Abstract
蛍光分析の目的は、食作用および他の細胞プロセスを分析する効率的な、費用対効果の高い、高スループットの方法を提供することです。この技術は、細胞の種々の特性を調べるために、接着性および非接着性の両方の細胞型の、さまざまに使用することができる。食作用を研究する場合、蛍光技術は、マクロファージなどの貪食細胞型を利用し、蛍光が蛍光パンブルーの存在下で消滅させることができ、オプソニン化粒子を標識した。 96ウェルプレート中の付着マクロファージのメッキに続いて、蛍光粒子（緑色または赤色）が投与された細胞は、時間の種々の量のために貪食させる。蛍光粒子の内在化に続いて、細胞が内在化されていない、または単に細胞表面に付着している細菌からの蛍光シグナルの消滅を促進するトリパンブルーを用いて洗浄される。パンの洗浄の後、細胞を固定し、PBSで洗浄し、NDの細胞の核を標識するのに役立つDAPI（核青色蛍光ラベル）、で染色した。核（青）または粒子（赤/緑）蛍光のプレート読み取りを通して、簡単な蛍光定量によって、我々は緑の相対蛍光単位の比率調べることができます：青を、セルごとに内部移行し、蛍光細菌の量の貪食指数が示す決定する。洗浄のために96ウェル方式とマルチチャンネルピペットを用いたアッセイの持続時間は、データ収集の最後に、食作用の端部から、45分未満である。フローサイトメトリーを同様に使用することができるが、蛍光法の利点は、高スループット、サンプルの最小限の操作および細胞あたりの蛍光強度の迅速な定量化と評価の迅速な方法である。同様の戦略は、非接着細胞、生標識細菌、アクチン重合、および蛍光を利用する本質的に任意のプロセスに適用することができる。そのため、蛍光法は、低コスト、高throughpのための有望な方法であり、細胞プロセスの研究ではUT機能を提供します。
Introduction
蛍光シグナルの定量は、広く、フローサイトメトリー、PCRに至るまでの科学的方法の多数で使用される共焦点顕微鏡法、およびELISAを多重化分析をFRETされている。蛍光イメージングと定量化は、広範なアプリケーションがあり、様々な細胞プロセスの定量分析のための素晴らしいツールとなることができます。蛍光マーカーとその信号を使用すると、10年間で革命をもたらしてきた、蛍光プレートリーダーの出現は、細胞プロセスの間に放出される蛍光のハイスループット定量化が容易になった。
蛍光分析は、食作用の定量化に大きなツールとして役立つことができる。食作用は、1800 1メチニコフによる食細胞の発見以来研究されてきた。長年にわたり、種々の方法が、細菌、ウイルス、真菌および寄生虫病原体2-5侵入に対する自然免疫防御に必須のこの重要なプロセスを調べるために利用されている。その後、内在化粒子（手動でまたはソフトウェアを用いて）6~8の計数によって定量した貪食された細胞を可視化するために、定量化に利用顕微鏡および立体解析技術の従来の方法。定量分析のために単独で、顕微鏡を使用するいくつかの欠点は、細菌の手動カウントが労働集約的であり、観察者の偏りが発生しやすくなることである。食作用の定量化に使用される別の方法は、細菌培養プレート上（食作用の後）細胞溶解物からの細菌のメッキの微生物学的手法であるが、この方法は、殺菌メカニズムと部分的に内在化細菌の存在を考慮するために失敗することができる。この方法は、顕微鏡に比べ、より労働集約的であると分析するのに数日かかります。フローサイトメトリー食作用を定量化するための最速、最も効果的な方法であると思われると多くのグループ9-11により利用されてきたが、高コストは、一般的で関連付けられている前述のアッセイと比較した場合、分析に必要なトゥルメントは最も高価な方法になります。
蛍光測定法は、それがコスト法外としてではない機器を使用して蛍光の公平な定量化を提供するので、粒子の内在化の分析のためのフローサイトメトリーには良い代替手段です。蛍光測定の他の追加の利点は、高効率、および標識された内在化粒子によって放出される蛍光を定量するための高スループット能力である。
蛍光法の利点は、食作用以外のプロセスの定量化に外挿することができる。例えば、蛍光分析は、細胞内または膜結合型受容体、細胞透過性/生存率の変化、トランスフェクション効率、およびアクチン重合における変調の発現の変化をもたらす任意のプロセスを研究するために適用することができる。蛍光技術の一つの欠点は、使用されるラベルに応じて、高があってもよい、ということである通常、そのようなコントロールからの倍変化またはパーセント増加として、相対的な定量化を介してデータを示すことによって解決することができる可変性を実験する実験。
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Protocol
