF, 20 시간의 APF 또는 24 시간 AP에서 이미징을위한 번데기를 준비, 눈을 패터닝과 관련된 세포의 행동을 캡처하려면F.은 특정 세포의 행동이 최선 관찰하는 경우에 대한 자세한 논의는 대표 결과를 참조하십시오.
- 검은 실 가드 해부 접시에 신선한 양면 테이프의 조각을 놓습니다. 양면 테이프 (그림 1A)에 부착 된 번데기의 머리 위로 번데기, 등쪽의 위치를 .Try는 양면 테이프로 번데기의 흉부와 복부를 준수하지. 핀셋으로 조심스럽게 들어 올려 번데기 머리를 노출 아가미를 제거합니다. 한쪽 눈 주위를 노출 번데기 케이스의 측면을 따라 눈물.
- 조심스럽게 접착 테이프에서 번데기를 제거합니다. 번데기가 부착 남아 있으면 접착력을 약화 번데기 케이스와 테이프 사이의 접합에 증류수의 작은 볼륨을 적용합니다.
2. 장착
- 압지에서 작은 15mm 2 프레임을 구축하고 middlethat에 구멍을 펀치 직경 5.5 mm (그림 1B)입니다. 증류수와 장소에 담가현미경 슬라이드의 중심. 바셀린의 균일 한 반지를 집어 넣은, 30 CC 주사기를 사용하면 압지 프레임을 둘러싸는. 석유 젤리 링이 번데기의 폭보다 링의 직경이 커버 슬립의 폭보다 변두리에 작은 그 변두리에 더 높은 있는지 확인합니다.
- 석유 젤리 비드 (그림 1D)에서 지원하는 측면에서, .Carefully 번데기를 준비 압지 (그림 1C)에 펀치 구멍에 직접 슬라이드에 석유 젤리의 작은 구슬을 추가합니다.
- 석유 젤리 링의 상단에 커버 슬립을 놓고는 접촉 눈 neuroepithelium (그림 1D) 위의 상피 있도록. 부드럽게 바셀린 대해 커버 슬립을 밀봉하고 번데기 눈 영역 및 커버 슬립 사이에 작은 편평한 접촉 표면을 생성하는 제제를 압축.
3. 형광 이미징
- 이미지를 사용하여 번데기 준비형광 현미경. 모든 7 분 캡처 adherens 접합의 지역에서 눈 neuroepithelium의 꼭대기의 도메인을 통해 시리얼 섹션.
참고 :) 적절한 직렬 섹션은 보통 4-5 0.2 μm의 Z-단계로 구성 Z-스택 당이다. b)는 가벼운 충돌과 주름을 포함하여 상피 세포의 토폴로지에서 부정, 조직의 큰 영역에 초점 이미지를 수집하는 것이 도전 할 수 있습니다. 촬상 동안, 하나의 초점으로 관심 영역의 부분을 찾을 수 있으며, 이웃 영역 포커스 아웃한다. 번데기 눈 및 커버 슬립 사이에 증류수 작은 액 적을 포함하면 번데기 눈 형태 형성의 초기 단계의 약간 고르지 토폴로지 특성 일부 급성 티슈하지만 주름을 제거 할 수 없다. 이러한 경우에는 합초 슬라이스는 전체 필드에 대해 획득 될 때까지 스택 Z를 확장하여 조직을 오버 샘플링. C) 매 7 분 상당한 redu없이 3 시간 4 라이브 이미징을 사용하도록 설정해야합니다 시리얼 부분을 캡처이미지 품질을 손상시킬 수 GFP 형광의 강도 ction의. 짧은 시간 구간은 영상의 총 시간을 감소시킬 수도있다. - 3 ~ 4 시간 동안 영상을 계속합니다. 번데기 성장과 체액의 펌핑 망막의 위치를 이동하기 때문에 많은 형광 현미경에 사용할 수있는 자동 초점 및 시간 기능을 사용하지 마십시오 경계 다시 초점을 맞추고 매 14 ~ 21 분 필요합니다. 느리게하거나 눈의 형태 형성을 멈출 수 4시간 넘어 그 영상을 참고.
- 배경을 줄이고 직렬 단면 영상의 콘트라스트를 향상시키기 위해 적절한 컨벌루션 소프트웨어를 사용한다. 각각의 Z-스택 파일의 경우, (재료의 표 참조) LAS AF 소프트웨어에서 다음을 수행 도구 패널로 이동, 3D 역대을 선택하고 적용을 클릭합니다.
