Abstract
Extinction konditionierter Furcht wurde ausgiebig bei männlichen Nagetieren untersucht. Kürzlich gab es eine zunehmende Anzahl von Studien, die zeigen, dass neuronale Mechanismen einiger Verhaltens Aufgaben und Antwortverhalten bei Frauen und Männern unterschiedlich sind. Mit Frauen in Forschungsstudien kann eine Herausforderung wegen der Veränderung der Geschlechtshormone während ihres Sexualzyklus darstellen. Dieses Protokoll beschreibt gut etablierten Verfahren, die nützlich bei der Untersuchung der Rolle von Östrogen in Angst Aussterben Gedächtniskonsolidierung bei weiblichen Ratten sind. Phase des Zyklus und exogenen Östrogengabe vor dem Aussterben Training kann Aussterben Abruf 24 Stunden später zu beeinflussen. Die vaginale Abstrichtechnik zur Östrus hier beschriebenen Phasenidentifikation unterstützt die Untersuchung und Behandlung der natürlich Radfahren Gonadenhormone. Die Verwendung dieses Grundnagetiermodell kann weiter abzugrenzen, die Mechanismen, durch die Östrogen kann Angst Aussterben Speicher zu modulierenFrauen.
Introduction
Inherent Geschlechtsunterschiede sind in verschiedenen kognitiven Verhalten und Lernparadigmen bei Mensch und Nager beobachtet. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Frauen im Allgemeinen stärker verbalen und detailorientierten Fähigkeiten, während Männer haben eine bessere räumliche Fähigkeiten 1-3. Diese Geschlechtsunterschiede kann zum Teil auf den Einfluss der Geschlechtshormone sein. Hohe Estradiolspiegel verbessern die Leistung auf Aufgaben, in denen Frauen sind besser, aber verschlechtern Leistung auf Aufgaben, die Menschen in der Regel gut zu tun 4-6. Obwohl dieser Beweis ist überzeugend, macht die begrenzte Fähigkeit, Testumgebungen vollständige Kontrolle in Studien am Menschen es schwierig, festzustellen, ob diese Auswirkungen auf das Verhalten gezielt auf Hormone zurückzuführen. Tierexperimentelle Studien im Gegensatz dazu ermöglichen die vollständig kontrollierten Bedingungen.
Obwohl die grundlegenden neuronalen Mechanismen der Angst Aussterben sind identifiziert worden und sind bei Männern untersucht, ist unklar, ob esDiese Systeme sind die gleichen bei Frauen und wie sie über die Sexualzyklus ändern. Furchtkonditionierung und das Aussterben sind weit verbreitet Verhaltensparadigmen bei Nagern und Menschen, um Studien zu Angststörungen im Zusammenhang durchzuführen. Da für Frauen haben ein höheres Risiko für Angststörungen sowie höhere Symptomdauer und Schwere 7-13, ist es kritisch, Weibchen in diesen Studien beinhalten. Die Unterrepräsentation von Frauen in dieser Studie kann auf die Herausforderungen der Östrus-Phasen-Überwachung und Bilanzierung der Auswirkungen auf das Verhalten von Sexualhormonen zurückzuführen. Labors, die untersuchen Frauen in dieser Hinsicht Begegnung Fragen, die oft nicht gemeldet oder nicht in den Verfahren zu ihrer Studien beschrieben tun.
Anzeichen dafür, bei Nagern lässt vermuten, dass Geschlechtsunterschiede in der Angst Aussterben durch Gonadenhormone 14-18 moduliert. In Furchtkonditionierung werden Tiere darauf trainiert, einen bestimmten Reiz zu fürchten. Nach einer Anzahl von unverstärktem Präsentationender Reiz, die Tiere lernen, nicht das Stichwort, einen Prozess namens Aussterben fürchten. Wie gut das Tier lernt und konsolidiert die Erinnerung an das Lernen diese Aufgabe während einer Extinktion Recall Test gegeben einige Zeit nach dem Aussterben Training beobachten. Weniger Angst Expression während Aussterben Rückruf weist eine gute Auslöschung Gedächtniskonsolidierung. Neue Ergebnisse aus unserem Labor zeigen, dass Östrogen kann die Konsolidierung der Angst Aussterben Speicher zu modulieren und zu verbessern Aussterben Rückruf. Insbesondere weiblichen Ratten, die in Proöstrus erlöschen, wird die Phase des Zyklus, in dem die zirkulierenden Östrogenspiegel Spitze, zeigen eine verbesserte Beibehaltung der vom Aussterben Speicher. Im Gegensatz dazu, Frauen, die in der Nieder Östrogen Metöstrus Phasenanzeige relativ schlechte Aussterben Rückruf gelöscht werden, die mit exogenen Estradiol Verwaltung vor oder unmittelbar nach dem Erlöschen Ausbildung 15,16 verbessert werden kann. Die neuronalen Mechanismen des Aussterbens Gedächtniskonsolidierung (inkluding die Rolle der Geschlechtshormone) bei Frauen sind nicht klar.