注：このプロトコルは、我々の以前に発表された研究12で使用される食作用およびアクチン重合の定量化などの複数の用途に使用することができる。プロトコルの改変が種々に向いて、 表1の細胞型および粒子が正常に過去の研究で利用した。ファゴサイトーシスまたはアクチン重合の定量化のためのこのプロトコルの標準的な使用は、 図1に示されている。
図1：食作用およびアクチン重合の定量化のための蛍光分析のダイアグラム細胞は、メッキ処理し、付着させた後、緑色蛍光（FITC）で標識された粒子は、食作用のために細胞に添加する。この反応は、トリパンまたはantibiによって停止される耳の洗浄（非内在化粒子を除去するため）、および固定を4％パラホルムアルデヒドを用いて行われる。その後、細胞を赤色蛍光アクチン標識（ローダミンファロイジン）、青色蛍光標識（DAPI）で染色する。食作用およびアクチン重合のインデックスは、緑/青（FITC / DAPI）、または赤/青（ローダミン/ DAPI）蛍光の相対蛍光単位の比として定量化される。
1.細胞をプレーティングし、治療
注：開始する前に、少なくとも4技術的反復で治療を実行することを検討し、プレートレイアウトで次のコントロールが含まれていますのみ（単独DAPIまたは単独のローダミンと、染色されていない）細胞および唯一の粒子。
- 汚染からサ ンプルを保護するために、無菌細胞培養フード中で1〜4を段階的にすべての試薬 添加を行う。
- （ウェル）50μl中1〜5×10 4細胞で96ウェルプレート中でプレートマクロファージ（マウスJ774細胞株）の予熱されたメディアを補足。この方法のための理想的なプレートリーダ機能に応じて、透明または黒底黒色96ウェルプレートである。
- （食作用のために生細菌を使用していない場合）を補った培地は、補体カスケードの干渉を避けるために、FBSを10％熱不活性化、および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを使用する。接着細胞を使用して接着するため、非接着細胞を1〜2時間を許可する場合、500×gで10分間、細胞と共にプレートをスピンダウン。
- を100μl（1×）の最終体積50μl中に2×濃度（補充した培地中で、より好ましくは、PBS中に再懸濁させまたは）において所望のアゴニスト/アンタゴニストまたはビヒクルコントロールを追加し、所望の時間インキュベートする。マルチチャンネルピペットと試薬リザーバは、最速の処理を容易にする。
蛍光粒子の2オプソニン
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表1：試験済みの細胞型との蛍光分析、蛍光粒子食作用およびアクチン重合の表1は、細胞型の組み合わせ（細胞株および初代細胞）を示す我々のグループは、蛍光測定法を介して使用されていること。野生型細胞による貪食及びアクチン重合見以外の、我々はまた、GFP（緑色蛍光タンパク質）を発現するトランスフェクト細胞による食作用を調べるために、これらの粒子のいくつかを利用している。蛍光レポーターを含むプラスミドでトランスフェクトした細胞の蛍光を、またDAPI 表の凡例に加えて、細胞のマーカーとして使用することができる：A -アクチン重合。 P - 食作用。 PT - GFPによる食作用は、トランスフェクトされた細胞を標識した。 OPDex - デキストランビーズをオプソニン。 HKOP - オプソニン殺さ熱。
- 蛍光粒子とラベルを常時光から保護されていることを確認し、DURる処理、洗浄、ならびにインキュベーションの間の光退色を防止するために
- 製造業者の仕様を使用して、：（ 大腸菌 K-12株E2861）乾燥粒子のために、蛍光熱殺したオプソニン（HKOP）細菌を量る。 10ために必ず大量のアカウントを作るように注意してください：1から20：1の細菌：細胞比（または少なくとも10：1の比率を-一般的に食作用の定量化に使用される）13,14。粒子数は、製造業者によって提供されるか、または1 mg / mlのストック溶液の連続希釈をcoutingを介して決定することができる。
- 50μlのPBSに再懸濁し、最高の設定で1分間ボルテックス。適切なボルテックスを確認します（ここでは、プロトコル全体）粒子がオプソニン化の有効性に影響を与える可能性が凝集する傾向があるように。
- 懸濁液中の粒子のような蛍光標識デキストランビーズ（DEXビーズ）のために、ボルテックスで1分間のストック溶液は、体積dのビーズ濃度に依存して懸濁液または50μlのを取る1ビーズ：細胞比etermineは10を容易にするために、ビーズのマウント。
- 粒子へのオプソニン化試薬の等量のを追加し、激しくさらに1分間ボルテックス。
- 1時間37℃で試薬をオプソニン化した粒子をインキュベートします。
- インキュベーション後、500×gで5分間、粒子を遠心分離し、過剰オプソニン化試薬を含む上清を取り除く。 100μlのPBS、ペレットを再懸濁するためにボルテックスし、500×gで5分間の遠心分離を追加することで粒子を洗浄する。