- 각 deconvoluted 스택 파일의 최대 투사 (MP) 이미지 생성 도구 패널로 이동, 3D 프로젝션을 선택하고 적용을 클릭합니다.
참고 : 최대 투사 알고리즘이 유니폼을 생성하는 데 실패 할 수오버 샘플링 된 조직에 대한 LY 포커스에있는 이미지입니다. - 초점 영역을 선명하게하는 기술 단계 5.2에 설명되어있다.
4. 번데기 구조 및 표현형 확인을 포스트 - 이미징
- 집게가 커버 슬립을 제거하고 음식을 깨끗한 유리 병에 번데기를 전송하여 : 아티팩트가 도입 또는 이미징 동안 피해 번데기가 조심스럽게 이미징 장비에서 번데기를 제거되었는지를 해결하기 위해. 실온에서 보관 또는 25 ° C 성인 플라이가 나올 때까지.
- 조심스럽게 성인 눈의 표현형을 조사하고 원래 플라이 십자가에서 신흥 성인 파리의 눈에 비교합니다.
5. 이미지 처리
- 자동 이미지 정렬 :
참고 : 라이브 초파리 조직은 이동 및 촬영 과정을 통해 성장할 것입니다. 따라서, 이미지 센터는 초파리 조직에서 동일한 지점에 대응하지 않을 수도 연속 시점에서 모였다. 또한에서전체 망막 디스크는 21 ~ 23 시간의 APF 사이에 약 30 ° 회전합니다. 개별 셀 동작을 선택하고 생명체의 성장으로 인한 산만 함을 줄이고,이 수동으로 수행 할 수있는 각 MP image.While, 여기에 사용되는 이미지 편집 소프트웨어를 정렬하려면 프로세스를 신속하게 처리 할 수 있습니다 내장 된 알고리즘을하고있다 (재료의 표 참조).- 스택에 메인 메뉴를 열고 스크립트로드를 선택 파일의 파일 탭에서.
- 로드 레이어 패널에 MP 이미지 파일을 가져 오기하고 [확인]을 선택합니다. 자동으로 소스 이미지 옵션을 맞 춥니 다하려는 시도가 선택되지 않았는지 확인합니다.
주 :이 옵션을 선택하면, 소프트웨어는 이미지 데이터를 왜곡 정렬 알고리즘을 이용할 수도있다. - 모든 MP 파일은 레이어 창에로드 한 후, 모든 이미지는 최초의 시점은 레이어 스택의 상단에되도록 시간 순서에 있는지 확인하십시오. 층은 올바른 순서, 드래그에없는 그들이 정렬 될 때까지 놓는 경우올바르게.
- 메인 메뉴의 편집 탭에서 자동 정렬 레이어를 선택합니다. 들어 오도록을 선택하고 확인을 클릭합니다.
- 자동 정렬 알고리즘은 해당 초점에 프레임 방향을 실패 할 경우, 이동 도구를 사용하여 약간의 조정을합니다.
- 복합 선명 :
참고 : 초기 MP 이미지의 포커스 아웃 영역은 '자르기'LAS AF 소프트웨어에 해당 deconvoluted 스택에 의해 날카롭게 할 수 있습니다. 스택 파일 자르기 한 수동 최대 투영 알고리즘을 실시 Z 스택의 간격을 제한 할 수있다.- (프로세스 탭 아래) 도구 패널에서 자르기 기능을 찾습니다. 수동 그들이 초기 포커스 아웃 영역 내에서만 부착 벨트 스팬되도록 초기 및 최종 슬라이스를 제한. 이 지역에 최적화 된 새로운 스택 파일을 생성 적용을 클릭합니다.
- TIFF 파일로 로컬에 최적화 된 스택 및 수출을위한 새로운 최대 투사를 생성합니다.
- 일에전자 이미지 편집 소프트웨어 (재료의 표 참조), 스택에 (메인 메뉴의 파일 탭에 위치) 오픈 스크립트로드를 선택 파일.
- 로드 레이어 패널에 특정 시점의 초기 MP 이미지 파일을 로컬에 최적화 된 MP 파일을 가져하고 [확인]을 선택합니다. 자동으로 소스 이미지 옵션을 맞 춥니 다하려는 시도가 선택되지 않았는지 확인합니다.
