Abstract
Målet med fluorometrisk analyse er at tjene som en effektiv, omkostningseffektiv, high throughput fremgangsmåde til analyse af fagocytose og andre cellulære processer. Denne teknik kan anvendes på en række celletyper, både adhærente og ikke-adhærente, at undersøge en række cellulære egenskaber. Når man studerer fagocytose fluorometrisk teknik udnytter fagocytiske celletyper såsom makrofager og fluorescensmærkede opsoniseret partikler, hvis fluorescens kan slukkes i nærvær af trypanblåt. Efter udpladning af adhærente makrofager i 96-brønds plader, fluorescerende partikler (grøn og rød) administreres og cellerne får lov til at fagocytere til forskellige mængder af tid. Efter internalisering af fluorescerende partikler vaskes cellerne med trypan blåt, hvilket letter udryddelse af fluorescerende signal fra bakterier, som ikke er internaliseret, eller blot klæber til celleoverfladen. Efter trypan vask vaskes cellerne med PBS, fikseret, ennd farvet med DAPI (nuklear blåt fluorescerende mærke), der tjener til at mærke kernerne i celler. Ved en simpel fluorometrisk kvantificering gennem plade læsning af nukleart (blå) eller partikel (rød / grøn) fluorescens vi kan undersøge forholdet mellem relative fluorescensenheder grøn: blå og bestemme en fagocytisk indeks indikerer mængden af fluorescerende bakterier internaliserede per celle. Varigheden af analysen ved hjælp af en 96-brønds metode og multikanalpipetter til vask, fra slutningen af fagocytose til slutningen af dataopsamling, er mindre end 45 min. Flowcytometri kan anvendes på en lignende måde, men fordelen ved fluorometri er dens høje gennemløb, hurtig metode til vurdering med minimal manipulation af prøver og hurtig kvantificering af fluorescensintensitet pr celle. Lignende strategier kan anvendes til ikke-adhærente celler, levende mærkede bakterier, actinpolymerisation og i det væsentlige enhver proces udnytter fluorescens. Derfor fluorometri er en lovende fremgangsmåde til lave omkostninger, høj throughput kapaciteter i studiet af cellulære processer.
Introduction
Kvantificering af fluorescerende signal har været meget anvendt i en lang række videnskabelige metoder spænder fra PCR, flowcytometri, konfokal mikroskopi og FRET analyse til at multiplex ELISA. Fluorescensimagografi og kvantificering har en bred anvendelse og kan være et godt værktøj til kvantitativ analyse af forskellige cellulære processer. Anvendelse af fluorescerende markører og deres signal er blevet revolutioneret i det sidste årti, og fremkomsten af fluorescerende pladelæsere har lettet high throughput kvantificering af fluorescens udsendt under cellulære processer.
Fluorometrisk analyse kan tjene som et godt værktøj i kvantificering af fagocytose. Fagocytose blev undersøgt siden opdagelsen af fagocytter af Metchnikoff i 1800 1. I årenes løb har en række forskellige metoder blevet anvendt til at undersøge denne vigtige proces afgørende for medfødte immunsystem forsvar mod invaderende bakterie-, virus-, svampe- og parasitære patogener 2-5. Tidligere metoder til kvantificering anvendes mikroskopi og stereologiske teknikker med henblik på at visualisere celler, der er fagocytose, som derefter blev kvantificeret ved at tælle internaliserede partikler (manuelt eller ved brug af software) 6-8. Nogle ulemper ved at bruge mikroskopi alene til kvantitativ analyse er, at manuel optælling af bakterier er arbejdskrævende og mere tilbøjelige til observatør bias. En anden metode, der anvendes i kvantificering af fagocytose er den mikrobiologiske teknik udpladning af bakterier fra cellelysater (efter fagocytose) på bakteriekultur plader, men denne metode kan ikke redegøre for baktericide mekanismer og tilstedeværelse af delvist internaliserede bakterier. Denne fremgangsmåde er endnu mere arbejdskrævende i forhold til mikroskopi og tager adskillige dage at analysere. Flowcytometri synes at være den hurtigste, mest effektive måde at kvantificere fagocytose og er blevet udnyttet af mange grupper 9-11, men de høje omkostninger ofte forbundet med den istrument nødvendig for analysen gør det dyreste metode i forhold til de tidligere nævnte assays.