- 適切なオプソニン化および非結合抗体の除去を確実にするためにこれらのステップを2回繰り返します。
- （1 96ウェルプレートのために十分な）メディアの5ミリリットルでそれらを再懸濁することによりオプソニン化粒子のワーキング溶液を調製し、細胞に添加するまで離れて光から保管してください。
3.貪食
- 無菌の試薬貯蔵中の粒子の使用液を置きます。ここから、50を追加56（50ng / mlの最終濃度のための） 工程1で調製した細胞へのオプソニン化粒子のlおよび食作用は、標準的な細胞培養条件で発生することを可能にする。以下に示すこの方法（ 図2）を用いて評価することができる食作用の二つの方法がある。
図2：連続の比較に対する食作用を同期連続食作用、彼らはゆっくりウェルの底に細胞に到達するように時間をかけて粒子の連続内在化を示している。対照的な同期ステップ（遠心分離）は、細胞との粒子接触を高め、底に沈むように粒子を強制的に、そして細胞による即時の内在化につながる。シンクロナイズド食作用は、より迅速に部品を内部化より速いプロセスであり、増加した細胞に起因するicles：粒子接触。
- それらは徐々に底に沈むと細胞との接触、細菌がウェルの底に達するとで取得することを可能にするために、より長い時間枠を利用よう細胞が連続的にオプソニン化細菌を貪食することができ、連続貪食法（図2）のための細胞とタッチします。時間経過実験を行う場合は、異なる時間間隔で細菌を追加し、処理速度を向上すると同時に、反応プレート全体を停止させる。
- 粒子を高める同期化貪食法（図2）の場合：遠心分離による細胞の接触、全ての時点の同期を容易にするために、細胞および粒子（500×gで5分）とすぐに、粒子が添加されるように、含む全プレートをスピンダウンし細胞相互作用：パーティクルを促進する。
- 右のセントリの完了後に開始時間経過を測定しますfugationステップ。経時的実験を行う場合は、以下に説明するように、異なる時間間隔で独立して、各時点で停止する。
注：同期された食作用法がやや面倒前の1からですが、短い時間でより高い貪食インデックスを提供します。
4.食作用の停止
- 接着細胞の場合は、上清を除去し、PBSで希釈したトリパンブルーの50μlのを追加：非内部化細菌の蛍光を消すためには、（1 2希釈）。
- 非接着細胞の場合は、プレートをスピンダウンし、上清を除去します。希釈されたトリパンブルーの50μlのを追加。細胞の損失を最小限に抑え、十分な洗浄を可能にするために、各洗浄の間（500×gで5〜10分）でプレートを遠心分離することを確認してください。
- パンインキュベーション後、（PBSをうまく明確になるから削除されるまで）任意の残留パンを削除するには、PBSで細胞を2回洗浄する。 Trはypanはなく、生きた細菌やOPDexビーズのために、蛍光標識した非内部化熱殺した、細菌粒子の蛍光15,16を消光することが示されている。生菌については、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、又は代わりに非内在化粒子からの蛍光の交絡効果を回避するために、トリパン洗浄などの抗生物質での洗浄が含まれる。
- PBSで洗浄し、次いで、4％パラホルムアルデヒド100μlで細胞を固定し、室温で15分間インキュベートする（各洗浄につきウェル当たり100μlで）。このステップでは、週間まで4℃で細胞を保存するか、染色および定量に直接進む。
注：すべてのその後の工程は、この点の序文には、細胞培養フードの外で行うことができます形成する。 - すべての液体を除去し、PBSで再構成5 ng / mlのでDAPIの50μlを添加する。染色のために5分を許可した後、PBSで2回洗浄します。洗浄工程の後、各ウェルのレコード食作用に50μlのPBSを追加。
5.アクチン染色
注：食作用に加えて、蛍光測定法、アクチンの強度を測定することによってアクチン重合の定量化を可能にする、葉状仮足の阻害時に低減され、pseudopodiae、および膜は、阻害剤（ 図1A）を用いた治療の結果として波打ちう。これは食作用に加えて、アクチン重合の定量化に関心のある場合は、オプションのステップです。アクチン重合が食作用のために蛍光粒子を使用して、最終的な目標である場合はオプションです。
- パラホルムアルデヒド固定（ ステップ4.3）に続いて、各洗浄のために、ウェルあたり100μlのPBSでプレートを2回洗う。透過化のためにPBS中の0.1％トリトンX-100の50μlを加え、室温で-5分間インキュベートする。
- （上記のように）PBSを用いて0.1％トリトンX-100を2回洗浄し、ラベの非特異的結合を回避するために、20分間、1％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックしL。
