이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
초파리 번데기 개발의 고유 프로세스는 이동 및 라이브 세포 이미징 동안 추적 개별 셀 동작을 어렵게 방법으로 눈의 상피 세포를 왜곡 할 수 있습니다. 이러한 프로세스는 다음과 같습니다 망막 회전, 세포의 성장과 생명체의 움직임을. 번데기가이 도전 하나의 초점면에서 몇 ommatidia, 개안 이상의 포커스에있는 이미지를 수집 할 수 있도록, 이미징을위한 준비로서 또한, 미묘한 범프 등 상피의 토폴로지, 불규칙 자주 소개 주름입니다. 워크 플로는 초파리 번데기 눈 개발하는 동안 세포 과정의 쉬운 분석을 가능하게 구제 여기 이러한 문제를 설명했다. 적절하게 준비된 번데기 용이 대부분 실험실에서 조립 될 수 촬상 장비에 배치되어 유비퀴틴 DE 카데 :. GFP와 GMR-GAL4 구동 형 UAS-α 카테닌 : GFP를 눈 상피 1 셀 경계를 시각화하는데 사용 -3입니다. 디컨 볼 루션은 후다중 초점면에서 촬영 된 형광 화상에 적용된 최대 투사 화상은 각 시점에 대해 생성 및 편집 소프트웨어를 사용하여 강화된다. 정렬 알고리즘은 추적 할 개별 셀의 동작은 더 쉽게, 빠르게 불필요한 움직임을 안정화하는 데 사용됩니다.
서론
화합물 초파리의 눈은 액세서리 색소 세포 4,5의 벌집 격자로 구분하여 그 ~ 750 ommatidia, 개안의 틀에 박힌 배열을 특징으로한다. 로컬 셀 움직임 세포 성장, 세포 형상의 변화, 세포 사멸 이러한 색소 세포는 이벤트 코디 조합에 의해 패터닝된다. 이 상피 세포의 실시간 시각화 하나는 생리 학적으로 적절하고 교란 입체 맥락에서 이러한 이벤트를 뒷받침하는 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.
이전의 프로토콜 -6,7- 대조적으로, 여기에 설명 된 기술들은 화상 형성 공정에서 커플 해제 할 수없는 불필요한 조직의 움직임을 안정화시키기위한 효율적인 방법을 포함한다. 영상의 과정을 통해, 성장 회전하는 조직과 변화 -이 방법은 개발 초파리 번데기 눈 상피 세포 행동의 연구를 강화한다. 또한 모션 안정화 기술에서는 드여기에 스 크라이 빙 외부 이동되기 다른 상황에서 세포를 연구하는 데 유용 할 것입니다.
눈 특정 드라이버 GMR-GAL4 1-3의 통제하에 GFP : GFP뿐만 아니라 UAS-α-catenin의를 : 초파리 망막 분야에서 셀 경계를 시각화하기 위해 유전자 변형 플라이 라인은 UBI-DE-cadherin의 발현가 생성되었다. 두 GFP 태그가 막 마커의 사용은 낮은 강도의 빛 셀 경계의 시각화 수 있습니다. 이는 고 에너지의 파장에 반복 노출 활성화, 증가 된 프레임 레이트 및 동영상 구간에 조직 손상을 최소화하고 광표백. UAS-DCR-2는 제 2 플라이 라인 (8)에 통합되었다의 RNAi 유전자의 효능을 강화합니다.
이전의 프로토콜의 세 번째 업데이트에서는 실험실에서 가장 용이하게 조립된다 촬상 간단한 장비를 설명한다. 이 장치는 특수 촬상 R을 갖도록 요구를 미연에 방지IG는 대학의 '기계 공장'또는 이와 유사한 서비스에 의해 생성. 이 영상 장비는 이미지를 다른 번데기 조직 9, 10에 사용되는 것과 유사하다.
직접 17-42 시간 puparium 형성 HR (APF) ~ 후 안구로부터 패터닝에 기여 형태 발생 이벤트를 평가하기 위해 사용될 수있는 단순한 라이브 셀 이미징 프로토콜이 여기에 제시했다. 즉,이 프로토콜은 번데기 개발 중에 유전자 발현을 변경하는 결과를 결정하기 위해 하나를 가능하게한다.
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프로토콜
그림 3은 실험 절차의 요약을 보여줍니다.
