Abstract
A extinção do medo condicionado tem sido extensivamente estudada em roedores machos. Recentemente, tem havido um número crescente de estudos que indicam que os mecanismos neurais para certas tarefas comportamentais e comportamentos de resposta são diferentes em fêmeas e machos. Usando fêmeas em estudos de pesquisa pode representar um desafio por causa da variação de hormônios sexuais durante o ciclo estral. Este protocolo descreve procedimentos bem estabelecidos que são úteis para investigar o papel do estrogénio na extinção medo a consolidação da memória em ratos fêmeas. Fase do ciclo estral e administração de estrogênio exógeno antes do treino extinção pode influenciar recordação extinção 24 horas mais tarde. A técnica de swab vaginal para identificação fase de estro descrito aqui ajuda o exame e manipulação de ciclismo naturalmente hormônios sexuais. O uso deste modelo básico roedor pode delimitar melhor os mecanismos pelos quais o estrogênio podem modular memória extinção do medo emfêmeas.
Introduction
Diferenças sexuais inerentes são observados em vários comportamentos cognitivos e paradigmas de aprendizagem em humanos e roedores. Por exemplo, foi relatado que as mulheres geralmente têm habilidades verbais e orientada para o detalhe mais fortes, enquanto os homens têm melhores habilidades espaciais 1-3. Estas diferenças entre os sexos pode ser em parte devido à influência dos hormônios sexuais. Altos níveis de estradiol melhorar o desempenho em tarefas em que as mulheres são melhores, mas pioram o desempenho em tarefas que os homens geralmente fazem bem 4-6. Embora esta evidência é convincente, a capacidade limitada de controlar completamente ambientes experimentais em estudos humanos torna difícil determinar se esses efeitos sobre o comportamento pode ser atribuído especificamente aos hormônios. Os estudos em animais, em contraste, permite a circunstâncias totalmente controladas.
Embora os mecanismos neurais básicos de extinção do medo, foram identificados e são bem estudada em machos, não é claro seestes sistemas são os mesmos em fêmeas ou como eles mudam ao longo do ciclo estral. O condicionamento do medo e extinção são amplamente utilizados paradigmas comportamentais em roedores e humanos para realizar estudos relacionados a transtornos de ansiedade. Dado que as mulheres têm um maior risco de transtornos de ansiedade, bem como a duração dos sintomas e a gravidade maior 7-13, é crítico para incluir fêmeas nestes estudos. A sub-representação das mulheres na pesquisa pode ser atribuída aos desafios de monitoramento fase de estro e contábil para os efeitos comportamentais de hormônios sexuais. Laboratórios que fazem examinar fêmeas nesta problemas encontro em conta que muitas vezes passam não declarada ou não estão descritos nos métodos para seus estudos.
Emergentes evidência em roedores sugere que as diferenças sexuais em extinção do medo são modulados por hormonas sexuais 14-18. Com medo condicionado, os animais são treinados para temer um estímulo particular. Depois de uma série de apresentações de unreinforcedo estímulo, os animais aprendem a não temer a sugestão, um processo chamado de extinção. Como bem o animal aprende e consolida a memória de aprender esta tarefa pode ser observado durante um teste de recordação extinção dado algum tempo após o treinamento extinção. Menos expressão medo durante a chamada extinção demonstra boa consolidação da memória extinção. Descobertas recentes de nosso laboratório sugerem que o estrogênio pode modular a consolidação da memória de extinção do medo e melhorar a recordação extinção. Especificamente, os ratos fêmeas que são extintas em proestro, a fase do ciclo estral, durante o qual os níveis circulantes de estrogênio pico, apresentam uma melhor retenção de memória extinção. Em contraste, as mulheres que se extinguem no visor fase metaestro baixo estrogênio relativamente pobre recordação extinção, o que pode ser melhorado com a administração de estradiol exógeno antes ou imediatamente após o treino extinção 15,16. Os mecanismos neurais da extinção consolidação da memória (including o papel dos hormônios sexuais) em fêmeas não são claras.
