Protocol
Alle Versuche mit Mäusen sollte in Übereinstimmung mit den Richtlinien der jeweiligen institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss durchgeführt werden.
1. Allgemeine Kommentare zu Maus Experimente
- Halten Sie die Maus unter pathogenfreien Bedingungen und ihnen Zugang zu Futter und Wasser ad libitum.
HINWEIS: Es ist wichtig, Alter und Geschlecht abgestimmte Mäuse in Versuchsgruppen zu verwenden, da immunologische Muster können mit Alter und Geschlecht variieren.
2. Herstellung und Aktivierung von OVA-spezifischen CD8 + T-Zellen (OT-I)
- Führen Stimulation der OT-I T-Zellen, wie unter 5 Tage vor der Vorbereitung Hirnschnitten beschrieben.
HINWEIS: 5 × 10 5 aktiviert Effektor CD8 + OT-I T-Zellen (CD8 + T-Zellen von transgenen Mäusen, die Anerkennung nur die OVA 257-264-Peptid im Kontext der MHC-I-Moleküle) pro Schicht benötigt Die Konzentration 5 x 10 5 wurde Experiment gewählteVerbündeter als optimal ein, um eine gute Zell-Zell-Interaktion einmal bevorzugen, dass die Zellen beginnen, in die Scheibe der Migration und, zur gleichen Zeit, ist die Menge der Zellen nicht zu hoch ist, um eine Überreaktion ermöglicht Einzelzellzählung 8,18 induzieren. - Bereiten Sie das Medium zur Kultivierung OT-I T-Zellen. Supplement 500 ml DMEM mit 5% fötalem Kälberserum (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 1% nicht-essentielle Aminosäuren und 25 & mgr; g / ml Gentamicin. Lagern Sie das Medium bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Entfernen Sie die Milz von OT-I transgenen Mäusen nach Referenz 16. Übertragen Sie sie in die vorbereitete Medium.
- Generieren Einzelzellsuspension durch Maischen Milzen durch ein 70 um-Sieb und Zentrifugen Suspension bei 300 xg für 5 min, 4 ° C.
- Inkubieren Zellsuspension mit 5 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) für 5 min, um rote Blutkörperchen zu lysieren.
- Stoppen incubatiauf 10 ml Medium und zentrifugiert erneut wie oben beschrieben.
- Verdünnte Zellsuspension in mittleren und berechnen Zahlen. Platten Zellen in einer Dichte von 3 x 10 7 Zellen / Vertiefung in eine Platte mit 12 Vertiefungen und prime sie durch Inkubation mit OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) und Interleukin 2 (IL-2) (500 IU / ml) 5 Tage.
- Nach 4 Tagen hinzuzufügen IL-2 in einer Konzentration von 500 IU / ml wieder.
- Nach Stimulation reinigen OT-I-T-Zellen aus der Zellsuspension durch die Verwendung eines negativen Selektion basierend Maus CD8 + T-Zellisolations-Kit den Anleitungen des Herstellers. Die Reinigung wird auf die Verringerung von allen nicht-CD8 + -Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern gegen CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Klasse II, Ter-119 und TCRγ basierend / δ welche dann durch Verwendung von Magnetspalten zur Elution der gereinigten CD8 + T-Zellen verworfen werden.
HINWEIS: Kritische Schritte in diesem procedure werden von den Herstellern angegeben: Es ist wichtig, daß die Reaktion beinhaltet nur einzelne Zellen, weil die Anwesenheit von Klumpen könnten die Spalte während des Elutionsschritts zu blockieren; Zählen der Zellen vor der Zugabe des Byotin Cocktail ist wichtig für den Grad der Reinheit der Probe, und die Prozedur sollte auf Eis durchgeführt, um unspezifische Antikörperbindungen minimieren.
3. Vorbereitung der akuten Hirnschnitten und Co-Kultur mit OT-I T-Zellen
- Vor der Herstellung des akuten Hirnschnitten 19, bereiten placedine eiskalter physiologischer Kochsalzlösung mit 200 mM Saccharose, 20 mM PIPES, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 10 mM MgSO 4, 0,5 CaCl 2 und 10 mM Dextrose und künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) durch Verwendung von 125 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 mM NaHCO 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10 mM Dextrose. Der pH-Wert jeder Lösung auf 7,35 durch using NaOH. Vor Einstellung des pH der ACSF müssen Lösung mit einer Mischung aus 95% O 2 und 5% CO 2 gesprudelt werden.