1. 조직 준비
- C를 중복에 다음 십자가를 설정 관심의 유전자의 변형 된 표현의 결과를 결정하고 25 °로 유지하려면 UAS - 유전자 (수컷) X는 GMR-GAL4; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP; + / SM5-TM6b (처녀 여성) 참고 : 제어 조직 크로스 UAS-의 lacZ를 얻으려면이 GMR-GAL4에 수컷; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP 여성. β - 갈 락토시다 아제는 망막 세포의 행동에 결함을 생성하지 않습니다.
- 의 RNAi 유전자의 효능을 향상시키기 위해 크로스 UAS-의 RNAi는 GMR-GAL4, UAS-DCR-2 수컷; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP; + / SM5-TM6b 처녀 여성.
주 : 이소성 DCR-2 발현이 관찰되었다 망막 세포 거동이 이따금 결함 (데이타 미기재). 각성이 방법을 사용하면 좋습니다. - 에스1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 당선자 흰색 해당 유전자형의 사전 번데기 및 장소. 번데기가 DCR-2를 표현하는 경우, 남성 또는 여성 중 번데기를 선택 UAS-DCR-2, X 염색체에 삽입,의 발현은 남성에 강하다. 번데기는 번데기 경우의 색소 침착 전에 0 시간 APF에서 성별화해야한다 - 남성의 생식기는 번데기 (후방에서 약 3 분의 1)의 측면에 큰 투명 글로브로 볼 수 있습니다.
- 25 ° C에서 깨끗한 플라스틱 팁 상자에 번데기를 포함하는 마이크로 원심 튜브를 품어. 번데기 장소의 팁 상자에 증류수에 담가 조직의 10cm 2 조각, 탈수를 방지합니다.
참고 : 팁 상자에 습도가 너무 높아지면 번데기 경우 다음 단계에서 해부하는 기운이 어려운 경우가 있습니다. - 적절한 시간 동안 품어. 약 17 시간 APF, 20 시간의 APF 또는 24 시간 AP에서 이미징을위한 번데기를 준비, 눈을 패터닝과 관련된 세포의 행동을 캡처하려면F.은 특정 세포의 행동이 최선 관찰하는 경우에 대한 자세한 논의는 대표 결과를 참조하십시오.
- 검은 실 가드 해부 접시에 신선한 양면 테이프의 조각을 놓습니다. 양면 테이프 (그림 1A)에 부착 된 번데기의 머리 위로 번데기, 등쪽의 위치를 .Try는 양면 테이프로 번데기의 흉부와 복부를 준수하지. 핀셋으로 조심스럽게 들어 올려 번데기 머리를 노출 아가미를 제거합니다. 한쪽 눈 주위를 노출 번데기 케이스의 측면을 따라 눈물.
- 조심스럽게 접착 테이프에서 번데기를 제거합니다. 번데기가 부착 남아 있으면 접착력을 약화 번데기 케이스와 테이프 사이의 접합에 증류수의 작은 볼륨을 적용합니다.
2. 장착
- 압지에서 작은 15mm 2 프레임을 구축하고 middlethat에 구멍을 펀치 직경 5.5 mm (그림 1B)입니다. 증류수와 장소에 담가현미경 슬라이드의 중심. 바셀린의 균일 한 반지를 집어 넣은, 30 CC 주사기를 사용하면 압지 프레임을 둘러싸는. 석유 젤리 링이 번데기의 폭보다 링의 직경이 커버 슬립의 폭보다 변두리에 작은 그 변두리에 더 높은 있는지 확인합니다.
- 석유 젤리 비드 (그림 1D)에서 지원하는 측면에서, .Carefully 번데기를 준비 압지 (그림 1C)에 펀치 구멍에 직접 슬라이드에 석유 젤리의 작은 구슬을 추가합니다.
- 석유 젤리 링의 상단에 커버 슬립을 놓고는 접촉 눈 neuroepithelium (그림 1D) 위의 상피 있도록. 부드럽게 바셀린 대해 커버 슬립을 밀봉하고 번데기 눈 영역 및 커버 슬립 사이에 작은 편평한 접촉 표면을 생성하는 제제를 압축.
3. 형광 이미징
- 이미지를 사용하여 번데기 준비형광 현미경. 모든 7 분 캡처 adherens 접합의 지역에서 눈 neuroepithelium의 꼭대기의 도메인을 통해 시리얼 섹션.