- ブロッキングの後、BSA溶液を除去し、すぐにローダミンファロイジンを追加します。ローダミン染色の作業溶液を調製するには、（1プレートには十分）5mlのPBSに（製造者によって提供される）メタン酸溶液100μlを使用しています。ワーキング溶液からウェルあたり50μLを加え、室温で20分間インキュベートする。
注：4.4細胞は定量化のための準備ができてステップのように洗浄ステップとDAPI染色に続いて。
6.定量
- λ= 460nmでλ= 355 nmの励起フィルターと発光フィルターを使用して、蛍光プレートリーダー、記録λ= 518 nmのλ= 488nmでの励起フィルターおよび発光フィルターを用いて緑色蛍光、および青色の蛍光を使用して、食作用を定量化する。
- λ= 355 nmおよびλ= 460nmの（上記）、および赤色インフルエンザ介して蛍光プレートリーダー、記録青色蛍光を使用してアクチン重合を定量化するλ= 584 nmおよび発光フィルターのλ= 620 nmでの励起フィルターを経由してorescence。
注：オービタルまたは中央検出は、記録のために許容可能である。いくつかの細胞型が軌道記録が有利であることができ、その場合、中央、よりよくのエッジに多くを集める。特に、軌道の周りに3点の平均値は、より正確な結果を得るために使用することができる。 - アクチンの定量化（ 図1） 対粒子標識または食作用に応じて、（DAPI）から青色蛍光読み出しによって緑色または赤色蛍光の合計RFUを分割。ハイプレート間の差異に起因して、最高の観察された傾向を説明するために、より信頼性の高い統計分析を容易にするために、（そのような= 0制御をトンと比較してのような）相対インデックスを使用。
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Representative Results
このプロトコルを使用して、食作用およびその後のアクチン重合を定量化する2つの主要な方法は、連続または同期化された食作用を観察することです。
顕微鏡分析（ 図1B）は、蛍光光度計が記録されているものと同等の蛍光像を示している（また、 図1を参照）。 図1Bにアクチンの赤色蛍光、FITCの緑色の268蛍光がHKOP Eをラベルです大腸菌 、核DAPI染色、および3つのすべての269蛍光体の合成画像一緒に。この画像は、効果的な食作用、アクチン重合、および非内在化粒子の効果的なパン270消光を示している。
J774細胞は、デキストランビーズを内部される場合には、それぞれ図2AおよびCに見られるように、オプソニン化および非オプソニン粒子の連続食作用は非常に匹敵する。興味深いことに、アクチン重合以下opsonoph非オプソニン化粒子の内在以下アクチン重合（ 図2D）は増加しないが、後の時点（ 図2B）で減速agocytosis増加する。これはオプソニン食作用がオプソニンない粒子の内部移行よりもはるかに大きいアクチン重合につながるので、これらのプロセスを調べる今後の研究のために考慮することが重要です。 MTT分析（ 図2E）を介して確認したデキストラン粒子を用いた食作用の方法のいずれも、細胞生存率の変化をもたらす。
連続的な食作用（ 図2）の間に観察された連続的に増加する傾向とは異なり、オプソニン化デキストランビーズの同期化された食作用は、30分以下の内在化の減少を示す、ベル形の傾向（ 図3A）を有する。これは、処理時間およびプロトコルの性質を考慮して予想される。この傾向はまた、アクチンPOLによって確認されている30分間の重合でベースラインに戻りながら最高重合時間点は、時間経過の初期に、これらの細胞のymerizationデータ（ 図3B）。より労働集約的であるが、この方法は、したがって、即時貪食作用を調べ、右同期後に食作用を調べるの値を有する。
図1：1のビーズ： 食作用およびアクチン重合の共焦点顕微鏡は、細胞を20でFITC共役OPDexビーズ（緑色）を内在化させた60分間の細胞の割合は、細胞は、paraforlmaldehydeで固定し、パンし、PBSで洗浄して透過処理したアセトン、およびローダミンファロイジン（赤）を使用してfのアクチンについて染色し、DAPI（青）。画像は追加のデジタル倍率60Xで共焦点顕微鏡分析を示す図である。（A）聖霊降臨祭電子バー=10μmの（B）白色バー=50μmである。（A）は 、阻害剤の添加後のアクチン重合の変化を説明します。矢印は偽足形成を示し、矢印は、細胞膜の波打ち現象の変化を示す。 図1Aはニンコビッチとロイ12から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。図2：連続的な食作用のJ774マウスマクロファージ以下の蛍光分析は、96ウェルプレートに播種し、90、60、45、30、及び15分で始まり、時間の量を変化させることで、デキストランビーズに曝露した。ビーズは、異なる時間に添加し、全ての反応のために、食作用のプロセスが同時に停止した。細胞、固定されたパンで洗浄染色し、異なるの各（B、Dは、それぞれ）。（E）MTTアッセイを行った直後の食作用に関連したオプソニン化（A）の貪食またはオプソニン（C）デキストラン粒子およびアクチン重合のために分析した時間点。この図は、ニンコビッチとロイ12から変更されている。