Bei Labortieren kann die Rolle der Hormone mit invasive chirurgische Entfernung Verfahren wie die Kastration und Ovariektomie untersucht werden. Nach Erholung von der Operation, Gonadenhormone oft exogen während der Durchführung einer Verhaltensaufgabe 19 manipuliert. Dieser Ansatz hat wichtige Informationen über Geschlechtshormone zur Verfügung gestellt und ist nützlich, da es für die gut kontrollierte Manipulationen der Geschlechtshormone (in Bezug auf Timing und Dosis) 20-23. Dieser Ansatz ist jedoch nicht beurteilen, den Einfluss der natürlich auftretenden Schwankungen, die für die Östrus-Zyklus auftritt, noch stellen sie "normal" Tieren, wodurch die Translations Potential Humanstudien einschränkend. Es ist gut dokumentiert, dass weibliche Sexualhormon Ebenen Höhepunkt und Niedergang in bestimmten Phasen des Zyklus, und Östrogen-Rezeptor-Expression Änderungen innerhalb des Zyklus,und nach Entfernung der Eierstöcke 24. Daher besteht die Notwendigkeit, Studien über Frauen mit intakten Keimdrüsen zu führen und zu verfeinern, experimentelle Designs, um die Auswirkungen der hohen und niedrigen Östrogen-Staaten können auf Frauen während ihrer gesamten Lebensdauer haben sicher zu studieren.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Wirkung von Östrogen auf die neurobiologische Systeme in Angst Aussterben beteiligt. Es wird beschrieben, wie: 1) sorgfältig den Sexualzyklus zu überwachen, 2) vorzubereiten wirksamen Dosen von Estradiol zur systemischen Verabreichung, und 3) folgen einem Verhaltens Paradigma, das Furchtkonditionierung, Aussterben umfasst, und erinnern in natürlich Radfahren weiblichen Ratten. Dieses Protokoll kann mit anderen pharmakologischen Manipulationen und zellulären und molekularen Werkzeugen geändert werden, um Studien zu unterstützen, um geschlechtsspezifische Unterschiede, die in Klima beobachtet fürchten Löschverhalten besser zu verstehen. Man beachte, dass die nachstehend beschriebenen Verfahren sind auch in unserem Labor verwendet werden, und es gibt eine Anzahl von Variationen dieser Verfahren in in der Literatur.
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Protocol
HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden von der Unterausschuss für Forschung Tierpflege, die als Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) für das Massachusetts General Hospital dient zugelassen und sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Richtlinien.
1. Tierhaltung und Handhabung Vorgehens
- Bei der Ankunft Haus erwachsenen Sprague-Dawley weiblichen Ratten etwa 8-10 Wochen alt (mit einem Gewicht von 200 bis 225 g) in Gruppen von 3-4 Zoll-Kunststoff-Behälter mit Rauhfaser Bettwäsche. Halten sie auf einer Ernährung ad libitum Zugang zu Futter und Wasser und einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus. Verlassen Ratten an die Haltungsbedingungen und Tiereinrichtung für mindestens 1 Woche akklimatisiert.
HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Manuskript während des Lichtzyklus durchgeführt. - Nach dieser Eingewöhnungszeit, behandeln alle Tiere für 5 Minuten jeweils für 2-3 Tage. Richtig holen die Ratten ein zu einer Zeit (von der Oberkörper und nicht am Schwanz unterstützt),halten sie sicher und streicheln während dieser Zeit. Behandeln Tiere, die mehr gestresst, nervös, ängstlich oder für längere Zeit angezeigt. Tun Sie dies, um zu minimieren Umgang mit Stress, die die folgenden Schritte in diesem Protokoll beeinträchtigen könnten.
HINWEIS: Die Anzahl der Tage, und die Menge an Zeit der Handhabung der Tiere können zwischen verschiedenen Labors zu variieren; Allerdings sollten diese im Einklang zwischen den Experimenten im selben Labor sein.