- 창 레이어의 두 레이어를 선택하고 균일 망막 분야에 초점을 맞 춥니 산출, 자동으로 두 이미지의 해당 영역을 마스크 (메인 메뉴의 편집 탭에 위치) 자동 혼합 레이어를 선택합니다. TIFF 파일로이 합성 이미지를 저장합니다.
- 반복하여 모든 차선 MP 이미지에 대한 5.2.5을 통해 5.2.1 단계를 반복합니다.
- 또한 조정 : 회전, 자르기 및 조정 동영상 레이어의 레벨 :
- 모든 레이어를 선택한 상태 망막의 지느러미 - 복부 축이 정렬되도록 이미지를 회전 변환 도구 (편집> 자유 변형)을 사용하여동영상 프레임의 Y 축에 관한 것이다.
- 필요한 경우, 원하는 크기와 형상으로 시야를 감소시키기 자르기 도구를 사용한다.
- 세포막과 전지 본체 사이에 콘트라스트를 향상시킬 수 있도록 (각 프레임의) 레벨 조정을 사용한다.
- 문체의 목적을 위해 각 프레임에 대한 관심의 포인트를 강조하기 위해 거짓 컬러를 도입, 특정 세포의 행동을 강조하는.
- 애니메이션 : 동영상으로 이미지를 변환 :
- 메인 메뉴의 윈도우 탭에서 애니메이션 창을 엽니 다. 애니메이션 창의 오른쪽 상단 모서리에있는 메뉴에서 레이어에서 프레임 만들기를 선택합니다.
- 층 스택의 바닥부터 시작하여 순차적으로 애니메이션 창에 추가되어 있습니다. 먼저 모든 프레임을 선택하고 애니메이션 창 메뉴에서 역방향 프레임을 선택, 프레임의 순서를 반대로합니다.
- 엄지 아래 프레임 드롭 다운 메뉴를 사용하여 각 프레임에 대한 프레임 지연 시간을 선택손톱.
참고 : (1) 본 논문에서는 4 영화의 프레임 지연은 0.8 초이다. - 주 메뉴를 열고 수출의 파일 탭에서 비디오 렌더링을 선택합니다. 파일 옵션에서 QuickTime 내보내기를 선택하고 원하는 비디오 형식을 선택합니다. 옵션 정의에 프레임 속도를 설정 렌더링에서, 15의 프레임 속도를 입력하고 렌더링을 클릭합니다.
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Representative Results
번데기 눈의 라이브 영상은 neuroepithelium의 패턴에 기여하는 세포의 행동을 관찰하는 성공적인 전략이다. 특정 단백질의 역할은 쉽게 눈 개발하는 동안 단백질 수준을 수정하여 유전자 발현을 평가할 수있다. 이 GMR-GAL4을 할 수있는 형태 형성 고랑 뒤에 유전자 발현을 구동하는 데 사용된다. 이것은 처음 두 령 유충 동안 눈 필드를 확립 이전 이벤트를 교란하지 않는 이점을 제공한다. 또한 다수의 RNAi 유전자를 효과적으로 (데이터 미도시) 단백질 수준을 줄이기 위해 상당한 시간을 필요로한다. GMR-GAL4 드라이버 라인은 종종 상처 진행 변태 동안 눈 디스크의 세 번째 애벌레 령 눈 개발 및 외반 수 있습니다 크게 번데기 눈의 형태 형성 동안 만 나중에 단백질 수준을 감소에 따라서의 RNAi 유전자를 운전. 유생은 그러나 고효율의 RNAi 유전자에 의해 교란되면, 십자가 할 수있는 비행0 열연 APF에서 25 ° C로 전송 유전자 발현 및 번데기를 줄이기 위해 18 ° C로 유지 될 수있다. RNAi의 유전자 발현, 단백질 또는 전사 수준의 효능을 해결하기 위해서 (예-PCR은 정량적, 면역 형광이 발현 수준) 표준 기술을 이용하여 정합 번데기 단계에서 평가한다.