참고 :) 적절한 직렬 섹션은 보통 4-5 0.2 μm의 Z-단계로 구성 Z-스택 당이다. b)는 가벼운 충돌과 주름을 포함하여 상피 세포의 토폴로지에서 부정, 조직의 큰 영역에 초점 이미지를 수집하는 것이 도전 할 수 있습니다. 촬상 동안, 하나의 초점으로 관심 영역의 부분을 찾을 수 있으며, 이웃 영역 포커스 아웃한다. 번데기 눈 및 커버 슬립 사이에 증류수 작은 액 적을 포함하면 번데기 눈 형태 형성의 초기 단계의 약간 고르지 토폴로지 특성 일부 급성 티슈하지만 주름을 제거 할 수 없다. 이러한 경우에는 합초 슬라이스는 전체 필드에 대해 획득 될 때까지 스택 Z를 확장하여 조직을 오버 샘플링. C) 매 7 분 상당한 redu없이 3 시간 4 라이브 이미징을 사용하도록 설정해야합니다 시리얼 부분을 캡처이미지 품질을 손상시킬 수 GFP 형광의 강도 ction의. 짧은 시간 구간은 영상의 총 시간을 감소시킬 수도있다. - 3 ~ 4 시간 동안 영상을 계속합니다. 번데기 성장과 체액의 펌핑 망막의 위치를 이동하기 때문에 많은 형광 현미경에 사용할 수있는 자동 초점 및 시간 기능을 사용하지 마십시오 경계 다시 초점을 맞추고 매 14 ~ 21 분 필요합니다. 느리게하거나 눈의 형태 형성을 멈출 수 4시간 넘어 그 영상을 참고.
- 배경을 줄이고 직렬 단면 영상의 콘트라스트를 향상시키기 위해 적절한 컨벌루션 소프트웨어를 사용한다. 각각의 Z-스택 파일의 경우, (재료의 표 참조) LAS AF 소프트웨어에서 다음을 수행 도구 패널로 이동, 3D 역대을 선택하고 적용을 클릭합니다.
- 각 deconvoluted 스택 파일의 최대 투사 (MP) 이미지 생성 도구 패널로 이동, 3D 프로젝션을 선택하고 적용을 클릭합니다.
참고 : 최대 투사 알고리즘이 유니폼을 생성하는 데 실패 할 수오버 샘플링 된 조직에 대한 LY 포커스에있는 이미지입니다. - 초점 영역을 선명하게하는 기술 단계 5.2에 설명되어있다.
4. 번데기 구조 및 표현형 확인을 포스트 - 이미징
- 집게가 커버 슬립을 제거하고 음식을 깨끗한 유리 병에 번데기를 전송하여 : 아티팩트가 도입 또는 이미징 동안 피해 번데기가 조심스럽게 이미징 장비에서 번데기를 제거되었는지를 해결하기 위해. 실온에서 보관 또는 25 ° C 성인 플라이가 나올 때까지.
- 조심스럽게 성인 눈의 표현형을 조사하고 원래 플라이 십자가에서 신흥 성인 파리의 눈에 비교합니다.
5. 이미지 처리
- 자동 이미지 정렬 :
참고 : 라이브 초파리 조직은 이동 및 촬영 과정을 통해 성장할 것입니다. 따라서, 이미지 센터는 초파리 조직에서 동일한 지점에 대응하지 않을 수도 연속 시점에서 모였다. 또한에서전체 망막 디스크는 21 ~ 23 시간의 APF 사이에 약 30 ° 회전합니다. 개별 셀 동작을 선택하고 생명체의 성장으로 인한 산만 함을 줄이고,이 수동으로 수행 할 수있는 각 MP image.While, 여기에 사용되는 이미지 편집 소프트웨어를 정렬하려면 프로세스를 신속하게 처리 할 수 있습니다 내장 된 알고리즘을하고있다 (재료의 표 참조).- 스택에 메인 메뉴를 열고 스크립트로드를 선택 파일의 파일 탭에서.
- 로드 레이어 패널에 MP 이미지 파일을 가져 오기하고 [확인]을 선택합니다. 자동으로 소스 이미지 옵션을 맞 춥니 다하려는 시도가 선택되지 않았는지 확인합니다.