2. Überwachung des Zyklus: Vaginal Swab Verschmieren und Färbeverfahren
- Machen 0,9% Kochsalzlösung (in destilliertem Wasser gelöst, Natriumchlorid). Befeuchten Sie ein Wattestäbchen in dieser Lösung. Tupfen Sie die Spitze mit einem Papiertuch, um Übersättigung, was zu einer unzureichenden Probennahme oder den Verlust von Zellen führen können. Halten Sie das Heck nach oben weg von der Vagina, führen Sie den Wattestäbchen in den Vaginalkanal und rollen an den Wänden, um lose Vaginalzellen erfassen.
- Wenn das Tier uriniert auf dem FeldbettTonnen-Spitze, zu ersetzen durch eine neue, wie Urin Kontamination wird es für die Phasenanalyse erschweren. Seien Sie besonders vorsichtig, um Qualen des Tieres bei diesem Verfahren nicht dazu führen, weil die Belastung durch Stress den Sexualzyklus zu unterbrechen. Wenn Abtupfen, zielen darauf ab, einen schnellen Einsetzen und Herausziehen, die nicht zu tief, dass zusätzliche Stimulation des Gebärmutterhalses, die Scheinträchtigkeit induzieren kann minimieren erzielen.
HINWEIS: Pseudogravidität kann als azyklische Sexualzyklus, die in der Regel dauert etwa 12 Tage, dh aufeinander folgenden Tagen der Diöstrus 25 identifiziert werden. - Entfernen Sie vorsichtig die Applikatorspitze und rollen sie auf eine vorge markierten Objektträger. Drücken Sie nicht zu hart als zu viel Flüssigkeit auf dem Objektträger kann Phasenidentifikation schwer, wenn trockene machen.
HINWEIS: Eine Folie kann mehrere Tage für jedes Tier enthalten, obwohl dies kann den individuellen Wünschen entsprechend durchgeführt werden. - Sicherstellen, dass die Probentransfers auf die Folie. Die Proben werden für several aufeinander folgenden Tagen auf einer Folie, um eine bessere Übersicht und identifizieren täglich Östrus-Phasen ändert.
HINWEIS: Wenn möglich, ist es ideal, wenn die Menschen, Sammeln von Proben gleich bleiben für alle Tiere. - Sobald die Schiene trocken ist, beginnen die Färbeprotokoll für Phase Identifikation. Mit dem Färbekit (siehe Tabelle der Materialien), tauchen Folien 10 Mal in der Fixiermittel (hellblau), 10 Mal in Färbelösung (pink) und 5 mal in Gegenfärbelösung (lila). Rinse gleitet sanft unter fließendem Wasser. Lassen Sie Folien vollständig an der Luft trocknen, bevor Betrachtung unter dem Mikroskop.
HINWEIS: Die in der Regel 4-5 Tage lang Sexualzyklus besteht aus (in dieser Reihenfolge): Brunst (E), Metöstrus (M), Diöstrus (D), und Proöstrus (P) 26. Östrus durch blaue, verhornten Zellen Metöstrus von Leukozyten und einer Kombination von verhornten und kernhaltige Zellen gekennzeichnet ist Diöstrus ähnlich in Gegenwart von Zelltypen Metöstrus außer daß sie sehr schwach sind und Proöstrus von lila-gefärbten Zuschlagkernhaltiger Zellen (Abbildung 1). Es gibt verschiedene Färbeverfahren, zusätzlich zu den oben beschriebenen, die gleichermaßen wirksam Vaginalabstrich Zytologie sind. - Die Proben werden für mindestens zwei vollständige Zyklen (~ 8-10 Tage), um die Phasen genau vor dem Experiment zu überwachen. Im Einklang mit der Tageszeit die Proben entnommen werden. Sammeln Vaginalabstrich Proben täglich während und bis zum Ende des Experiments.
3. Pre-Exposition
- Vor dem Beginn des Experiments wurden die Tiere vorge aussetzen Konditionierungskammern, um den Tieren zu Rahmen (Konditionierkammern) vor jedem Verhaltenstests akklimatisieren.
- Pre-setzen die Frauen zu den Klimakammern (in schalldämpfenden Boxen befindet) mit den Haus Lichter an für 20-30 Minuten pro Tag für 3 Tage vor jedem Experiment. Weisen Sie das Feld sie vorbelichteten als ihre Kammer für das Studium sind. Gründlich reinigen ter Boxen (Wände und Böden) zwischen den Sitzungen und Tiere, um Gerüche zu entfernen, da sie das Verhalten und Sexualzyklus beeinflussen.
4. Tag 1: Habituation / Angstkonditionierung
- Sobald die Tiere wurden überprüft, um in der Brunst Phase ihrer Ovarialzyklen sein, beginnen die Gewöhnung / Anlage Phase des 3-Tage-Experiment.
