Protocol
생쥐를 사용하는 모든 실험은 각 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행되어야한다.
마우스 실험 1. 일반 댓글
- 무균 상태에서 마우스를 유지하고 그들에게 음식과 물을 임의로에 액세스 할 수 있습니다.
참고 : 면역 학적 패턴은 나이와 성별에 따라 달라질 수 있기 때문에 실험 그룹의 나이와 성별 일치 마우스를 사용하는 것이 중요합니다.
(2)의 제조 및 활성화 OVA 특이 CD8 + T 세포 (OT-I)
- 뇌 조각을 준비하기 전에 오일 후술 OT-I T 세포의 자극을 수행한다.
주 : 5 × 5 활성화 효과기 CD8 + OT-I T 세포 (CD8 + T 세포 MHC-I 분자의 컨텍스트에서 유일한 OVA 257-264 펩티드를 인식하는 트랜스 제닉 마우스)를 슬라이스마다 필요한 농도 5 × 10 5 실험을 선택했다세포가 동시에 슬라이스로 이주 시동 한번 좋은 세포 - 세포 상호 작용을 선호하는 최적 하나로 우방 세포의 양이 하나의 셀 (8, 18)를 계산하는 허용 과잉 반응을 유도하기 위해 너무 높지 않다. - OT-I T 세포를 배양 매체를 준비합니다. 5 % 소 태아 혈청 (FCS), 10 mM의 HEPES, 2 mM L- 글루타민 50 μM 2- 머 캅토 에탄올, 1 % 비 필수 아미노산 및 25 ㎍ / ml의 겐타 마이신을 500 ㎖의 DMEM을 보완. 사용할 때까지 4 ° C에서 매체를 저장합니다.
- 참조 (16)에 따라 OT-I 형질 전환 마우스의 비장을 제거합니다. 준비된 매체로 전송합니다.
- 5 분, 4 ° C 300 XG에 70 μm의 여과기 및 원심 분리기 서스펜션을 통해 비장를 매쉬업하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
- 적혈구를 용해시키기 위해 5 분 동안 5 ㎖ 암모늄, 염화 칼륨 (ACK) 완충액 (150 mM의 CL NH 4, 10 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA, pH를 7.3)와 세포 현탁액을 배양한다.
- incubati 중지다시 10 ml의 배지를 원심 분리기에 함께 전술 한 바와 같이.
- 매체에 세포 현탁액을 희석 수를 계산합니다. 판 3 × 10 7 세포의 밀도로 세포 / 웰에서 12 웰 플레이트 프라임 그들을 배양하여 OVA 257 - 264 (SIINFEKL 1 ㎚) 및 인터루킨 -2 (IL-2) (500 IU / ml)에 대한 오일.
- 사일 후, 500 IU의 농도 / ㎖를 다시 IL-2를 추가한다.
- 자극에이어서, 제조업 자의 지시에 따라 음성 선별 계 마우스 CD8 + T 세포 단리 키트를 사용하여 세포 현탁액으로부터 OT-I-T 세포를 정제. 정제는 CD4, CD11b를, 중 CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC 클래스 II, 테르-119 및 TCRγ에 대한 항체의 칵테일을 사용하여 모든 비 CD8가 + 세포의 고갈을 기반으로 / δ 후 정제 된 CD8 + T 세포의 용출 자석 열을 사용하여 폐기되는.
참고 :이 procedu에서 중요한 단계재를 제조하고 의해 표시된다 : 그것은 덩어리의 존재가 용출 단계 동안 열을 차단할 수 있기 때문에, 반응은 단 하나의 셀을 포함하는 것이 중요하다; Byotin 칵테일을 추가하기 전에 셀의 계산은 시료의 청정도에 중요하고 절차는 비특이적 항체 바인딩을 최소화하기 위해 얼음을 수행하여야한다.