Den fluorometriske metode er et godt alternativ til flow-cytometri til analyse af partikel internalisering da det giver unbiased kvantificering af fluorescens under anvendelse af udstyr, der ikke er så omkostningerne uoverkommelige. Andre ekstra fordele af fluorometri er høj effektivitet, og høj kapacitet til at kvantificere fluorescens udsendt af de mærkede internaliserede partikler.
Fordele ved fluorometri kan ekstrapoleres til kvantificering af andre end fagocytose processer. For eksempel kan anvendes fluorometrisk analyse til at studere enhver proces, der fører til ændringer i ekspression af intracellulære eller membranbundne receptorer, ændringer i cellepermeabilitet / levedygtighed transfektion effektivitet og modulation i actinpolymerisation. En ulempe ved fluorometrisk teknik er, at, afhængigt af de anvendte etiketter, kan der være en højeksperiment til eksperiment variation der kan normalt løses ved at demonstrere data via relativ kvantificering, såsom fold ændring eller procent stigning fra kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol kan bruges til flere applikationer såsom kvantificering af fagocytose og actinpolymerisation som bruges i vores tidligere offentliggjorte arbejde 12. Protokollen egner sig til en lang række ændringer og tabel 1 lister celletyper og partikler med held anvendt i tidligere undersøgelser. Standard brug af denne protokol til kvantificering af fagocytose eller actinpolymerisation er illustreret i diagram 1.
Diagram 1:. Diagram over fluorometrisk assay til kvantificering af fagocytose og actinpolymerisation Efter at cellerne udplades, behandles og får lov til at klæbe partikler mærket med grøn fluorescens (FITC) tilsættes til cellerne for fagocytose. Reaktionen standses ved trypan eller antibiotisk vask (for at eliminere ikke-internaliseres partikler) og fiksering udføres med 4% paraformaldehyd. Celler farves efterfølgende med rødt fluorescerende actin etiket (rhodamin phalloidin) og blå fluorescerende mærke (DAPI). Indekser for fagocytose og actinpolymerisation kvantificeres i forhold til relative fluorescensenheder af grøn / blå (FITC / DAPI), eller rød / blå (rhodamin / DAPI) fluorescens.
1. Plating og behandle celler
BEMÆRK: Inden du begynder, overveje at køre de behandlinger med mindst 4 tekniske gentagelser, og omfatter følgende kontroller i pladen layout: kun celler (uplettet, med DAPI alene eller rhodamin alene) og partikel kun.
- Foretage alle tilsætning af reagenser i trin 1-4 i en steril cellekultur hætte for at beskytte prøver fra forurening.
- Plate makrofager (murine J774 cellelinie) i en 96-brønds plade ved 1-5 x 10 4 celler i 50 pi (per brønd) af suppleret forvarmet medier. Ideelle plader til denne metode er sorte plader med 96 brønde med klare eller sorte bunde, afhængig af læseren kapaciteter.
- For suppleret medier, bruger 10% varmeinaktiveret FBS at undgå interferens af komplement kaskade, og 1% penicillin / streptomycin (hvis du ikke bruger levende bakterier til fagocytose). Hvis hjælp adhærente celler tillader 1-2 timer for vedhæftning, og ikke-adhærente celler, spin ned pladen med cellerne i 10 minutter ved 500 x g.
- Tilføj ønskede agonister / antagonister eller vehikelkontrol på 2x koncentration (resuspenderet i PBS eller mere foretrukket i supplerede medier) i 50 pi til et endeligt volumen på 100 pi (1x) og inkuberes i en ønsket mængde af tid. Multikanalpipette og reagensbeholdere vil lette hurtigste bearbejdning.
2. opsonisering af fluorescerende partikler
ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg "width =" 500 "/>
Tabel 1: Testet celletyper og fluorescerende partikler i fluorometrisk analyse af, at vores gruppe har anvendt via fluorometriske metode fagocytose og actinpolymerisation Tabel 1 illustrerer kombinationer af celletyper (cellelinier og primære celler).. Andre end at se på fagocytose og actinpolymerisation med vildtypeceller, har vi også anvendt nogle af disse partikler til undersøgelse af fagocytose af transficerede celler, der udtrykker GFP (grønt fluorescerende protein). Fluorescens af celler transficeret med plasmider indeholdende fluorescerende reportere kan også anvendes som en cellulær markør foruden DAPI Tabel Forklaring:. A - actinpolymerisation; P - fagocytose; PT - fagocytose af GFP mærkede transficerede celler; OPDex - opsoniseret dextran perle; HKOP - varmedræbt opsoniseret.