- Nehmen Sie vor dem Ton Basis Maßnahmen des Einfrierens vor dem ersten Ton bedingten Reiz (CS) Präsentationen an jedem Tag des Experiments. Tun Sie dies durch den Kauf Prozent Einfrieren Scores während der Stimulus-abwesend Zeitintervall zu Beginn der ersten CS-alone Prozess vor dem Beginn CS (durch Division der Sekunden bewegungslos verbracht um die Dauer der Studie, multipliziert mit 100 berechnet).
HINWEIS: Diese Maßnahmen können verwendet werden, um zu beurteilen und zu vergleichen Baseline Gefrierpunkt Ebenen mit denen während der Gewöhnung, Anlage, Aussterben und Rückruf werden. - Zum Aussterben Ausbildung während der Metöstrus Phase durchzuführen,bedingen die Ratten in ihren letzten Tag des Östrus. Swab und identifizieren Östrus-Phase (Schritt 2) jeden Tag vor Beginn der Versuchsprotokoll (Anlage / Untergang / Recall). Wie der Brunst Phase kann länger als einen Tag dauern, Einsatzzyklus Geschichte Länge Phasen vorherzusagen, um festzustellen, wenn die Tiere sind bereit, Training zu beginnen.
- Nehmen Sie vor dem Ton Basis Maßnahmen des Einfrierens vor dem ersten Ton bedingten Reiz (CS) Präsentationen an jedem Tag des Experiments. Tun Sie dies durch den Kauf Prozent Einfrieren Scores während der Stimulus-abwesend Zeitintervall zu Beginn der ersten CS-alone Prozess vor dem Beginn CS (durch Division der Sekunden bewegungslos verbracht um die Dauer der Studie, multipliziert mit 100 berechnet).
- In den Klimakammern, schließen Sie das Fuß-Schock-Gitterboden mit einer elektrischen Stimulationsgenerator. Verwenden Sie einen Reizpegel von 0,5 bis 0,6 mA als unbedingten Reiz (USA). Verwenden Sie ein 4 kHz, 80 dB Ton als konditionierter Stimulus (CS).
ANMERKUNG: Diese Parameter können in Laboratorien variieren und kann für eine optimale Anlage verändert werden.- Wenn das Einfrieren-Analyseprogramm erfordert visuellen Hinweisen (im Gegensatz zu temporal), Co-Aktivierung eines LED-Licht mit dem Ton. Lichtposition auf der Außenseite der operKammer innerhalb des Videoframes. Zu Beginn jeder Studie, aktivieren Sie die LED-Licht und bewahren Sie es bis zum Ende des th beleuchtetE-Studie.
HINWEIS: Dieses Licht ist nicht durch das Tier zu sehen und nur als Marker für die Einleitung und Ende des Prozesses innerhalb der aufgenommenen Videodateien dient (zu verwenden, um Gefrierverhalten zu messen).
- Wenn das Einfrieren-Analyseprogramm erfordert visuellen Hinweisen (im Gegensatz zu temporal), Co-Aktivierung eines LED-Licht mit dem Ton. Lichtposition auf der Außenseite der operKammer innerhalb des Videoframes. Zu Beginn jeder Studie, aktivieren Sie die LED-Licht und bewahren Sie es bis zum Ende des th beleuchtetE-Studie.
- Legen Sie die Tiere in den Klimakammern für 5 CS-alone-Studien der Gewöhnung. Unmittelbar nach der Gewöhnungssitzung durchführen 7 gepaart CS-US-Studien der Angstkonditionierung. Stellen Sie sicher, dass die CS-Ton dauert 30 Sekunden und coterminates mit 0,5 s US Schock. Führen Sie Prüfungen in allen Sitzungen (Gewöhnung Anlage, Aussterben und Rückruf) mit einer variablen intertrial Abschnitt mit durchschnittlich 3 Minuten.
- Am Ende des Konditionierungssitzung zurück, die Tiere in ihre Heimatkäfige und auf die Tierhaltung bis zum nächsten Tag.
5. Tag 2: Estradiol Vorbereitung
- Swab und Identifizierung der Östrus-Phase für alle Tiere, die Tag 1 unterzog dieses Protokolls. Bereiten Estradiol (auch als E2, 17ß-Östradiol oder bekanntebeta-Estradiol) für eine 15 & mgr; g / kg Dosis subkutan mit Sesamöl oder 0,9% Kochsalzlösung als Vehikel.
- Um die Menge von Estradiol zu berechnen, um für Injektionszwecke zubereiten, verwenden Sie die Körpergewichte der Tiere, die gemessen und aufgezeichnet wurden, als sie am Tag 1 des Protokolls konditioniert wurden.