Em animais de laboratório, o papel dos hormônios pode ser investigado utilizando procedimentos de remoção cirúrgicos invasivos, como a castração e ooforectomia. Após a recuperação da cirurgia, os hormônios sexuais são frequentemente exogenamente manipulada durante a realização de uma tarefa comportamental 19. Esta abordagem tem fornecido informações importantes sobre os hormônios sexuais e é útil porque permite manipulações bem controlados de hormônios sexuais (em termos de tempo e dose) 20-23. Esta abordagem, no entanto, não se avaliar a influência das flutuações naturais que ocorrem em todo o ciclo estral nem representam animais "normais", limitando assim o potencial de translação para estudos em seres humanos. Tem sido bem documentado que os níveis das hormonas sexuais femininas pico e declínio em fases específicas do ciclo estral, e as alterações de expressão de receptor de estrogénio no ciclo, ae 24 após a ovariectomia. Assim, existe a necessidade de realizar estudos sobre as fêmeas com gônadas intactas e refinar modelos experimentais para estudar com segurança os efeitos que os estados altos e baixos de estrogênio pode ter sobre as mulheres ao longo da sua vida útil.
Este protocolo incide sobre o efeito do estrogênio sobre os sistemas neurobiológicos envolvidos na extinção do medo. Ele descreve como: 1) monitorar cuidadosamente o ciclo estral, 2) preparar as doses eficazes de estradiol para administração sistêmica, e 3) seguem um paradigma comportamental que inclui o condicionamento do medo, extinção, e recordar na naturalmente ciclismo ratas. Este protocolo pode ser modificado com outras manipulações farmacológicas e ferramentas celulares e moleculares para auxiliar estudos para compreender melhor as diferenças de sexo que são observados no medo condicionado comportamento extinção. Note-se que os procedimentos descritos abaixo são aqueles utilizados no nosso laboratório, e existe uma série de variações destes procedimentos in literatura.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos descritos neste protocolo ter sido aprovado pela Subcomissão de Investigação Animal Care, que serve como Cuidado e Uso Comitê de animal Institucional (IACUC) para o Hospital Geral de Massachusetts, e estão de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde.
1. animal Habitação e Procedimento Handling
- Após a chegada, os ratos fêmeas casa adulto Sprague Dawley cerca de 8-10 semanas de idade (pesando 200-225 g) em grupos de caixas de plástico 3-4 polegadas com cama de lascas de madeira. Mantê-los em uma dieta de acesso ad libitum à comida e água e um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz. Deixar ratos para se aclimatar às condições de habitação e de animais facilidade para um mínimo de 1 semana.
NOTA: Todos os procedimentos deste manuscrito são realizados durante o ciclo de luz. - Após este período de aclimatação, lidar com todos os animais durante 5 min cada, para 2-3 dias. Adequadamente pegar a ratos, uma de cada vez (suportado pelo tronco e não pela cauda),mantê-los de forma segura, e acariciá-los durante este tempo. Lidar com os animais que aparecem mais estressado, nervoso ou ansioso por longos períodos de tempo. Faça isso para minimizar a lidar com o estresse, o que pode afetar os seguintes passos neste protocolo.
NOTA: O número de dias e quantidade de tempo lidar com os animais pode variar entre diferentes laboratórios; no entanto, estes devem ser coerentes entre os experimentos dentro do mesmo laboratório.
2. Monitorização do ciclo estral: Vaginal Swab Manchas e Procedimento de coloração
- Adicione solução salina a 0,9% (cloreto de sódio dissolvido em água destilada). Umedeça um aplicador com ponta de algodão nesta solução. Blot a ponta usando uma toalha de papel para evitar a saturação excessiva, o que poderia levar a coleta de amostra insuficiente ou perda de células. Segurando a cauda para cima longe da abertura vaginal, insira suavemente a ponta de algodão dentro do canal vaginal e rolar em torno das paredes para capturar células vaginais soltos.
- Se o animal urina na camaponta ton, substitua-o por um novo, como a contaminação da urina irá tornar mais difícil para a identificação de fase. Tenha muito cuidado para não causar sofrimento ao animal durante este procedimento, porque a exposição ao estresse vai interromper o ciclo estral. Ao recolher amostras, visam alcançar uma inserção rápida e retirada que não é muito profundo como para minimizar o estímulo extra para o colo do útero, o que pode induzir a pseudociese.