유생 동안 각 개안 감광체의 코어는 눈 디스크 (11)의 전방 측으로부터 후방으로 이동 파 모집. 이 발달 그라데이션은 번데기 눈을 유지했다. 사실, 경우 22.5 시간 APF, GMR-GAL4, UAS-DCR-2의 패턴에 몇 군데; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP; + / SM5-TM6b의 망막 (그림 2) 후방 지역에서 현저하게 더 성숙했다. 이들의 망막 표현형 야생형 균주 플라이에 필적 하였다 (데이터는 보이지 않음). 전통적으로 번데기 눈의 형태 형성이 발달 시간에 따라 설명되어 있습니다 (예 :시간 APF). 그러나 뚜렷한 발달 그라데이션의 우리는 다음과 같은 이벤트에 따라 눈의 패턴을 설명하는 것을 제안 이유는 다음과 같습니다
1 ° 포장 (그림 2와 영화 1) : 처음 8 개의 세포를 직접 광 수용체 번들을 연락했다. 두 세포 - 일반적으로 전방 및 후방 세포 - 예비 선거 (1 ° S)로 영입했다. 이러한 1S 빠르게 안정된 접합을 형성하기 위해 서로 연결 감광체 번들을 둘러싸고. 미분화 interommatidial 세포 (ICS)는 각 ommatidial 그룹 사이에 무질서하게 누워. 1 ° 세포 모집과 병용 투여는 세포 사멸 (12) (안 영화 1 주석) 전술 한 바와 같이 IC 풀의 약 5 %를 정리.
IC 인터 (그림 2와 영화 2) : 1 °의 되풀이하고 각 광 수용체 번들에 대한 봉인으로, 현지 가전LL 운동은 각 개안의 지느러미와 복부 측면에 그룹화 IC를 개편. 여러에서 인터 IC를 하나의 행에 (보통 두개) 행. IC의 이동 목표 위치가 확실하게 큰 '셀룰러 확장'의 투영 방향을 관찰함으로써 야생형 조직에서 예측 될 수있다. 1 ° 세포의 성장은 동반 가능성이 IC 인터 (13)에 기여했다. 많은 IC를 차 전지 (2 ° S)로 차별화에 갈 것이다 (도시하지 않음).
3 ° 경쟁 (그림 2와 영화 3) : 인터 다음은 세 개의 IC는 차 (3 °) 틈새 시장을 차지하기 위해 경쟁했다. 이 역동적 인 전투에서, 세포는 자주 난민 전에 적은 5-10으로 분 동안 3 °의 틈새 시장을 점령했다. 결국 하나의 셀은 안정적인 3 ° 틈새 시장을 설립했다.
최종 정리 (그림 2와 영화 4): 세포 사멸 3,15-18의 서지 효율적으로 화합물 눈 5,14에서 깔끔한 육각 IC 격자를 생성하는 데 필요한 최소한으로 IC의 수를 감소 세 3 °의 각 개안 주위에 여섯 2 °들. 전술 한 바와 같이, 일반적으로 가장 가까운 칫솔모 누워 이러한 IC들은 과도한 아폽토시스 (7)에 의해 제거 하였다. 우리는 IC 층간 3 ° 틈새 설립과 세포 사멸 수반을 관찰하고 이러한 이벤트의 효율성에 기여 초과 세포의 가지 치기를 제안한다. IC를이 정리 된 바와 같이 또한, 강모 organules의 미묘한 재 위치는 종종 관찰되었다.
그림 1 :. 번데기의 해부 및 이미징 (A) 아가미가 (23 시간 APF에서 여기에 표시) 초파리 번데기에서 제거가의 머리를 노출nimal. 점선은 양면 테이프의 조각을 나타냅니다. 간단한 라이브 이미징 장비의 (B) 그림. 머리 노출로 (C와 D)를, 번데기는 약 35 ° 석유 젤리 구슬에 휴식에 위치한다. (D) 석유 젤리 구슬의 상부에 배치 번데기의 높은 배율 이미지. 커버 슬립과 목표의 위치는 (규모에 그려지지) 도시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 번데기 눈에 걸쳐 개발의 그라데이션. (A) 22.5 시간의 APF에서 몇 군데 번데기 눈의 하나의 이미지. GFP 및 αCat : Adherens 접합은 DE-캐드로 표시되어 있습니다 GFP. 박스형 영역에 주석이 (C). (B)는 각각 24 및 41 시간 APF에서 중간 단계 완전 무늬 ommatidia, 개안,의 삽화. 두 1 °의 (파란색) 네 개의 원뿔 세포 (흰색)의 중심 그룹을 둘러싸. interommatidial 세포 (라이트 그레이)의 패터닝 APF 41 시간으로 완료 세 3 °의 대체 정점 단일 2 ° 형태의 육각형의 각면을 차지한다. 세 organules (어두운 회색) 각 개안을 둘러싸고 모. (A)에서 눈의 작은 지역 (C) 주석. 두 1 ° 세포 (의사 색의 밝은 파란색 예) 각각의 광 수용체 번들을 둘러싸 확장합니다. 단일 행에 IC를 (녹색, 노란색, 빨간색과 진한 파란색)을 넣다. (분홍색으로 설명) 3 개의 셀이 경쟁 각각 다른 정점에서 3 ° 틈새 (컬러 오렌지)를 차지합니다. 전개 이러한 이벤트를 관찰하는 영화 1-4을 참조하십시오. 이 figur의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오전자.