- Machen Sie Berechnungen, um die verabreichte Volumen von Estradiol (dh 0,2 ml) pro Ratte zu standardisieren. Da Estradiol schwer zu lösen ist aufgrund seiner Wasserunlöslichkeit und erfordert ein großes Volumen an Lösungsmittel für die geringe Dosis, wird eine Stammlösung durch Mischen von Estradiol in Sesamöl über Hitze bis gelöst. Die Lösung kann dann durch ein 0,22 um-Filter geleitet werden, um Verunreinigungen zu entfernen. Fügen Sie beispielsweise ein berechnetes Volumen einer 3,000 ug Estradiol / 1 ml Sesamöl Stammlösung auf die gesamte benötigte Menge Sesamöl, um eine 15 & mgr; g / kg Dosis in einem 0,2 ml Injektionsvolumen pro Tier zu erzielen.
Hinweis: Alternativ können Sie auch andere Formen der Östrogen tha t wasserlöslich sind und leichter zu lösen.
6. Tag 2: Estradiol Verwaltung / Extinction Ausbildung
- Verwalten des Estradiol subkutan. Heben Sie die lose Haut zwischen den Schulterblattes durch den Hals in einer leichten Prise und legen Sie die Spritzennadel in das Dreieck, das von den Hautfalten gebildet wird.
- 30 Minuten nach der subkutanen Injektion von Estradiol, legen Sie die Tiere in den Klimakammern wieder und beginnen Aussterben Ausbildung. In dieser Extinktion Sitzung auszuführen 20 CS-alone-Studien mit jedem Versuch, die aus einem 30 sec, 4 kHz, 80 dB-Ton, mit einer variablen intertrial Abschnitt mit durchschnittlich 3 min dargestellt.
HINWEIS: Die Wirkung von Östradiol auf Rückruf erfolgt, wenn Östradiol vor der Ausrottung Training oder unmittelbar nach dem Aussterben verabreicht. Der Effekt wird nicht beobachtet, 4 Stunden nach der Auslöschung, so empfiehlt es sich, zu injizieren zeitnah zu Beginn oder am Ende der Trainingseinheit 15.
- 24 Stunden nach dem Aussterben Ausbildung, Tupfer, die Tiere, die Tag 1 und 2 dieses Protokolls abgeschlossen.
- Legen Sie die Tiere in ihren zugewiesenen Klimakammern (identisch mit Day 1 und 2). Beginnen Sie mit dem Aussterben Rückruf-Sitzung durch die Vorlage 3 CS-alone-Studien (drei Studien des Aussterbens Rückruf), die wie in Schritt 6.2 beschrieben von nur 3,80 dB CS-alone Versuche mit intertrial Abständen ähnlich zu den 20 Studien für Aussterben Training verabreicht besteht.
- Nach Abschluss der Rückruf Sitzung zurück, die Tiere in ihre Heimatkäfige.
8. Datenanalyse
- Erwerben Verhaltensdaten durch Video und mit Computer-Software analysieren.
HINWEIS: Einfrieren Partituren können auch manuell durch einen Experimentator, die blind für die medikamentöse Behandlung von Zeit Einfrieren Anfälle während der CS Präsentation der einzelnen Studie ist angerechnet werden, ausgedrückt als Prozentsatz der Zeit verbrachte Einfrieren während der Ton. Das Einfrieren istdurch vollständige Mangel an Bewegung, mit Ausnahme der Atmung während der 30 Sekunden CS-US-Studien definiert. Berechnen Prozent Einfrieren, indem man die Sekunden verbrachte Einfrieren (immobile) um 30 Sekunden (Dauer der Studie), multipliziert mit 100.