- Vorkühlung des Lösungen.
- Anesthetize 8 - 10 Wochen alten Mäusen (zB C57Bl / 6 als Kontrolle oder transgenen ODC-OVA Mäusen 17 mit der Inhalation mit 5,0% Isofluran, 5,0% Halothan oder injizieren 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin über ip Wait für Anästhesie und verwenden eine Zehe Prise, um das Niveau der Anästhesie zu bewerten und zu enthaupten sie sofort. Euthanize die Mäuse nach institutionellen Tierpflege und verwenden Ausschuss Kriterien für Euthanasie.
- Setzen Maus in Bauchlage. Desinfizieren und schneiden Kopfhaut sagittal. Öffnen Sie die Schädelknochen sagittal, entfernen Sie das Gehirn schnell mit Hilfe einer Schaufel und befestigen Sie es auf der Platte eines Vibratom mit Hilfe von Leim.
- Füllen Sie den Teller mit der vorbereiteten placedine eiskalter physiologischer Kochsalzlösung.
- Cut 300 um koronalen Scheiben mit dem Vibratom.
Hinweis: Diese Vorgehensweise ist weißn, um lebensfähige intakte Gewebeproben für die funktionelle zelluläre Studien innerhalb eines Zeitintervalls von mindestens 8 h 19 bis 21 entsprechende ergeben. In der Tat, nach dieser Zeit, schon nach 6 Stunden ab der Zubereitung hat ergeben, verminderter Qualität, nämlich Veränderungen in einfachen und funktionalen Eigenschaften wie Aktionspotential Erzeugung und Ausbreitung. - Nach dem Schneiden, übertragen eine Scheibe sofort in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit ACSF gefüllt.
- Fügen Sie sorgfältig 5 × 10 5 OT-I T-Zellen pro Scheibe.
- Scheiben Inkubieren für bis zu 8 h in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2).
- Nach der Inkubationszeit, Ernte Scheiben schneiden und mit Hilfe OCT-Verbindung Tissue-Tek betten sie und frieren sie in flüssigem Stickstoff. Im Kühlschrank bei -20 ° C für die weitere histologische Untersuchungen zu Beispiel auszuwerten neuronale Struktur (zB unter Verwendung von Anti-MAPII oder Anti-Synaptophysin-Antikörper) oder Apoptose (zB mit Anti-Caspase-3-Antikörpern und Anti-Anti NeuNStellen) nach Standardverfahren.
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Representative Results
Nach einer Inkubation von Gehirnschnitten mit Oligodendrozyten gerichtete CD8 + T-Zellen, Oligodendrozyten und Neuronen Apoptose (2A bzw. 1C). Histologische Anzeichen von Apoptose (zB Caspase-3, Tunel) kann frühestens nach 3 h Inkubation nachgewiesen werden. Inkubationszeit sollte, um eine gute Qualität der Vorbereitung und reproduzierbare Ergebnisse garantieren nicht länger als 8 Stunden sein. Apoptotischen Zellen kann auf der ganzen Scheibe mit Übergewicht in markhaltigen Bereichen. Ausführungs histologischen Färbung der Scheibe für die strukturelle Integrität und apoptotischen Neuronen ist in 1A-C dargestellt.