OT-I T 세포 급성 뇌 조각 및 공동 문화의 3. 준비
- 급성 뇌의 제조에 앞서 19, 200 mM의 수크로오스로부터 20㎜ PIPES, 2.5mM의 KCL, 1.25 mM의의 NaH 2 PO 4, 10mM의 황산, 0.5 CaCl2를 10 mM의 덱 스트로스를 사용 placedine 차가운 생리 식염수 용액을 조제을 슬라이스 화 인공 뇌척수액 (ACSF), 125 mM의 염화나트륨, 2.5의 KCl을 사용하여 1.25의 NaH 2 PO 4, 24 mM의 NaHCO3을, 2 mM의 황산, 10 mM의 포도당 2 mM의 CaCl2를. 저기서으로 7.35에 각 솔루션의 산도를 조정g의 NaOH. ACSF의 pH를 조정하기 전에, 용액은 95 % O 2 및 5 % CO 2의 혼합물로 버블 링되어야한다.
- 솔루션을 사전 냉각.
- 8 마취 - (10 주 된 쥐를 예를 들면, C57BL 5.0 %의 이소 플루 란, 5.0 %의 할로 탄 또는 대기 IP를 통해 100 ㎎ / kg 케타민과 10 mg / kg 체중의 자일 라진 (xylazine)을 주사를 사용하여 제어 또는 흡입과 형질 전환 ODC-OVA 마우스 (17) / 6 마취. 마취의 수준을 평가하고, 한 번에 목을 벨 수있는 발가락 핀치를 사용하고 제도적 동물 보호에 따라 쥐를 안락사와 안락사에 대한위원회의 기준을 사용합니다.
- 복부 위치에 마우스를 넣습니다. 소독 및 sagittally 두피를 잘라. , sagitally 두개골 뼈를 열고 국자의 도움으로 신속하게 뇌를 제거하고 접착제를 사용하여에 vibratome의 판에 끼 웁니다.
- 준비된 placedine 얼음처럼 차가운 생리 식염수와 함께 접시를 채 웁니다.
- 에 vibratome 300 μm의 관상 조각을 잘라.
참고 :이 절차는 알고있다n은 적어도 8 시간의 19 ~ 21 시간 내에 세포의 기능적 연구에 적합한 실행 가능한 그대로 티슈 시편을 얻었다. 사실, 이미 6 시간 후에 시작이 기간 후에, 준비는 품질 저하, 활동 전위 생성 및 전파 같은 기본적인 기능적인 특성, 즉 변화를 보여준다. - 절편 한 후, ACSF 가득 12 웰 플레이트의 각 웰에 즉시 한 조각을 전송합니다.
- 조각 당 신중 5 × 10 5 OT-I T 세포를 추가합니다.
- 인큐베이터에서 최대 8 시간 (37 ° C, 5 % CO 2)에 대한 슬라이스를 품어.
- 잠복기, 수확 조각과 후의 OCT 화합물 조직-TEK를 사용하여 그것들을 포함하고 액체 질소에서 그들을 동결. 평가, 예를 들면에 더 조직 학적 연구를위한 -20 ° C에서 신경 세포의 구조 (예를 들어, 사용 방지 MAPII 또는 방지 synaptophysin에 항체) 또는 세포 사멸을 (를 저장 예를 들어, 안티 카스파-3 항체 및 안티 NeuN 안티를 사용하여시체) 표준 절차에 따라.
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Representative Results
희소 돌기 아교 세포 지시 CD8 + T 세포와 뇌 조각의 배양 후, 희소 돌기 아교 세포뿐만 아니라 신경 세포 사멸 (도 2a 및도 1C, 각각을) 받다. 아폽토시스 학적 징후 (예, 카스파 제 -3, Tunel에)은 초기 배양은 3 시간 후에 검출 될 수있다. 부화 기간은 준비하고 재현 가능한 결과의 좋은 품질을 보장하기 위해 더 이상 8 시간 이하 여야한다. 사멸 세포는 모든 유수 지역에서 우세와 조각을 통해 찾을 수 있습니다. 구조적 무결성 및 세포 사멸 신경 세포의 조각의 대표적인 조직 학적 염색은 그림 1A-C에 도시되어있다.