図3：同期化貪食次蛍光分析 FITCはOPDexビーズを10 4細胞/ウェルの細胞密度で96ウェルプレートに播種J774マウスマクロファージ細胞に添加した標識。 30分間のインキュベーション後、プレートを5分間、500×gで遠心分離した。食作用は、PBSでの洗浄、パラホルムアルデヒドfixati続いてトリパン洗浄によってx軸に記載の時点で、一度に停止した上とアクチン染色。この図は、ニンコビッチとロイ12から変更されている。
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Discussion
蛍光技術の主要な制限は、実験の分散、ならびに十分に洗浄し、非接着細胞の使用に関連する細胞の喪失である。
分散は、実験を実験からの粒子の同一の番号を維持する正確な方法ではないストック溶液の調製時に秤量し、ピペッティングなどの蛍光粒子の変化によるところが観察される。 （ - ;粒子がすぐに追加および削除t = 0の対照）実験間の変動の問題に対処するために、データは％の食作用として、例えば、相対的な用語で表現または対照からの変化を折り畳むことができる。分析のこの形式は、再現性のトレンドを生成し、制御から％の食作用の値は、実験から実験に似ています。データ分析のこの種類は3-6の実験反復して統計的有意性を促進する。蛍光技術は、効果的に観測された傾向dは検討して再生するために使用することができ十分なデータ分析を利用の場合、その変動性のespite。技術のマスタリングで、それは一日に約半96ウェルプレート、または600の処理を実行する単一の科学者のために可能である。
細胞の損失は、主に、非接着細胞タイプを用いた研究において観察されている。これらは多数の、大規模な洗浄工程を耐えることができるので、接着細胞型は、このいずれかの方法で使用するのが最適である。
主な重要なステップは、フォトブリーチングを回避するために、直接光から蛍光成分を遠ざけるように注意すべきである。粒子は、ラベル、及び各々または全ての成分を含有するプレートを暗所に保存（または単にアルミホイルに包まれ）されるべきである。もう一つの必須成分は、プレート内の技術的反復の重要性である。高いウェルによく分散するためには、ピペッティングの前に非常によく、すべての試薬を混合すると、（1行に相当）処理当たり6-8技術的反復を持つように、mのために不可欠である正確にデータの傾向を観察OST。
このようなプレートフォーマットを使用するための重要な追加の考慮事項は、プレートウェルは、試薬の比較的小さなボリュームを含む、多くの場合、蒸発しやすいということである。治療は24時間よりも長い場合には、加湿器として機能し、細胞培養培地およびアゴニストの蒸発を低減するために、PBSのみを含有する（エッジの隣の行と列）をプレートの外周のウェルを使用することが望ましい。
この手法は、マスターするのはかなり簡単であり、関係するトラブルは最小限に抑えられます。洗浄しながら（非接着細胞を使用する場合は特に）には、細胞の損失を避けるために、研究のための右の食作用の方法を選択することとに注意することが重要である。
蛍光技術の主要な意義は、蛍光粒子の内在化、またはアクチン重合をスクリーニングするためのハイスループット方法を提供することである。ほとんどのTそのような顕微鏡または微生物学などの今日まで使用さechniquesはより労働集約的であり、多くの時間と比較して消費している。フローサイトメトリー蛍光法として非常に同様の原理を利用しますが、蛍光光度法によって要求される分に比べて定量化するために時間かかります。したがって、蛍光法は高スループット能力に主として食作用の定量化の現行の方法に良い代替である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers: | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use | |
| Fluorescent plate reader - Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96-well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom - black plates |
| Multichannel pipette (8 - 12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
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