NOTA: pseudogestação pode ser identificado como um ciclo estral acíclicos que tipicamente dura cerca de 12 dias, isto é, dias consecutivos de diestro 25. - Retire com cuidado a ponta do aplicador e enrolá-lo sobre uma lâmina de microscópio pré-rotulados. Evite pressioná muito difícil como muito líquido no slide pode fazer identificação de fase difícil, uma vez seco.
NOTA: Um slide pode conter vários dias para cada animal, embora isso possa ser feito de acordo com as preferências individuais. - Certifique-se que as transferências de amostra para o slide. Coleta de amostras para Several dias consecutivos em uma lâmina para ser capaz de melhor acompanhar e identificar fases estral diárias alterações.
NOTA: Se possível, também é ideal se as pessoas que coletam amostras de continuar a ser a mesma para todos os animais. - Uma vez que a lâmina é seco, comece o protocolo de coloração para a identificação da fase. Usando o kit de coloração (ver Tabela de Materiais), mergulhar slides de 10 vezes no fixador (azul claro), 10 vezes em solução corante (cor de rosa), e 5 vezes em solução counterstain (roxo). Lavar as lâminas com cuidado em água corrente. Vamos lâminas completamente ar seco antes de ver ao microscópio.
NOTA: O longo ciclo estral tipicamente 4-5 dias consiste de (nesta ordem): estro (E), metaestro (M), diestro (D), e proestro 26 (P). O estro é caracterizado por células azuis, cornificado, metaestro por leucócitos e uma combinação de células cornificadas e nucleadas, diestro é semelhante ao metaestro na presença de tipos de células excepto eles são muito escassos, e por agregados proestro roxo-coradascélulas de nucleadas (Figura 1). Existem vários procedimentos de coloração, em adição às descritas acima, que são igualmente eficazes para citologia vaginal esfregaço. - Recolha de amostras para, pelo menos, dois ciclos completos (~ 8-10 dias), a fim de controlar com precisão as fases antes da experimentação. Seja consistente com a hora do dia da colheita de amostras. Coletar amostras de esfregaço vaginal diariamente durante e até o final do experimento.
3. Pré-exposição
- Antes do início do experimento, pré-expor os animais ao condicionamento câmaras que os animais possam se adaptar ao contexto (câmaras de condicionamento) antes de qualquer teste comportamental.
- Pré-expor as fêmeas para as câmaras de condicionamento (localizados em caixas atenuantes de sons), com as luzes da casa por 20-30 min por dia durante 3 dias antes de qualquer experimentação. Atribuir a caixa eles são pré-expostos a como a sua câmara para o estudo. Limpe bem tele caixas (paredes e bandejas) entre as sessões e animais para remover os odores, pois podem afetar o comportamento e ciclo estral.
4. Dia 1: Habituação / Medo Condicionado
- Uma vez que os animais tenham sido verificada na fase do estro dos seus ciclos estrais, começar a fase de habituação / condicionamento da experiência de 3 dias.
- Tome pré-tom medidas iniciais de congelamento prévio para o estímulo condicionado primeiro tom (CS) apresentações em cada dia do experimento. Faça isso por meio da aquisição pontuações por cento de congelamento (calculado dividindo o segundos gastos imóvel pela duração do julgamento, multiplicado por 100) durante o intervalo de tempo de estímulo ausente no início do primeiro julgamento CS-alone antes do início CS.
NOTA: Estas medidas podem ser usados para avaliar e comparar os níveis de congelamento da linha de base com aquelas durante habituação, condicionado, extinção, e recall. - Para realizar o treinamento extinção durante a fase de metaestro,condicionar os ratos no seu último dia de estro. Swab e identificar fase de estro (passo 2) todos os dias antes de iniciar o protocolo experimental (condicionado / extinção / chamada). Como a fase do cio pode durar mais de um dia, o uso história ciclo de prever duração das fases para determinar quando os animais estão prontos para começar a treinar.
- Tome pré-tom medidas iniciais de congelamento prévio para o estímulo condicionado primeiro tom (CS) apresentações em cada dia do experimento. Faça isso por meio da aquisição pontuações por cento de congelamento (calculado dividindo o segundos gastos imóvel pela duração do julgamento, multiplicado por 100) durante o intervalo de tempo de estímulo ausente no início do primeiro julgamento CS-alone antes do início CS.