Es gibt verschiedenen Zeitpunkten während der Inkubation, die von Interesse für die Beurteilung der Outcome-Parameter sind. Ein typischer zeitlicher Verlauf in unserem Labor durchgeführt enthält Parameter analysiert, nämlich, Zell-Zell-Wechselwirkungen bei der Zeit 0 und dann 3, 4 und 6 h (die maximale Interaktion beobachtet wird), nachdemInteraktion gestartet. Typische Tests über histologische Analysen, die oft angewendet werden können sind sehr kurz beschrieben:
T-Zell-Gewinnung und Analyse
Nach einer Inkubationszeit von bis zu 8 h, können T-Zellen von den Scheiben zurückgewonnen werden und kann ausgewertet werden, um Parameter in Bezug auf die intrazelluläre Effektormoleküle wie Cytokin-Produktion oder der Proliferation zu analysieren. Um T-Zellen abzurufen, wurden Scheiben mechanisch dissoziiert und gemeinsam für jeden experimentellen Zustand vereinigt. Die Zellen wurden von der Grenzfläche 30% bis 50% Percoll (Amersham, Freiburg, Deutschland) nach dem Dichte-Gradienten-Zentrifugation für 30 min bei 2500 rpm getrennt. Auf diese Weise ist es möglich, mononukleare Zellen, die gewaschen und sofort mittels Durchflusscytometrie Techniken (FACS) unter Verwendung einer anderen Anzahl und Art von Antikörpern, die je an der Studie wir ansprechen, in diesem Protokoll soll je färbt wurden erhalten, beispielsweise CD8 + 18.
Informationen über neuronale Gesundheit und die Funktionalität kann durch Durchführen elektrophysiologischer Aufzeichnungs zB zu prüfen, die Grundeigenschaften der Neuronen wie Aktionspotentiale (APs) Generation zu bewerten, wie in 1D gezeigt.
Abbildung 1. Morphologische Struktur der Scheibe sowie repräsentative Ergebnisse. (A) Morphologische Struktur einer Scheibe 8 h nach der Inkubation. Maßstabsbalken zeigt 10 um. (B) Die Neuronen sind synaptisch miteinander verbunden, wie durch Co-Färbung für MAPII (grün) und Synaptophysin (rot) Färbung ergab. Maßstabsbalken entspricht 10 um. (C) repräsentatives Bild von apoptotischen Zellen (Caspase-3, rot) und Neuronen (NeuN, grün) im Hippocampus einN ach 6 Stunden Inkubation. Maßstabsbalken entspricht 10 um. (D) Single Cell-Patch-Clamp Messungen neuronaler Aktionspotential Generation nach depolarisierenden Stromstufen in einem murinen kortikalen Neuronen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Multiple Färbungen durchgeführt, um die Spezifität des Protokolls zu beurteilen. (A) Co-Färbung von NogoA (rot), ein Marker für reife Oligodendrozyten (ODC) und Caspase3 (Apoptose, grün) zeigt, dass ODCs werden von CD8 + T-Zellen angegriffen. (B) Interaktion Ergebnis negativ ist, wenn Caspase3 (rot) ist mit GFAP, ein Marker für Gliazellen (grün) co-gefärbt. Maßstabsbalken repräsentieren 10 um. (C) Specificity des Protokolls wird durch die Co-Färbung von neuronalen Zellen (DAPI, blau) mit Caspase3 (rot) unterstützt wird, von links beginnend: WT Tieren, WT Tieren OTI-I T-Zellen ausgesetzt sind, ODC-Ova und ODC-Ova zu OTI-I T-Zellen ausgesetzt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Verschiedene Tiermodelle haben in den letzten Jahrzehnten, die pathologischen Merkmale der entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen wie MS-Adresse beschrieben. In-vivo-Maus- und Rattenmodelle sind weit verbreitet, um pathophysiologische Merkmale der Krankheit nachahmen, nämlich Analyse der Folgen der Demyelinisierung und Remyelinisierung Prozesse und der vermischten Episoden von Entzündungen und Neurodegeneration. Trotzdem nur eine ex vivo Ansatz erlaubt es, die genauen zugrunde liegenden Mechanismen zu sezieren.
Vorbereitung der akuten Hirnschnitten ist auch ein weit verbreitetes Modell und kann als zuverlässige und reproduzierbare berücksichtigt werden. In Verbindung mit der Isolierung und Inkubation von Oligodendrozyten-spezifischen Immunzellen, kann es verwendet werden, um spezielle experimentelle Fragestellungen adressieren, insbesondere hinsichtlich der Untersuchung Mechanismus und die Kinetik einer Immunzelle Angriff und Zell - Zell-Interaktionen. Andere ex vivo Ansätze sind bekannt und weit verbreitet22 verwendet, aber die Neuheit unserer Protokoll in der Spezifität des Ziels, indem verschiedene "Ausgrenzung" Co-Färbungen, nämlich die Überprüfung der Caspase3 Immunreaktivität in WT ausgesetzt oder nicht, OT-I T-Zellen ausgesetzt angefochten werden können (siehe Abbildung 2C) .