- Sørg for at fluorescerende partikler og etiketter er beskyttet mod lys på alle tidspunkter, during behandling, vask, samt under inkubationen for at forhindre fotoblegning
- For tørre partikler, afvejes fluorescerende varmedræbt opsoniseret (HKOP) bakterier (E2861: E. coli K-12-stamme), ved hjælp af producentens specifikationer. Vær omhyggelig med at sørge massen regnskab for 10: 1 - 20: 1 bakterier: celle-forhold (eller i det mindste en 10: 1 ratio - almindeligt anvendt i kvantificering af fagocytose) 13,14. Antal af partikler kan tilvejebringes af producenten eller bestemmes via couting seriefortyndinger af 1 mg / ml stamopløsning.
- Resuspender i 50 pi PBS og vortex i 1 minut ved højeste indstilling. Sørg for korrekt vortex (her og i hele protokollen) som partiklerne en tendens til at samle, der kan påvirke effekten af opsonisering.
- For partikler i suspension såsom fluorescensmærkede dextranperler (DEX perler), vortex stamopløsningen for 1 min, tage 50 pi suspension eller afhængig af koncentrationen perle i mængden determine mount af perler til at lette 10: 1 perle: celle-forholdet.
- Tilføj et lige volumen af opsoniserende reagens til partiklerne og kraftigt vortex i et minut.
- Inkuberes partiklerne med opsoniserende reagens ved 37 ° C i 1 time.
- Efter inkuberingen centrifugeres partiklerne i 5 minutter ved 500 xg, og fjern supernant indeholdende overskydende opsoniserende reagens. Vask partiklerne ved tilsætning af 100 pi PBS, der vortex resuspender pelleten, og centrifugat i 5 minutter ved 500 x g.
- Gentag disse trin to gange for at sikre korrekt opsonisering og fjernelse af ubundet antistof.
- Forbered arbejdsopløsningen af opsoniseret partikler ved at resuspendere dem i 5 ml medier (tilstrækkeligt til en plade med 96 brønde) og opbevares væk fra lys, indtil tilsætning til cellerne.
3. Fagocytose
- Placer brugsopløsning af partikler i en steril reagens reservoir. Herfra tilsættes 5056 l af opsoniseret partikler til celler fremstillet i trin 1 (for en slutkoncentration på 50 ng / ml) og tillade fagocytose at forekomme ved standard cellekultur betingelser. Illustreret nedenfor er to metoder til fagocytose som kan vurderes ved hjælp af denne metode (Diagram 2).
Diagram 2:. Sammenligning af kontinuerlig versus synkronisere fagocytose Kontinuerlig fagocytose indikerer kontinuerlig internalisering af partikler over tid, som de langsomt nå cellerne på bunden af brønden. En kontrasterende synkronisering trin (centrifugering) tvinger partikler at synke til bunden, forbedre partikel kontakt med cellen, og som fører til umiddelbar internalisering af cellerne. Synkroniseret fagocytose er en hurtigere proces, som hurtigere internaliserer delkel på grund af den øgede celle: kontakt partikel.
- For den kontinuerlige fagocytose metoden (diagram 2), der tillader celler til stadighed fagocytere opsoniseret bakterier, som de langsomt synker til bunden og kommer i kontakt med celler, udnytter længere tidsrammer for at tillade bakterierne at nå bunden af brønden og komme i røre med cellerne. Hvis gennemføre en tidsforløbet eksperiment tilsættes bakterier ved forskellige tidsintervaller og stoppe hele pladen reaktioner på samme tid at øge hastigheden af behandlingen.
- For synkroniseret fagocytose metoden (diagram 2), der forbedrer partikel: celle kontakt via centrifugering, spin ned hele pladen indeholder celler og partikler (5 min ved 500 xg) Så snart partiklerne er tilføjet, for at lette synkronisering af alle tidspunkter og at fremskynde partikel: interaktion celle.
- Mål tidsforløbet starter lige efter afslutningen af Centrifugation trin. Hvis gennemføre et tidsforløb eksperiment stoppe hvert tidspunkt uafhængigt ved forskellige tidsintervaller som beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: synkroniseret fagocytose metode er noget mere besværlig fra den foregående, men giver højere fagocytisk indeks på kortere tid.