- Nas câmaras condicionado, ligue o chão grade pé-choque para um gerador de estimulação elétrica. Usar um nível de estimulação de 0,5-0,6 mA como o estímulo não condicionado (US). Use um kHz 4, 80 dB tom como o estímulo condicionado (CS).
NOTA: Estes parâmetros podem variar entre laboratórios e podem ser modificados para o condicionamento ideal.- Se o programa de análise de congelação requer sinais visuais (em oposição a temporal), co-activar uma luz LED com o tom. Posicionar a luz do lado de fora da câmara operante, dentro do quadro de vídeo. No início de cada ensaio, activar o diodo emissor de luz iluminada e mantê-lo até que a extremidade do the julgamento.
NOTA: Esta luz não é visível pelo animal e serve apenas como um marcador para o início e final do julgamento dentro dos arquivos de vídeo gravados (a ser usado para medir o comportamento de congelamento).
- Se o programa de análise de congelação requer sinais visuais (em oposição a temporal), co-activar uma luz LED com o tom. Posicionar a luz do lado de fora da câmara operante, dentro do quadro de vídeo. No início de cada ensaio, activar o diodo emissor de luz iluminada e mantê-lo até que a extremidade do the julgamento.
- Coloque os animais para dentro das câmaras de condicionamento para 5 ensaios CS-alone de habituação. Imediatamente após a sessão de habituação, executar 7 ensaios CS-americanas de medo condicionado emparelhados. Certifique-se de que o tom CS tem a duração de 30 segundos e coterminates com o choque sec US 0,5. Ensaios são executados em todas as sessões (habituação, condicionado, extinção, e de recall), com um intervalo entre variável média de 3 minutos.
- No fim da sessão de condicionamento, os animais regressar às suas gaiolas de alojamento e à instalação para animais até ao dia seguinte.
5. Dia 2: Estradiol Preparação
- Swab e identificar a fase de estro para todos os animais que foram submetidos Dia 1 do presente protocolo. Prepare o estradiol (também conhecida como E2, 17beta-estradiol, oubeta-estradiol) para a 15 ug / kg de dose de injecção subcutânea utilizando óleo de sésamo ou de 0,9% solução salina como veículo.
- Para calcular a quantidade de estradiol para se preparar para injeções, use os pesos corporais de todos os animais, que foram medidos e registados quando eles foram condicionados no dia 1 deste protocolo.
- Faça os cálculos para padronizar o volume administrado de estradiol (ou seja, 0,2 ml) por rato. Dado que o estradiol é de difícil dissolução, devido à sua insolubilidade em água e requer um grande volume de solvente para a dose pequena, preparar uma solução de reserva por mistura de estradiol em óleo de sésamo sobre o calor até se dissolver. A solução pode então ser passada através de um filtro de 0,22 um, para remover contaminantes. Por exemplo, adicionar um volume calculado de a / 1 ml de solução de óleo de sésamo 3,000 ug de estradiol para o volume total necessário de óleo de sésamo, a fim de atingir um 15 ug / kg num volume de 0,2 ml injecção por animal.
NOTA: Como alternativa, utilizar outras formas de estrogênio tha t são solúveis em água e mais fácil de dissolver.
6. Dia 2: Administração Estradiol / Formação Extinction
- Administrar o estradiol subcutaneamente. Levante a pele solta entre a escápula pelo pescoço em uma pitada suave e inserir a agulha da seringa no triângulo que é formada pelas dobras.
- 30 minutos após as injecções subcutâneas de estradiol, colocar os animais nas câmaras de condicionamento e de novo começar a formação de extinção. Nesta sessão extinção, realizar 20 CS-alone ensaios, com cada ensaio que consiste em um 30 seg, 4 kHz, 80 tom dB, apresentado em um intervalo entre variável média de 3 min.
NOTA: O efeito do estradiol na recordação ocorre quando o estradiol é administrado antes da formação extinção ou imediatamente após a extinção. O efeito não é observado 4 horas após a extinção, por isso é recomendado para injetar próximo da hora de início ou no final da sessão de treinamento 15.
- 24 horas após o treinamento extinção, pincelar os animais que Dia 1 e 2 do presente protocolo concluídas.