결과 파라미터를 평가하기위한 관심의 인큐베이션 동안 상이한 시간 점들이있다. 본 연구실에서 수행되는 전형적인 시간 경과 후에는, 즉, 세포 - 세포 상호 작용이 시간 0에서, 다음 3, 4, 6 시간 (최대 상호 작용이 관찰) 분석 파라미터들을 포함상호 작용을 시작했다. 종종 매우 간략하게 설명되어 적용 할 수있는 조직 학적 분석을 넘어 몇 가지 전형적인 분석 :
T 세포의 회수 및 분석
8 시간까지의 잠복기 후에, T 세포는 슬라이스로부터 회수 될 수 있고, 이러한 사이토 카인 생성 또는 세포 증식과 같은 효과기 분자에 대해 파라미터들을 분석하기 위해 평가 될 수있다. T 세포를 검색하기 위해, 슬라이스 기계적 해리하고 모든 실험 조건 함께 풀링. 세포를 2,500 rpm에서의 계면에서 30 분간 30 % 내지 50 % 퍼콜 (아머 샴, 부르크, 독일) 후의 밀도 구배 원심 분리 하였다. 이러한 방식으로, 예를 CD8 들어 세정 우리는이 프로토콜에서, 해결하고자 연구에 따라서 변경 항체의 상이한 수와 유형을 이용한 기술 (FACS) 유세포 분석기를 이용하여 즉시 염색 단핵 세포를 얻을 수있다 + 18.
도 1d에 도시 된 바와 같이 신경 건강 및 기능에 대한 정보는, 예컨대 활동 전위 (APS) 세대 뉴런의 기본 특성을 평가하기 위하여, 전기 생리 학적 기록 등을 수행함으로써 평가 될 수있다.
그림 1. 조각의 형태 학적 구조뿐만 아니라 대표적인 결과. 배양 후에 조각 8 시간의 (A) 형태 학적 구조. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. MAPII (녹색)과 synaptophysin에 (빨간색) 염색에 대한 공동 염색 계시 (B) 뉴런은 시냅스 상호 연결되어있다. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. (C) 해마의 세포 사멸 세포 (카스파 제 -3, 빨간색)과 신경 (NeuN, 녹색)의 대표 사진따고 6 시간 배양. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. (D) 쥐의 대뇌 피질의 신경 세포의 탈분극 현재의 단계에 따라 신경 세포의 활동 전위 발생의 단일 셀 패치 클램프 녹음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2는 다중 프로토콜의 염색의 특이성을 평가하기 위해 수행 하였다. (A) 노고 (빨간색)의 공동 염색, 성숙한 희소 돌기 아교 세포 (ODCs)과 Caspase3 (세포 사멸, 녹색) 마커는 ODCs가 CD8 + T 세포에 의해 공격을 보여줍니다. Caspase3 (빨간색) GFAP, 신경 교세포 (녹색) 마커와 공동으로 물들 일 때 (B) 상호 작용의 결과는 부정적이다. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. (C) Specifici프로토콜의 TY가 왼쪽부터 Caspase3 (적색)와 신경 세포의 공동 - 염색 (블루 DAPI)에 의해 지원된다 : WT 동물, WT 동물 OTI-I T 세포에 노출 ODC-난자 및 ODC-난자 OTI-I T 세포에 노출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
다양한 동물 모델은 MS와 같은 염증성 탈수 초성 질환의 병리학 적 특징을 해결하기 위해 지난 수십 년에 걸쳐 설명되었다. 비보 마우스 및 래트 모델은 광범위 질환의 병태 생리 학적 특징을 모방하는 데 사용된다, 즉, 탈수 초화 및 재유 수화 처리의 결과 분석 염증 및 신경 퇴행의 섞일 에피소드. 그럼에도 불구하고, 단지 생체 방법은 정확한 기본 메커니즘을 해부 할 수 있습니다.