4. Stop Fagocytose
- For adhærente celler, supernatanten fjernes, og der tilsættes 50 pi fortyndet trypanblåt med PBS (1: 2 fortynding), med henblik på at slukke fluorescens af ikke-internaliserede bakterier.
- For ikke-adhærente celler, spin ned pladen og fjern supernatanten. Der tilsættes 50 pi fortyndet trypanblåt. Sikre at centrifugere pladen ved (5-10 minutter ved 500 xg) mellem hver vask for at minimere tab cellen og muliggøre tilstrækkelig vask.
- Efter trypan inkubation vaskes cellerne to gange med PBS for at fjerne eventuelle trypan (indtil PBS fjernet fra brønden viser klart). Trypan har vist sig at slukke fluorescens 15,16 af ikke-internaliserede fluorescensmærket, varmedræbte, bakterielle partikler, men ikke for levende bakterier eller OPDex perler. For levende bakterier, omfatter en vask med antibiotika såsom penicillin, streptomycin, gentamicin eller i stedet for den trypan vask for at undgå forstyrrende virkninger af fluorescens fra ikke-internaliseres partikler.
- Fix celler med 100 pi 4% paraformaldehyd, og der inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur, og derefter vaskes med PBS (100 pi per brønd til hver vask). På dette trin, gemme cellerne ved 4 ° C i op til en uge, eller gå direkte til farvning og kvantificering.
BEMÆRK: Alle de efterfølgende trin danner dette punkt forord kan ske uden for cellekultur hætte. - Fjern al væske og tilsættes 50 pi DAPI på 5 ng / ml rekonstitueret i PBS. Tillad 5 min til farvning, og vask derefter to gange med PBS. Efter vasketrinnet, tilsættes 50 pi PBS til hver brønd og optage fagocytose.
5. Actin Farvning
BEMÆRK: Ud over fagocytose vil fluorometrisk metode muliggøre kvantificering af actinpolymerisation ved måling intensitet af actin, som reduceres under hæmning af lamellipodia, pseudopodiae og membran ruffling som følge af behandling med en inhibitor (figur 1A). Dette er et valgfrit trin, hvis interesseret i kvantificering af actinpolymerisation foruden fagocytose. Hvis actinpolymerisation er det endelige mål, anvendelse af fluorescerende partikler til fagocytose er valgfrit.
- Efter paraformaldehydfiksering (trin 4.3), vask pladen to gange med PBS ved 100 pi per brønd til hver vask. Der tilsættes 50 pi 0,1% Triton X-100 i PBS i permeabilisering og inkuberes i -5 minutter ved stuetemperatur.
- Udvaske 0,1% Triton X-100 2 gange med PBS (som ovenfor), og blok med 1% bovint serumalbumin (BSA) i 20 min for at undgå ikke-specifik binding af label.
- Efter blokering, fjerne BSA-opløsningen og straks tilføje rhodamin phalloidin. For at forberede brugsopløsning af rhodamin pletten, bruge 100 pi methansyre opløsning (leveret af producenten) i 5 ml PBS (tilstrækkeligt, at en plade). Fra arbejdsdag opløsning tilsættes 50 pi per brønd og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Efter vasketrinnene og DAPI farvning som i trin 4.4 celler vil være klar til kvantificering.
6. Kvantificering
- For at kvantificere fagocytose ved hjælp af en fluorescerende pladelæser, optage grøn fluorescens under anvendelse af excitation filter ved λ = 488 nm og emission filter ved λ = 518 nm og blå fluorescens under anvendelse af excitation filter ved λ = 355 nm og emission filter ved λ = 460 nm.
- For at kvantificere actin polymerisation under anvendelse af en fluorescerende pladelæser, optage blå fluorescens via λ = 355 nm og λ = 460 nm (som ovenfor), og rød influenzaorescence via excitationsfilter på λ = 584 nm og emission filter λ = 620 nm.
BEMÆRK: Orbital eller central opdagelse er acceptabelt for optagelse. Nogle celletyper indsamle flere til kanten af brønden end centrum, i hvilket tilfælde orbital optagelse kan være en fordel. Især også kan anvendes i gennemsnit tre punkter omkring kredsløb til at opnå mere nøjagtige resultater. - Dividere det samlede RFU af grøn eller rød fluorescens af blå fluorescens udlæsning (fra DAPI), afhængig af etiketten partikel eller fagocytisk vs. actin kvantificering (Diagram 1). På grund af stor plade-til-plade varians, brug relative indeks (såsom forhold til t = 0 kontrol), at bedst illustrere tendenser og for at lette mere pålidelig statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To store måder at kvantificere fagocytose og den efterfølgende actinpolymerisation ved brug af denne protokol er at observere kontinuerlig eller synkroniseret fagocytose.