- Coloque os animais em suas câmaras de condicionamento atribuídos (o mesmo que o dia 1 e 2). Inicie a sessão recordação extinção, apresentando 3 CS-alone ensaios (os três ensaios de recordação extinção), que consiste de apenas 3,80 dB CS-alone ensaios com intervalos entre tentativas semelhantes às 20 ensaios administrados para o treinamento extinção como descrito no passo 6.2.
- Após a conclusão da sessão de recall, retornar os animais para suas gaiolas.
Análise 8. Dados
- Adquirir dados comportamentais através de vídeo e analisá-los utilizando programas de computador.
NOTA: Congelamento pontuações também podem ser contadas manualmente por um experimentador que é cego para o tratamento medicamentoso cronometrando episódios de congelamento durante a apresentação CS de cada julgamento, expresso em percentagem do tempo gasto congelamento durante o tom. O congelamento édefinido pela completa falta de movimento, com excepção da respiração durante os ensaios 30 sec CS-americanos. Calcule por cento congelamento dividindo os segundos gastos congelamento (imóvel) por 30 segundos (duração do julgamento) multiplicado por 100.
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Representative Results
Neste protocolo recordação extinção do medo, por cento congelamento foi medida como um indicador do medo. Animais que extinguiu bem e retidos a memória da formação extinção exibiu baixa medo no último dia do teste comportamental durante a chamada extinção. Ratos machos e fêmeas não apresentam diferenças significativas na expressão de medo condicionado durante o condicionamento, extinção, e recordar as fases (Figura 2). No entanto, a diferença entre os sexos se torna evidente quando os animais são analisados separadamente como grupos fase de estro de alto e baixo de estrogênio. Ratas que passam por treinamento extinção durante a fase de baixa estrogênio metaestro do ciclo estral não chamar a memória de extinção no dia 3, bem como aqueles formados em proestro (Figura 3). Estas fêmeas metaestro também apresentam significativamente maior recuperação de medo durante a chamada extinção (memória extinção pobres) em comparação com os homens. No entanto, quando as fêmeas são metaestro INJEC subcutaneamenteted com uma dose / kg 15 mg de estradiol antes da aprendizagem extinção, a consolidação da memória extinção do medo parece estar aumentada, como demonstrado pela baixa congelamento durante a chamada extinção (Figura 4). Portanto, estes dados indicam que as hormonas sexuais podem modular recordação extinção do medo e também mediar as diferenças sexuais no comportamento de extinção medo condicionado.
Figura 1: Imagens representativas de tipos de células em todo fases do ciclo estral (ampliação de 20X) proestro é caracterizada por massas de células epiteliais, nucleadas roxo manchada redondas.. Estro pode ser identificado por agregados de células cornificadas escamosas, coradas de azul. Metaestro e diestro expressar uma combinação de tipos de células (leucócitos, células nucleadas e cornificadas) mas apresentam menos células. Os níveis de estrogênio flutuar ao longo das fases de estro, Atingindo o pico durante proestrus. (Met = metaestro;.. Diest = diestro;. Proest = proestrus). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Comparação entre machos e fêmeas nas três fases do experimento Não há diferenças sexuais significativas observadas na habituação (. Hab), condicionado (. Cond), extinção, ou recordar as fases do experimento 15.
Figura 3: diferenças de comportamento entre proestrus (alta de estrogênio) e metaestro (baixo estrogênio) fêmeas femininas do high-estrogênio fase de proestro o.f a exposição do ciclo estral menos medo do que aqueles em metaestro low-estrogênio. Estes dados sugerem que os níveis de estrogênio em mulheres naturalmente ciclismo pode influenciar a consolidação da memória de extinção do medo, modulando recordatório de 24 horas mais tarde 15.
Figura 4: O tratamento com estrogênio em mulheres metaestro. A administração de estradiol 30 min antes do treino de extinção (seta) facilita a lembrança extinção em relação ao veículo 16.