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Representative Results
In diesem Furchtextinktion Rückruf-Protokoll wurde Prozent Einfrieren als Indikator für die Furcht gemessen. Tiere, die gut ausgelöscht und behielt die Erinnerung an die Auslöschung Ausbildung ausgestellt geringe Angst am letzten Tag des Verhaltenstests während Aussterben Rückruf. Männlichen und weiblichen Ratten nicht signifikant in konditionierter Furcht Ausdruck in der Anlage, vom Aussterben unterscheiden, und erinnern Phasen (Abbildung 2). Allerdings wird ein Geschlechtsunterschied deutlich, wenn die Tiere werden getrennt als Hoch- und Nieder Östrogen Östrus Phasengruppen analysiert. Weibliche Ratten, die vom Aussterben Ausbildung während der Low-Östrogen Metöstrus Phase des Zyklus durchlaufen nicht das Aussterben Speicher am Tag 3 als auch solche in Proöstrus ausgebildet (Bild 3) wieder zu verwenden. Diese Metöstrus Frauen zeigen auch deutlich größere Angst vor Rückgewinnung beim Aussterben Rückruf (schlechte Aussterben Speicher) im Vergleich zu Männern. Allerdings, wenn Metöstrus Weibchen sind subkutan Spritzten mit einer 15 ug / kg Dosis von Östradiol vor dem Aussterben Lernen, erscheint Konsolidierung der Angst Aussterben Speicher zu mehr als von niedrigen Gefrierpunkt während Aussterben Rückruf (Abbildung 4) nachgewiesen werden. Daher zeigen diese Daten, dass Geschlechtshormone kann Furchtextinktion Rückruf modulieren und auch vermitteln, geschlechtsspezifische Unterschiede in konditionierter Furcht Aussterben Verhaltensweisen.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von Zelltypen über Sexualzyklus Phasen (Vergrößerung 20X) Proöstrus durch Massen von rund, lila gefärbten kernhaltige Epithelzellen gekennzeichnet.. Brunst durch Aggregate von blau gefärbten, Plattenepithelkarzinom verhornten Zellen identifiziert werden. Metöstrus und Diöstrus Ausdruck eine Kombination von Zelltypen (Leukozyten, kernhaltigen und verhornten Zellen), zeigen aber weniger Zellen. Östrogenspiegel in den Östrus Phasen schwankenUnd erreichte während Proöstrus. (Met = Metöstrus;.. Diest = Diöstrus;. Proest = Proöstrus). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 2: Vergleich zwischen Männern und Frauen auf die drei Phasen des Experiments gibt es keine in der Gewöhnung (. Hab) beobachtete signifikante Geschlechtsunterschiede, Anlage (. Cond), Extinktion, oder erinnern Phasen des Experiments 15.
Abbildung 3: Verhaltensunterschiede zwischen Proöstrus (hohe Östrogen) und Metöstrus (niedrige Östrogen) Frauen Frauen im Hoch Östrogen Proöstrus Phase o.f der Sexualzyklus zeigen weniger Angst als die in Low-Östrogen Metöstrus. Diese Daten legen nahe, dass der Östrogenspiegel in natürlich Radfahren Weibchen können die Konsolidierung der Angst Aussterben Speicher zu beeinflussen, modulieren Rückruf 24 Stunden später 15.
Abbildung 4: Östrogen-Behandlung in Metöstrus Frauen. Die Verabreichung von Östradiol 30 Minuten vor dem Aussterben Ausbildung (Pfeil) erleichtert Aussterben Rückruf im Vergleich zum Fahrzeug 16.
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Discussion
Angst Aussterben wurde ausgiebig bei männlichen Ratten mit den neuronalen Mechanismen der Vermittlung konditionierter Furcht Aussterben identifiziert und unter verschiedenen Manipulationen bewertet sucht. Relativ wenige Studien haben weiblichen Ratten oder die Rolle der Geschlechtshormone in Angst Aussterben sucht. Um die Wirkung von Östrogen auf Furchtextinktion speziell zu untersuchen, werden natürlich Radfahren weiblichen Ratten zu einem dreitägigen Verhaltensparadigma unterzogen. Dieses Verfahren besteht aus Gewöhnung / Anlage, Aussterben, und vom Aussterben Rückruf Phasen. Mit diesem Protokoll wurde gezeigt, dass weibliche Ratten während der Low-Östrogen Metöstrus Phase zeigen eine höhere Gefrierpunkt (oder wertgemindert Aussterben Rückruf) im Vergleich zu Frauen, die in High-Östrogen Proöstrus 15 ausgelöscht sind vom Aussterben geschult. Die Verabreichung von Estradiol während der Metöstrus Phase vor dem Aussterben Ausbildung moduliert die Konsolidierung des Aussterbens Speicher 16. Dies wird durch eine Abnahme der freezin nachgewieseng während Aussterben Rückruf. Gemeinsam unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung der Durchführung von weiblichen Studien mit Augenmerk auf den Einfluss der Eierstockhormone und des Zyklus auf das Verhalten. Obwohl Kontrollversuche wurden hier nicht beschrieben wurde, ist es notwendig, die entsprechenden Kontrollen sind, dh ohne Aussterben Gruppen, um den Einfluss von Östrogen auf Prozesse im Aussterben Gedächtniskonsolidierung einbezogen weiter zu evaluieren.