그림 3 :. 실험 절차의 개요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 :. 차 포장 1 ° 세포는 각각의 신생 개안 주변 세포의 풀에서 선택됩니다. 두 1 °의 각 개안을 둘러싸고 연결로, 접합 빠르게 (핑크 라인)을 형성 adherens. 바로 1 ° : 1 ° 세포 접합 확장하고 1 °의 주변적인 IC에서 광 수용체 번들 절연, 성장하기 시작한다. 처음에 광 수용체는 정교한 adherens 접합을 표시, 밝게 밀도 GFP 노을. 형태 학적는 이쁜 변경이중으로 명확하게 개안 이미징 및 각 꼭대기 네 혀끝의 원추 세포의 각 세트 사이에 X 모양의 접합면 아래 이러한 광 수용체의 접합을 그립니다. 왼쪽에 원본 이미지; 의사 색상 및 주석이 오른쪽에 패널로 소개했다. 아이는 21 시간의 APF에서 몇 군데.
영화 2 :. Interommatidial 세포 intercalaction interommatidial 세포 (ICS)를 강조, 빨간색, 파란색, 노란색과 두 개의 셀의 거리에 의해 지느러미 (위) 및 복부 (아래) 개안을 분리하는 사분면을 형성 초기 녹색. 빨간색과 노란색 IC는 56 분으로 목표 1 °의를 접촉, 복부와 등쪽으로 각각 (t = 42 분)에서 스트레칭. 블루와 그린 IC는 유사하게 반대 개안을 대상으로 확장 할 수 있습니다. '새'1 ° : IC 접합 빠르게 옆으로 확장합니다. 112 분에서 IC의 원래 사분면은 GE 완전히 인터 있습니다셀들의 하나의 행을 nerate. 왼쪽에 원본 이미지; 의사 색상 및 주석이 오른쪽에 패널로 소개했다. 아이는 23 시간의 APF에서 몇 군데.
영화 3 :. 고등 경쟁 대체 정점 두 개 또는 세 개의 세포에서 (핑크에 설명)는 3 ° 틈새 시장을 차지하기 위해 경쟁한다. '푸시'에 출연 해 자신의 이웃 옆으로, 세포는 반대 ommatidia, 개안을 향해 도달 큰 확장을 생성합니다. 3 ° 틈새 (컬러 오렌지)을 점령 자주 덧이고 세포는 철회 또는 이웃 위치에서 밀려 하나. 이 217 분 영화의 끝으로 많은 3 ° 틈새 시장이 확립 나타납니다. 왼쪽에 원본 이미지; 의사 색상 및 주석이 오른쪽에 패널로 소개했다. 아이는 23 시간의 APF에서 몇 군데.
모경쟁 4 :. 최종 정리 강모 organules 부근의 세포 사멸에 의해 제거된다. 예는 보라색, 빨간색, 노란색과 파란색으로 강조 표시됩니다. 영상의 과정 동안, 세포의 제거는 IC 육각형의 각 수평 팔 함께 한 2 °를 떠났다. IC 육각형의 대각선 양쪽에 초과 세포의 가지 치기는이 영화에서 캡처되지 않았습니다. 이러한 유전자형 강모 그룹의 배치에 약간의 오차가 자주 (도 2B와 비교)가 관찰되었다. 세 가지 중 두 영상 중 모서리 틈새 시장으로 였는데 그룹을 곤두 : - 위치를 다시 이웃 IC를 제거 및 운동에 의해 촉진 될 것으로 보입니다. 왼쪽에 원본 이미지; 의사 색상 및 주석이 오른쪽에 패널로 소개했다. 아이는 26 시간의 APF에서 몇 군데.