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Discussion
Extinção do medo tem sido extensivamente estudada em ratos machos com os mecanismos neurais que medeiam extinção medo condicionado identificados e avaliados sob várias manipulações. Relativamente poucos estudos analisaram ratas ou o papel das hormonas sexuais na extinção do medo. Para estudar especificamente os efeitos do estrogénio sobre a extinção do medo, naturalmente ciclagem ratas são submetidos a um paradigma comportamental de três dias. Este procedimento consiste em fases habituação / condicionado, extinção, e extinção de recall. Usando este protocolo, tem sido demonstrado que ratos fêmeas treinou com extinção durante a baixa-estrogénio exposição fase metaestro maior congelamento (ou recordação extinção prejudicada) em comparação com as mulheres que são extintas em proestrus high-estrógeno 15. A administração de estradiol antes do treino extinção durante a fase de metaestro modula a consolidação da memória de extinção 16. Isto é demonstrado por uma diminuição na congelaçãog durante a chamada extinção. Juntos, estes resultados destacam a importância da realização de estudos femininos com atenção para a influência dos hormônios ovarianos e do ciclo estral no comportamento. Embora as experiências de controlo, não foram descritas aqui, será necessário incluir os controlos adequados, isto é, não há grupos de extinção, para melhor avaliar a influência do estrogénio sobre os processos envolvidos no processo de consolidação da memória extinção.
O objectivo deste protocolo é duplo: 1) para investigar os efeitos do estrogênio sobre o medo extinção condicionado durante fases específicas do ciclo estral em animais intactos, e 2) para examinar como aguda estradiol substituição durante o sexo feminino é normalmente baixo estado de estrogênio pode modular o seu comportamento. Através do processo de esfregação vaginal aqui descrita, as quatro fases do ciclo estral podem ser identificadas: estro, metaestro, diestro, e proestro. Isso nos permite avaliar o comportamento quando ovário hormônios such como estrogénio são naturalmente a baixas e altas concentrações. Por exemplo, os níveis de estrogênio são baixos durante o estro (20-40 pg / ml), metaestro (15-20 pg / ml), e diestro (25-40 pg / ml) fases, mas alta durante o proestro (~ 75 pg / mL) fase do ciclo estral 27,28. Estas fases não só diferem em meio hormonal, mas também em termos de duração. Embora variável, proestro foi observada tipicamente para durar 12 a 14 horas; estro de 25 a 27 horas; metaestro de 6 a 8 horas; e diestro para 55 a 57 horas. A duração de cada fase pode ser mais longo ou mais curto do que um dia (dependendo do animal), que conduz a ciclos de 5 dias que incluem de 2 dias de diestro, quer ou estro. Como mencionado, proestro e metaestro são fases mais curtas (12-14 e 6-8 h, respectivamente) e pode ser desperdiçada. Neste protocolo, é, portanto, fundamental para monitorar cuidadosamente o ciclo estral ao usar hormônios naturalmente ciclismo do animal para examinar as diferenças inter-fase na capacidade de recordar formação extinçãodesde o dia anterior. O ciclo estral em ratas, bem como o ciclo menstrual humano, também é sensível a vários factores externos, tais como a idade, o stress, a hora do dia, condições de alojamento, temperatura, etc., e devem ser considerados ao planear experiências. Um animal pode se tornar acíclico (extended estro / diestro) ou exibir um ciclo irregular (inferiores a 4 dias ou mais de 5 dias) antes ou durante o estudo. Neste caso, estes animais seriam excluídos das análises experimentais, como rigorosa para testes durante fases específicas do ciclo estral. Importante notar são fases de transição durante o qual as amostras são misturadas com muco, tornando-o um pouco difícil identificar claramente os tipos de células específicas que caracterizam cada fase. Isto também pode ser devido ao tempo do dia em que o cotonete é levada. Se há uma quantidade excessiva de muco semelhante a descarga durante a recolha de mancha como um resultado de zaragatoa diariamente, permitindo a manipulação de vários dias sem passar swabbingpode resolver esse problema.
Em adição ao método de identificação de fase estro descrito aqui, outros instrumentos metodológicos podem ser empregues para obter medidas de concentrações circulantes de hormona do ovário no soro. Por exemplo, a concentração de estrogénio pode ser quantificado em amostras de sangue usando um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Neste procedimento, estrogénios no soro / plasma de amostras de se ligar a um anticorpo anti-estrogénio específico, o qual está ligado a uma enzima. O substrato da enzima produz uma reacção que resulta em um sinal visível, tal como uma mudança de cor que pode ser medida utilizando um espectrofotómetro. Esta ferramenta calcula absorção e fornece uma quantificação dos níveis de estrogênio na amostra. Este método pode ser útil na avaliação dos níveis de estradiol natural da alternância ao longo do ciclo estral, e mais importante ainda, a tempos específicos durante a experiência. Ele também pode ser utilizado para determinar como a administração exógena de estrogénio pode alterar normaal concentrações fisiológicas. A determinação das concentrações de estrogênio de sangue pode evitar dificuldades com a identificação das fases durante as fases de transição, ou quando manchas são difíceis de ler devido ao muco nas amostras. Infelizmente, este método pode se tornar bastante oneroso e ofertas adiada resultados comparados à coleta de esfregaço vaginal.