주 :이 옵션을 선택하면, 소프트웨어는 이미지 데이터를 왜곡 정렬 알고리즘을 이용할 수도있다. - 모든 MP 파일은 레이어 창에로드 한 후, 모든 이미지는 최초의 시점은 레이어 스택의 상단에되도록 시간 순서에 있는지 확인하십시오. 층은 올바른 순서, 드래그에없는 그들이 정렬 될 때까지 놓는 경우올바르게.
- 메인 메뉴의 편집 탭에서 자동 정렬 레이어를 선택합니다. 들어 오도록을 선택하고 확인을 클릭합니다.
- 자동 정렬 알고리즘은 해당 초점에 프레임 방향을 실패 할 경우, 이동 도구를 사용하여 약간의 조정을합니다.
- 복합 선명 :
참고 : 초기 MP 이미지의 포커스 아웃 영역은 '자르기'LAS AF 소프트웨어에 해당 deconvoluted 스택에 의해 날카롭게 할 수 있습니다. 스택 파일 자르기 한 수동 최대 투영 알고리즘을 실시 Z 스택의 간격을 제한 할 수있다.- (프로세스 탭 아래) 도구 패널에서 자르기 기능을 찾습니다. 수동 그들이 초기 포커스 아웃 영역 내에서만 부착 벨트 스팬되도록 초기 및 최종 슬라이스를 제한. 이 지역에 최적화 된 새로운 스택 파일을 생성 적용을 클릭합니다.
- TIFF 파일로 로컬에 최적화 된 스택 및 수출을위한 새로운 최대 투사를 생성합니다.
- 일에전자 이미지 편집 소프트웨어 (재료의 표 참조), 스택에 (메인 메뉴의 파일 탭에 위치) 오픈 스크립트로드를 선택 파일.
- 로드 레이어 패널에 특정 시점의 초기 MP 이미지 파일을 로컬에 최적화 된 MP 파일을 가져하고 [확인]을 선택합니다. 자동으로 소스 이미지 옵션을 맞 춥니 다하려는 시도가 선택되지 않았는지 확인합니다.
- 창 레이어의 두 레이어를 선택하고 균일 망막 분야에 초점을 맞 춥니 산출, 자동으로 두 이미지의 해당 영역을 마스크 (메인 메뉴의 편집 탭에 위치) 자동 혼합 레이어를 선택합니다. TIFF 파일로이 합성 이미지를 저장합니다.
- 반복하여 모든 차선 MP 이미지에 대한 5.2.5을 통해 5.2.1 단계를 반복합니다.
- 또한 조정 : 회전, 자르기 및 조정 동영상 레이어의 레벨 :
- 모든 레이어를 선택한 상태 망막의 지느러미 - 복부 축이 정렬되도록 이미지를 회전 변환 도구 (편집> 자유 변형)을 사용하여동영상 프레임의 Y 축에 관한 것이다.
- 필요한 경우, 원하는 크기와 형상으로 시야를 감소시키기 자르기 도구를 사용한다.
- 세포막과 전지 본체 사이에 콘트라스트를 향상시킬 수 있도록 (각 프레임의) 레벨 조정을 사용한다.
- 문체의 목적을 위해 각 프레임에 대한 관심의 포인트를 강조하기 위해 거짓 컬러를 도입, 특정 세포의 행동을 강조하는.
- 애니메이션 : 동영상으로 이미지를 변환 :
- 메인 메뉴의 윈도우 탭에서 애니메이션 창을 엽니 다. 애니메이션 창의 오른쪽 상단 모서리에있는 메뉴에서 레이어에서 프레임 만들기를 선택합니다.
- 층 스택의 바닥부터 시작하여 순차적으로 애니메이션 창에 추가되어 있습니다. 먼저 모든 프레임을 선택하고 애니메이션 창 메뉴에서 역방향 프레임을 선택, 프레임의 순서를 반대로합니다.
- 엄지 아래 프레임 드롭 다운 메뉴를 사용하여 각 프레임에 대한 프레임 지연 시간을 선택손톱.
참고 : (1) 본 논문에서는 4 영화의 프레임 지연은 0.8 초이다. - 주 메뉴를 열고 수출의 파일 탭에서 비디오 렌더링을 선택합니다. 파일 옵션에서 QuickTime 내보내기를 선택하고 원하는 비디오 형식을 선택합니다. 옵션 정의에 프레임 속도를 설정 렌더링에서, 15의 프레임 속도를 입력하고 렌더링을 클릭합니다.