Der Zweck dieses Protokolls ist zweifach: 1), um die Effekte von Östrogen auf Anlage Furchtextinktion während bestimmter Phasen des Zyklus in intakten Tieren zu untersuchen, und 2) zu prüfen, wie akute Estradiol Ersatzlieferung während der weibliche ist in der Regel niedrige Östrogen Staat modulieren sein Verhalten. Durch die hier beschriebenen vaginalen Abstrichverfahren können die vier Phasen des Zyklus identifiziert werden: Brunst, Metöstrus, Diöstrus und Proöstrus. Dies erlaubt uns, das Verhalten zu bewerten, wenn Eierstockhormone such als Östrogen sind von Natur aus bei niedrigen und hohen Konzentrationen. Zum Beispiel der Östrogenspiegel niedrig sind während der Brunst (20-40 pg / ml), Metöstrus (15-20 pg / ml), und Diöstrus (25-40 pg / ml) Phasen, aber hoch im Proöstrus (~ 75 pg / ml) Phase des Zyklus 27,28. Diese Phasen unterscheiden sich nicht nur in hormonelle Milieu, sondern auch in der Dauer. Obwohl variable hat Proöstrus wurde beobachtet, dass in der Regel für 12 bis 14 Stunden dauern; Brunst für 25 bis 27 h; Metöstrus für 6 bis 8 h; und Diöstrus für 55 bis 57 h. Die Dauer jeder Phase kann länger oder kürzer als ein Tag (je nach dem Tier) sein, was zu einer 5-Tage-Zyklen, die 2 Tage entweder Diöstrus oder Östrus umfassen. Wie bereits erwähnt, Proöstrus und Metöstrus kürzere Phasen (14.12 und 08.06 h zuge) und darf fehlen. In diesem Protokoll ist es deshalb wichtig, bei der Verwendung von natürlich Radfahren Hormone des Tieres zu Interphasen-Unterschiede in der Fähigkeit zum Aussterben Training wieder zu prüfen, sorgfältig überwachen den Sexualzyklusvom Vortag. Der Sexualzyklus bei weiblichen Ratten, ähnlich wie das menschliche Menstruationszyklus, ist auch empfindlich auf zahlreiche externe Faktoren, wie Alter, Stress, Tageszeit, Wohnverhältnisse, Temperatur, etc., und sollte bei der Planung Experimente werden. Ein Tier kann azyklisch (extended Östrus / Diöstrus) geworden oder zeigen eine unregelmäßige Zyklus (kürzer als 4 Tage oder länger als 5 Tage) vor oder während der Studie. In diesem Fall würden die Tiere aus den experimentellen Analysen ausgeschlossen werden, wobei die während bestimmter Phasen des Zyklus streng Tests. Wichtig zu beachten sind Übergangsphasen, in denen die Proben mit Schleim gemischt, so dass es etwas schwierig, klar die spezifischen Zelltypen, die in jeder Phase zu charakterisieren identifizieren. Dies kann auch aufgrund der Zeit, des Tages, der Tupfer entnommen werden. Wenn es eine übermäßige Menge an Schleim-Ausfluss während Abstrich Sammlung als Folge der täglichen swabbing, so dass mehrere Handling Tagen ohne Abstrich gebenkann dieses Problem zu beheben.
Zusätzlich zu den hier beschriebenen Östrus Phasenerkennungsverfahren können auch andere methodische Instrumente eingesetzt werden, um Maßnahmen der zirkulierenden Serum Eierstockhormonkonzentrationen zu erhalten. Beispielsweise kann Östrogenkonzentration in Blutproben unter Verwendung eines Enzym-gekoppelten Immunassay (ELISA) quantifiziert werden. In diesem Verfahren, Östrogene im Serum / Plasma-Proben zu einem spezifischen Anti-Östrogen-Antikörper, der an ein Enzym gebunden ist, zu binden. Das Substrat des Enzyms erzeugt eine Reaktion, die in einem sichtbaren Signal führt, wie einer Farbänderung, die mit einem Spektralphotometer gemessen werden kann. Dieses Werkzeug berechnet Absorption und eine Quantifizierung von Östrogenspiegel in der Probe. Dieses Verfahren kann bei der Beurteilung natürlich schwank Estradiolspiegel auf der Östruszyklus, und noch wichtiger, zu bestimmten Zeitpunkten während des Experiments. Es kann auch verwendet werden, um festzustellen, wie exogene Verabreichung von Östrogen kann Norm verändernal physiologischen Konzentrationen. Die Messung der Östrogenkonzentrationen von Blut kann Schwierigkeiten mit Phasenidentifikation beim Übergang Stadien zu verhindern, oder wenn Abstriche sind schwer zu lesen durch Schleim in den Proben. Leider kann dieses Verfahren sehr teuer geworden und Angebote verzögert Ergebnisse im Vergleich zu Vaginalabstrich Sammlung.