Mikroskopisk analyse (figur 1B) illustrerer fluorescerende billeder svarende til hvad fluorometer optager (se også Diagram 1). I figur 1B er røde fluorescens af actin, grøn 268 fluorescens af FITC etiketter HKOP E. coli, nuklear DAPI pletten, og det flettede billede af alle tre 269 fluorophores sammen. Dette billede indikerer effektiv fagocytose actinpolymerisation og 270 effektiv trypan quenching af ikke-internaliserede partikler.
Kontinuerlig fagocytose af opsoniseret og unopsonized partikler er helt sammenlignelige som det ses i figur 2A og C, hvor J774 celler internalisere dextranperler. Interessant actinpolymerisation efter opsonophagocytosis stiger, bremse på senere tidspunkter (figur 2B), mens actinpolymerisation efter internalisering af unopsonized partikler ikke stiger (figur 2D). Det er vigtigt at overveje for fremtidige undersøgelser undersøge disse processer, da opsonofagocytose fører til langt større actinpolymerisation end internalisering af partikler, der ikke opsoniseret. Ingen af de fagocytiske metoder under anvendelse af dextran partikler resultere i ændringer i cellelevedygtighed, som blev bekræftet via MTT analyse (Figur 2E).
I modsætning til konstant stigende tendenser under kontinuerlig fagocytose (figur 2), synkroniseret fagocytose af opsoniseret dextranperler har en klokke formet tendens (figur 3A), der viser reduktion i internalisering efter 30 min. Dette kan forventes i betragtning af behandlingstiden og arten af protokollen. Denne tendens bekræftes også af actin polymerization data (figur 3B) af disse celler, hvor det højeste polymerisation tidspunkt er tidligt i tidsforløbet, mens 30 min polymerisations- vender tilbage til udgangspunktet. Selv om mere arbejdskrævende, denne metode har en værdi at undersøge fagocytose lige efter synkronisering, derfor ved at undersøge umiddelbare fagocytiske effekter.
Figur 1:. Konfokal mikroskopi af fagocytose og actinpolymerisation Celler fik lov til at internalisere FITC konjugeret OPDex vulst (grøn) på 20: 1 bead: cell ratio for 60 min, derefter blev cellerne vasket med trypan og PBS, fikseret med paraforlmaldehyde, permeabiliseres med acetone og farvet for f-actin under anvendelse af rhodamin phalloidin (rød), og DAPI (blå). Billeder illustrerer konfokal mikroskopisk analyse på 60X med ekstra digital forstørrelse (A) White bar = 10 um (B) hvid bar = 50 um. (a) viser ændringer i actinpolymerisation efter tilsætning af inhibitor. Pilespidser indikerer pseudopodia dannelse, og pilene angiver ændringer i membran ruffling. Figur 1A er blevet modificeret fra Ninkovic og Roy 12. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2:. Fluorometrisk analyse efter kontinuerlige fagocytose J774 murine makrofager blev udpladet på en plade med 96 brønde og udsat for dextranperler ved varierende mængder af tid, startende med 90, 60, 45, 30 og 15 min. Perler blev tilsat på forskellige tidspunkter, og de fagocytiske processer for alle Reaktioner blev standset på samme tid. Cellerblev vasket med trypan, fikseret, farvet og analyseret for fagocytose af opsoniseret (A) eller unopsonized (C) dextran-partikler og actinpolymerisation forbundet med hver (B, D henholdsvis). (E) MTT-assay blev udført umiddelbart efter fagocytose på forskellige tidspunkter. Dette tal er blevet ændret fra Ninkovic og Roy 12.
Figur 3:. Fluorometrisk analyse efter synkroniseret fagocytose FITC-mærket OPDex perler blev tilsat til J774 murine makrofag celler udpladet i 96-brønds plader ved en celledensitet på 10 4 celler / brønd. Efter 30 minutters inkubation blev pladen centrifugeret ved 500 xg i 5 min. Fagocytose blev stoppet en ad gangen, på tidspunkter angivet i x-aksen ved trypan vask, efterfulgt af PBS vasker paraformaldehyd fixatipå og actin-farvning. Dette tal er blevet ændret fra Ninkovic og Roy 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Store begrænsninger af fluorometriske teknik er eksperimentelle varians samt celletab forbundet med omfattende vask og brug af ikke-adhærente celler.