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결과
번데기 눈의 라이브 영상은 neuroepithelium의 패턴에 기여하는 세포의 행동을 관찰하는 성공적인 전략이다. 특정 단백질의 역할은 쉽게 눈 개발하는 동안 단백질 수준을 수정하여 유전자 발현을 평가할 수있다. 이 GMR-GAL4을 할 수있는 형태 형성 고랑 뒤에 유전자 발현을 구동하는 데 사용된다. 이것은 처음 두 령 유충 동안 눈 필드를 확립 이전 이벤트를 교란하지 않는 이점을 제공한다. 또한 다수의 RNAi 유전자를 효과적으로 (데이터 미도시) 단백질 수준을 줄이기 위해 상당한 시간을 필요로한다. GMR-GAL4 드라이버 라인은 종종 상처 진행 변태 동안 눈 디스크의 세 번째 애벌레 령 눈 개발 및 외반 수 있습니다 크게 번데기 눈의 형태 형성 동안 만 나중에 단백질 수준을 감소에 따라서의 RNAi 유전자를 운전. 유생은 그러나 고효율의 RNAi 유전자에 의해 교란되면, 십자가 할 수있는 비행0 열연 APF에서 25 ° C로 전송 유전자 발현 및 번데기를 줄이기 위해 18 ° C로 유지...
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토론
야생형 개발 위의 설명은 RNAi의 패터닝에서 이벤트 또는 과발현 유전자형의 비교를위한 기초를 형성한다. 세포의 행동이 관심의 단백질에 의해 조절되는 정확하게 결정할 때 라이브 조직 개발의 비교는 매우 중요하다. 또한, 설명을 생략하고, 생균 촬상 한 그 패턴 눈 이벤트에 관심 유전자의 역할을 정 성적 및 / 또는 정량적으로 설명을 할 수있다. 30 ~ 32 시간의 APF으로 대부분의 색소 세포가 안정 위치를 획득 한 세포 사멸은 망막 분야에서 초과 세포를 정리했다. 1 ° S 미묘 확장됨에 따라 이웃이 직사각형 ° 셀의 폭이 작아, 12 °가 육각형 일이고 :이 후, 만 미묘한 변화는 색소 세포가 특징 형상을 채택로서 관찰된다. 안료 및 렌즈 재료의 후속 세대 가능성 adherens 접합부 성공적인 촬상을 방해한다.
발 비록라이브 번데기 눈 이미징 때 uable 전략은 몇 가지 함정을 염두에 두어야합니다. 첫째, 전방 번데기 케이스를 제거하면 장착 및 이미징 동안 탈수, 발...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 살아있는 초파리 번데기 눈을 이미징하기 위한 독창적인 프로토콜을 개발한 David Larson에게 감사를 표합니다. 우리는 유전자 변형 파리를 개발하여 실시간 이미징 플라이 라인을 생성해 준 동료 Richard Carthew, Shoichiro Tsukita 및 Matthew Freeman에게 감사드립니다. 브리트니 볼드윈-헌터(Brittany Baldwin-Hunter)는 그 원고에 대해 도움이 되는 논평을 해 주었다. 이 작업은 웨슬리언 대학교(Wesleyan University)가 루스 존슨(Ruth Johnson)에게 수여한 창업 기금의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| GMR-갈4; UAS-a-고양이 : GFP, 유비 - 드 - Cadherin : GFP; + / SM5-TM6b | 의 요청에 따라 사용 가능 | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat : GFP, 유비 - 드 - Cadherin : GFP; + / SM5-TM6b | 의 요청에 따라 사용 가능 | ||
| 스카치 더블 스틱 테이프 | 3M | 665 | |
| 블랙 실가드 해부 접시 | 유리 페트리 접시를 실가드 (곱게 빻은 숯 가루로 검은 색) 또는 실가드 170으로 테두리까지 채우십시오. 실가드 다우 코닝을 중합시키기 위해 24-48 시간 동안 실온에서 방치하십시오 | ||
| SYLG184 | |||
| 실가드 (블랙) | 다우 코닝 | ||
| 유리 페트리 디쉬 | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm 유리 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm 유리 커버슬립 | VWR | 48393-172 | |
| 펜치 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm 크로마토그래피 종이 | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | 또는 현지 약국에서 구입하십시오. |
| 30ml 주사기 | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM 현미경 | Leica Microsystems | ||
| LAS AF 버전 2.6.0.7266 현미경 소프트웨어 | Leica Microsystems |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