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Discussion
야생형 개발 위의 설명은 RNAi의 패터닝에서 이벤트 또는 과발현 유전자형의 비교를위한 기초를 형성한다. 세포의 행동이 관심의 단백질에 의해 조절되는 정확하게 결정할 때 라이브 조직 개발의 비교는 매우 중요하다. 또한, 설명을 생략하고, 생균 촬상 한 그 패턴 눈 이벤트에 관심 유전자의 역할을 정 성적 및 / 또는 정량적으로 설명을 할 수있다. 30 ~ 32 시간의 APF으로 대부분의 색소 세포가 안정 위치를 획득 한 세포 사멸은 망막 분야에서 초과 세포를 정리했다. 1 ° S 미묘 확장됨에 따라 이웃이 직사각형 ° 셀의 폭이 작아, 12 °가 육각형 일이고 :이 후, 만 미묘한 변화는 색소 세포가 특징 형상을 채택로서 관찰된다. 안료 및 렌즈 재료의 후속 세대 가능성 adherens 접합부 성공적인 촬상을 방해한다.
발 비록라이브 번데기 눈 이미징 때 uable 전략은 몇 가지 함정을 염두에 두어야합니다. 첫째, 전방 번데기 케이스를 제거하면 장착 및 이미징 동안 탈수, 발열, 부상에 동물이 특히 취약 렌더링합니다. 이와 같은 모욕 검사에서 유전자형과 관련이 없습니다 비정형 조직 개발을 유도하여 데이터를 혼동 할 수 있습니다. 둘째, 여기에 설명 된 프로토콜은 유리 커버 슬립은 번데기 머리 상피 세포와 직접 접촉을해야합니다. 우리는 눈에 대한 커버 슬립을 밀어 때 과도한 압력이 가해지면 망막 개발이 포장 마차 것을 관찰했다. 실제로 외인성 기계적 힘은 조직 구조 (19, 20)를 포함 발달 과정에 영향을 미치는 다른 시스템에 도시되어있다. 이러한 이유로 매우 부드럽게 눈에 커버 슬립을 배치하는 것이 중요합니다. 또한, 이미징 번데기는 영상 장비에서 구출 성인으로 등장 할 수 있어야합니다 : 유물 영상 중에 도입 할 수 있습니다종종 원래의 십자가에서 연령대 파리의 눈이 성인의 몇 군데 눈을 비교하여 검출 될 수있다. 또한, 여러 이미지 세션의 데이터는 셀 동작을 확인하기 위해 비교해야합니다. 최종적으로, 표준 면역 형광은 스테이지 유사한 조직에있어서의 배치, 크기, 세포의 수는 동일 여부를 확인하는 데 사용되어야한다.
이소성 DCR -2- 자주 RNAi에의 효능을 향상시키기 위해 사용된다. 그러나 자궁외 DCR-2, 인터 IC, 12 ° 틈새 및 아폽토시스의 안정화의 존재 하에서 가끔 (데이터 미기재) 파쇄 하였다. 따라서 DCR-2의 발현은주의해서 사용해야합니다.
라벨이 접합을 adherens와 번데기 눈에 색소 세포의 형태 형성을 평가하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 GFP를 사용합니다. 이 전략은 쉽게 (예 : 광 수용체의 형태 형성을 평가하기 위해) 다른 목적으로 수정 될 수 있습니다. 이중 라벨 접근 방식은 추가 UA비 GFP 태그와 다른 세포 관심의 구성 요소 (예 : 사무 소포, 소포체, 핵을) 레이블 S의 유전자가 통합 될 수있다. 이러한 유전자의 강도 및 수명이 평가를 필요로하지만 : RFP DsRed의 및 mCherry을, 예를 들면, 색소 세포 패터닝을 포착하는데 필요한 장기간 번데기 눈을 이미징 불량한 레이블 것으로 입증되었다 (데이타 미기재). 빠른 세포 행동 (예 분비)을 조사하면 여기에 설명 된 프로토콜은 쉽게 적합한 형광 단백질의 공 초점 현미경을 위해 수정할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