Varians observeres i høj grad skyldes variationen i fluorescerende partikler som vejning og pipettering under forberedelsen af stamopløsningen er ikke en eksakt måde at opretholde ens antal partikler fra eksperiment til eksperiment. For at løse problemet med variansen mellem eksperimenter, kan data i relative tal, for eksempel som% fagocytose eller fold ændring fra kontrol (kontrol - t = 0; partikler tilføjes og fjernes med det samme). Denne form for analyse genererer reproducerbare tendenser og værdier for% fagocytose fra kontrol svarer fra eksperiment til eksperiment. Denne form for dataanalyse vil lette statistisk signifikans med 3-6 eksperimentelle gentagelser. Fluorometrisk teknik kan bruges til effektivt at undersøge og reproducere de observerede tendenser då trods af dens variabilitet hvis udnytte tilstrækkelig dataanalyse. Med mastering af teknikken er det muligt for en enkelt forsker til at køre cirka seks plader med 96 brønde, eller 600 behandlinger på en dag.
Cell tab er stort set blevet observeret i studier med ikke-klæbende celletyper. Adhærente celletyper er de bedste at bruge i metoder som denne, fordi de kan modstå de mange og omfattende vask trin.
Der bør tages større kritiske skridt til at holde de fluorescerende komponenter væk fra direkte lys for at undgå foto blegning. Partikler, etiketter og pladen indeholder hver eller alle komponenter bør holdes i mørke (eller blot indpakket i aluminiumfolie). En anden væsentlig komponent er betydningen af de tekniske replikater inden for en plade. På grund af høj brønd til brønd varians er det vigtigt at blande alle reagenser udmærket inden pipettering og have 6-8 tekniske replikater pr behandling (svarende til en række), med henblik på at mOST præcist observere tendenser i dataene.
Yderligere overvejelser er vigtige for anvendelsen af pladeformater såsom disse er, at pladebrøndene indeholder forholdsvis små mængder af reagenser og er ofte tilbøjelige til fordampning. Hvis behandlinger er længere end 24 timer, er det tilrådeligt at anvende de perifere brønde i pladen (rækker og kolonner ved siden af kanten) indeholdende PBS alene, med henblik på at tjene som befugtere og at reducere fordampning af celledyrkningsmedier og agonister.
Denne teknik er forholdsvis enkelt at styre og den involverede fejlfinding er minimal. Det er vigtigt at vælge den rigtige fagocytiske metode til undersøgelse og være forsigtig, mens vask (især ved anvendelse af ikke-adhærente celler) for at undgå celletab.
Større betydning af fluorometriske teknik er, at det giver et højt gennemløb fremgangsmåde til screening af fluorescerende partikel internalisering eller actinpolymerisation. Mest techniques hidtil anvendte såsom mikroskopi eller mikrobiologi er mere arbejdskrævende og mere tidskrævende i sammenligning. Flow cytometri udnytter meget lignende principper som fluorometri, men tager timer at kvantificere i forhold til minutter kræves af fluorometri. Derfor er den fluorometriske metode er et godt alternativ til de nuværende metoder til fagocyterende kvantificering hovedsagelig på grund af sin høje kapacitet kapaciteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers: | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use | |
| Fluorescent plate reader - Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96-well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom - black plates |
| Multichannel pipette (8 - 12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
- Murphy, K. Janeway's Immunobiology. , 8th edn, Garland Science. New York, NY. (2012).
- Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. Micromotion of cemented and uncemented femoral components. The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).
- Duan, X., et al. Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice. PloS One. 8 (3), 59633 (2013).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PloS One. 7 (3), 32621 (2012).
- Al-Bader, N., et al. Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence. Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).
- Acosta-Iborra, B., et al. Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor. Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).
- Ojielo, C. I., et al. Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation. Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).
- Neu, C., et al. CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages. PloS One. 8 (6), 66898 (2013).
- Sokolovska, A., et al. Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function. Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).
- Janko, C., et al. CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation. Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).
- Clatworthy, M. R., et al. Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).
- Ninkovic, J., Roy, S. Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms. The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).
- Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection. PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).
- Xue, X., et al. Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system. Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).
- Hed, J. Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology. 132. , 198-204 (1986).
- Scott, A. J., Woods, J. P. Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay. Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).