급성 뇌 조각의 제조는 널리 배포 모델이고 신뢰성있는 반복 가능한 것으로 간주 될 수있다. 셀 상호 - 분리 및 희소 돌기 아교 세포 - 특이 적 면역 세포의 배양과 조합에서, 특히기구와 면역 세포와 공격 세포의 동력학 연구의 관점에서, 특정 실험 문제를 해결하는데 사용될 수있다. 기타 생체 외 접근법은 널리 공지되어있다22 사용하지만 즉 OT-I T 세포에 노출 노출 여부 WT의 Caspase3 면역 반응을 확인, 다른 "배제"공동의 염색을 수행하여 도전 할 수있는 대상의 특이성에 우리의 프로토콜의 참신 (그림 2C 참조) .
준비하는 동안 몇 가지 중요한 점은 실험 방법 론적으로 올바른 수행되도록 고려, 즉 실험 설정에주의해야한다; 내부 유효성 단리 사용 면역 세포 자극 분석 (FACS) 유동 세포 계측법, 예를 통하여 정기적으로 제어되어야한다. 또한, 뇌 조각의 확인 활력이 좋습니다. 실험 그룹은 나이와 성별 일치해야합니다. 실험은 항상 동물 복지 규정에 따라 수행되어야한다.
프로토콜의 일부 제한 사항을 명심해야합니다. 가장 중요한 것은, 제시된 모델은생체 외 접근법은 완전히 면역 중추 신경계 장애의 복잡한 면역 상황을 모방하기 위해 적합하지 않다. 또한 모델 만 CD8 + T 세포 면역 반응을 사용하는 구동 고려되어야한다. CD4 + T 세포와 B 세포는 덜 두드러진 역할을한다. 이러한 유형의 세포를 어드레싱 할 때 다른 희소 돌기 아교 세포 - 특이 적 면역 세포 아형 대체 프로토콜을 사용하여 고려되어야한다. 조직 학적 발견은 예상 oligodendroglial (도 2a 참조) 및 신경 세포 사멸 (도 1C 참조). 이와 달리, 다른 종류의 세포 자멸사는 예 astroglial 신경 또는 항원 특이 적 면역 세포 및 형질 전환 시스템을 사용하여 달성 될 수있다. 이 특정 프로토콜에서 astroglial 세포에서 Caspase3의 면역 반응으로 인해 시스템 (그림 2B)의 특이성에 부정적이었다.
기재된 프로토콜은 기본 신경으로 간주 될 수면역 학적 실험 방법과는 다른 응용 프로그램에 대한 수정 될 수있다. 특정 CD4 + T 세포 및 - 실험 절차는 쉽게 다른 항원 - 특이 적 면역 세포 서브 타입 (예를 들면, 수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG)를 사용과 조합하여 다양한 뇌 조각 (예를 들어, 상이한 트랜스 제닉 마우스 균주)가 다른 프로토콜들에 적용될 수있다 뇌 oligodendroglial 신경 세포 사멸에 미치는 영향을 해결하기 위해 C57BL / 6 마우스로부터 제조 슬라이스). 면역 세포의 생체 외 활성화는 특정 면역 질문 (T의 H 1 또는 T H 17 세포)에 예를 들면, 편파를 위해 변화 될 수있다.
때때로, 뇌 조각의 강화 또는 감소 된 세포 사멸은 실험적인 도전이 될 수 있습니다. 문제 해결을위한 몇 가지 권장 사항은 다음과 같습니다 :
처음에는 뇌 조각의 품질은 우리의 pH 값, 삼투압 및 산화 상태뿐만 아니라 준비 시간의 크게 의존에드 솔루션입니다. 이 조건이 독립적 인 실험과 비교할 수 있는지를 확인해야한다. 또한, 면역 세포의 활성화는 정기적으로 제어되어야한다. 최적의 항원 농도가 다를 수 있습니다. 실험을 형성 할 때 사용되는 항원의 적정을 고려하십시오.
상술 한 바와 같이, 한 프로토콜은 중추 신경계의 무결성 상기 면역 세포 서브 타입 (예를 들어, CD4 + T 세포, B 세포)의 효과를 분석하기위한 시작점으로서 사용될 수있다. 이러한 접근은 조직 학적 분석이 철저하게 평가 될 수 oligodendroglial와 신경 세포에 미치는 영향을 분리 특히 적합하다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
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