Einige kritische Punkte bei der Vorbereitung ist zu berücksichtigen, nämlich die experimentellen Einstellungen getroffen werden, um sicherzustellen, dass Experimente werden methodisch korrekt durchgeführt werden; für interne Validität, Isolation und Stimulation der verwendeten Immunzellen sollten in regelmäßigen Abständen über zB gesteuert werden, Durchflusszytometrie Analysen (FACS). Darüber hinaus ist die Überprüfung Vitalität der Gehirnscheiben sehr zu empfehlen. Versuchsgruppen sollten alters- und geschlechts abgestimmt sein. Experimente sollten immer in Übereinstimmung mit den Tierschutzbestimmungen durchgeführt werden.
Einige Einschränkungen des Protokolls müssen im Auge behalten werden. Am wichtigsten ist, ist das vorgestellte ModellEx-vivo-Ansatz und ist nicht geeignet, um vollständig imitieren die komplexen immunologischen Situation Erkrankungen Autoimmun zentralen Nervensystems. Es sollte auch in Betracht gezogen, dass das Modell verwendet nur CD8 + T-Zell-Immunantwort angetrieben werden. CD4 + T-Zellen und B-Zellen spielen eine untergeordnete Rolle. Alternative Protokolle mit anderen Oligodendrozyten-spezifische Immunzelltypen sollten bei der Bewältigung dieser Zelltypen werden. Die erwartete histologische Befund ist oligodendroglialen (siehe Abbildung 2A) und neuronale Apoptose (siehe Abbildung 1C). Alternativ kann die Apoptose von anderen Zelltypen unter Verwendung zB Astroglia oder neuronale Antigen-spezifische Immunzellen und transgenen Systemen erreicht werden. In diesem bestimmten Protokoll war die Immunreaktivität Caspase3 in Astroglia-Zellen negativ aufgrund der Spezifität des Systems (2B).
Das beschriebene Protokoll kann als Grund neuro berücksichtigenimmunologische experimentellen Ansatz und kann für andere Anwendungen angepasst werden. Spezifische CD4 + T-Zellen und - das experimentelle Verfahren kann leicht auf andere Protokolle, die von unterschiedlichen Gehirnscheiben (zB verschiedene transgene Mauslinien) in Kombination mit anderen Antigen-spezifische Immunzelltypen (zB verwenden Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) aufgebracht werden Hirnschnitte aus C57BL / 6-Mäusen hergestellt, um ihre Wirkung auf oligodendroglialen und neuronale Apoptose-Adresse). In vitro-Aktivierung von Immunzellen können für spezifische immunologische Fragestellungen (zB Polarisation in T H 1- oder T H 17-Zellen) variiert werden.
Manchmal kann besser oder schlechter Apoptose in Hirnschnitten eine experimentelle Herausforderung sein. Einige Empfehlungen zur Fehlersuche sind:
Zunächst ist die Qualität von Hirnschnitten in hohem Maße abhängig von Vorbereitungszeit, sowie pH-Wert, Osmolarität und dem Oxidationszustand von unsed-Lösung. Es sollte sichergestellt werden, dass die Bedingungen vergleichbar zwischen den unabhängigen Experimenten sind. Weiterhin sollte die Aktivierung von Immunzellen regelmäßig kontrolliert werden. Optimale Antigenkonzentration kann variieren. Stellen Sie sich eine Titration des verwendeten Antigens bei der Festlegung der Experimente.
Wie oben beschrieben, kann die genannte Protokoll als Ausgangspunkt für die Analyse der Wirkung von weiteren Immunzelltypen (beispielsweise CD4 + T-Zellen, B-Zellen) auf dem zentralen Integrität des Nervensystems verwendet werden. Diese Ansätze sind besonders geeignet für die Trennung ihrer Wirkung auf oligodendroglialen und neuronalen Zellen als histologische Analyse kann genau geprüft werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
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