Verfahren, um eine ausreichende Blutproben zu erhalten, z. B., über die Schwanzvene, orbitalen Sinus, Schwanz Snip und Vena saphena 29 kann unnötigen Stress für das Tier zu verursachen. Dies kann Hormonspiegel in kritischen Zeiten im Experiment auswirken, was zu ungenauen Messungen oder verzerrt. Mit Koffer Blut Estradiolspiegel zu messen ist Klemme und somit eine sehr begrenzte Informationen über hormonelle Schwankungen innerhalb der Phasen. Die Beurteilung vaginalen Zell Zytologie scheint eine bessere Alternative bieten. Obwohl diese Methode kann nur eine grobe Schätzung der Eierstockhormonprofile über Östrus Phasen, kann esminimieren Stress und anschließend weniger störend auf die Verhaltensexperiment.
Es gibt verschiedene Formen von östrogenen Steroiden, die natürlicherweise im Umlauf sind bei Menschen und nicht-menschliche Tiere, wie Estriol, Estradiol und Estron. In diesem Protokoll wird Estradiol akut subkutane Injektionen verabreicht. Estradiol (Synonym E2, 17ß-Östradiol oder beta-Estradiol) in diesem Protokoll verwendet, weil es das stärkste Form der natürlich vorkommenden Östrogen bei nicht schwangeren Frauen 30. Im Gegensatz zu akuten Injektionen von Estradiol, haben andere Laboratorien Methoden der chronischen Östrogen Verwaltung beschäftigt. Zum Beispiel, subkutane Implantate von Slow-Release-Pellets oder Silastic Kapseln ermöglichen eine stetige, kontinuierliche Lieferung von Östrogen oder Trägerlösung 19. Dieses Verfahren wird typischerweise in Verbindung mit Ovar-, die normalen Reproduktionszustand des Tieres zu eliminieren.
Der Manipu-schriften hier besprochenen konzentrieren sich auf natürliche hormonelle Zustände bis zur klinischen Anwendung der Laborbefunde zu erleichtern. Menschen mit posttraumatischen Belastungsstörung (PTSD) sind häufig in ihrer Fähigkeit, die Angst vor einer Konjunktur ihrer traumatischen Erfahrung im Zusammenhang löschen und diese vom Aussterben erinnern beeinträchtigt. Dieser Zustand besteht oft noch lange nach der Veranstaltung übergeben. Längere Exposition Therapie ist eine häufige Behandlungsoption für PTSD, die auf vom Aussterben basierte Prozesse in Tiermodellen untersucht, wie die hier beschriebenen beruht. Interessanterweise sind Frauen etwa doppelt so häufig wie Männer, um Stress und Angst im Zusammenhang mit psychiatrischen Störungen 31 zu entwickeln. Dieser Geschlechtsunterschied in der Prävalenz kann auf Geschlechtsunterschiede in der Angst Aussterben Prozessen verknüpft werden und die Voraussetzung für die mögliche klinische Bedeutung dieser Laborbefunde. Trotz der höheren Prävalenz von PTSD bei Frauen relativ wenige fürchten Aussterben Studien an Nagern haben bei Frauen durchgeführt. Weiblich Studien konzentrieren siching über die Rolle der Geschlechtshormone nicht bei der Prüfung der Geschlechtsunterschiede im Verhalten zu übersehen. Charakterisierung der Auswirkungen auf das Verhalten von natürlich schwankenden Hormonspiegel über den Sexualzyklus bietet wertvolle Einblicke in die grundlegenden Unterschiede im Verhalten zwischen Männern und Frauen. Dieses Protokoll liefert ein Basismodell zur zukünftigen Studien von Eierstockhormone und deren Einfluss auf die, aber nicht beschränkt auf, kognitiven und Verhaltensprozessen begrenzt wie Furchtextinktion erleichtern. Dieses Protokoll konzentriert sich auf eine spezifische gonadale Hormon, Östrogen, aber die Wirkung anderer Hormone wie Progesteron und Testosteron kann ebenfalls ausgewertet werden. Mit dem Verhaltensparadigma in Verbindung mit anderen pharmakologischen, zelluläre und molekulare Techniken hier vorgestellten (dh lokale Arzneimittelinfusionen, Immunhistochemie, Western Blot), die zukünftige Forschung kann bestimmte Websites / Ziele von Östrogen Wirkung im Gehirn, die Verhaltenstherapie ergänzen könnten.
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Disclosures
Die Autoren des Manuskripts haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte offenlegen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
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