Os procedimentos para obter amostras de sangue suficiente, por exemplo., Através da veia da cauda, do seio orbital, pinas cauda, veia safena e 29, pode causar stress desnecessário para o animal. Isso pode afetar os níveis de hormônio em momentos críticos no experimento, levando a medições imprecisas ou distorcidas. Usando sangue tronco para medir os níveis de estradiol é terminal e, portanto, fornece informações muito limitadas sobre as flutuações hormonais dentro das fases. Avaliando citologia vaginal célula parece oferecer uma alternativa melhor. Embora este método só pode fornecer uma estimativa aproximada de perfis hormonais ovarianas cruzando as fases de estro, podeminimizar o estresse e é posteriormente menos disruptivas para o experimento comportamental.
Existem diferentes formas de esteróides estrogénicos que são naturalmente circulantes em seres humanos e animais não humanos, tais como o estriol, estradiol e estrona. Neste protocolo, o estradiol é administrado de forma aguda através de injeções subcutâneas. Estradiol (E2 sinónimo, 17beta-estradiol ou beta-estradiol) é usado neste protocolo, porque é a forma mais potente do que ocorre naturalmente estrogénio em fêmeas não grávidas 30. Em contraste com injeções agudas de estradiol, outros laboratórios têm utilizado métodos de administração de estrogênio crônica. Por exemplo, os implantes subcutâneos de peletes de libertação lenta ou cápsulas silásticas permitir a entrega contínua estável de estrogénio ou solução veículo 19. Este procedimento é normalmente usado em conjunto com ovariectomies, que eliminam o estado natural de reprodução do animal.
O manipuções discutidas aqui se concentrar em estados hormonais naturais para facilitar a aplicação clínica dos resultados laboratoriais. Indivíduos com transtorno de estresse pós-traumático (PTSD) são comumente prejudicada na sua capacidade para extinguir o medo de um estímulo relacionado com a sua experiência traumática e para lembrar esta extinção. Esta condição muitas vezes persiste por muito tempo após o evento já passou. A exposição prolongada a terapia é uma opção de tratamento comum para PTSD que se baseia em processos baseados na extinção estudadas em modelos de roedores, tais como o aqui descrito. Curiosamente, as mulheres são cerca de duas vezes mais propensas que os homens de desenvolver estresse e transtornos psiquiátricos relacionados à ansiedade 31. Esta diferença entre os sexos na prevalência pode estar ligada a diferenças de sexo nos processos de extinção do medo e subjaz o potencial significado clínico destes achados laboratoriais. Apesar da maior prevalência do TEPT nas mulheres, relativamente poucos estudos temem extinção em roedores foram realizados em mulheres. Estudos fêmeas focoção sobre o papel das hormonas sexuais não deve ser esquecida quando se examina as diferenças sexuais no comportamento. Caracterizar os efeitos comportamentais da naturalmente flutuante níveis hormonais ao longo do ciclo estral fornece insights valiosos sobre as diferenças fundamentais no comportamento entre machos e fêmeas. Este protocolo prevê um modelo básico para facilitar futuros estudos de hormônios ovarianos e sua influência sobre, mas não se limitando a, processos cognitivos e comportamentais, tais como a extinção do medo. Este protocolo incide sobre uma hormona gonadal específico, estrogénio, no entanto, os efeitos de outras hormonas, tais como progesterona e testosterona podem também ser avaliadas. Usando o paradigma comportamental aqui apresentada em conjunto com outras técnicas farmacológicas, celulares e moleculares (ie, infusões de drogas localizadas, imuno-histoquímica, western blot), a pesquisa futura pode identificar sites / metas específicas de acção do estrogénio no cérebro que pode aumentar a terapia comportamental.
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Disclosures
Os autores deste manuscrito não tem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse a divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
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