Protocol
Fareler kullanan tüm deneyler ilgili kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi kurallarına uygun olarak yapılmalıdır.
Fare Deneyler için 1. Genel Yorumlar
- Patojen içermeyen koşullar altında fareler tutun ve onlara yiyecek ve su ad libitum erişim sağlar.
NOT: immünolojik desenler yaş ve cinsiyet ile değişebilir çünkü deney gruplarında yaş ve cinsiyet uyumlu fareler kullanmak önemlidir.
2. hazırlanması ve Aktivasyon OVA-spesıfik CD8 + T hücreleri (OT-I)
- Beyin dilimleri hazırlama 5 gün, aşağıda tarif edildiği gibi OT-I T hücrelerinin uyarılmasını yapın.
Not: 5 x 10 5 aktive efektör CD8 + OT-I T hücreleri, (CD8 + T hücreleri, MHC-I-molekülleri bağlamında sadece OVA257-264 peptidi tanıyan transgenik farelerin) dilim başına gerekli olan konsantrasyonu 5 x 10 5, deney seçildihücreler aynı zamanda, dilim içine göç ve başlar bir kez iyi bir hücre-hücre etkileşimi lehine optimum olarak müttefik, hücrelerin miktarı tek hücre 8,18 sayma sağlayan bir aşırı reaksiyonunu uyarmak için çok yüksek değil. - OT-I T hücrelerinin kültürlenmesi için ortam hazırlar. % 5 fetal dana serumu (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 50 uM 2-merkaptoetanol,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve 25 ug / ml gentamisin 500 mi DMEM Supplement. Kullanılana kadar 4 ° C 'de orta saklayın.
- Referans 16'daki gibi OT-I transgenik farelerin dalak çıkarın. Hazırlanan ortama aktarabilirsiniz.
- 5 dakika, 4 ° C 300 xg'de 70 mikron süzgeç ve santrifüj süspansiyon yoluyla dalak ezme yoluyla tek bir hücre süspansiyonu oluşturun.
- Kırmızı kan hücreleri lize etmek için 5 dakika boyunca 5 mi amonyum klorür-potasyum (ACK), tampon (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, 0.1 mM EDTA, pH 7.3) ile bir hücre süspansiyonu inkübe edin.
- Kuluçkalamadan DurTekrar 10 ml ortam santrifüj o ile ilgili yukarıda tarif edildiği gibi.
- Orta hücre süspansiyonu seyreltin ve sayıları hesaplamak. Plaka 3 x 10 7 hücre yoğunluğunda hücre / kuyuda 12-kuyu plaka ve birinci bunları inkübasyon tarafından OVA 257 - 264 (SIINFEKL; 1 nM) ve IL-2 (IL-2), (500 lU / ml) 5 gün.
- 4 gün sonra, 500 IU / ml yoğunlukta yeniden IL-2 ilave edin.
- Uyarımı takiben, imalatçının talimatları izlenerek bir negatif seçim göre fare CD8 + T hücresi izolasyon kiti kullanılarak hücre süspansiyonundan OT-I T hücrelerinin saflaştırılması. Arıtma CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Sınıf II Ter-119 ve TCRγ karşı bir antikor kokteyli olmayan tüm CD8 + hücrelerinin azalmasına dayanmaktadır / δ daha sonra saflaştırılmış CD8 + T hücrelerinin, yıkama için manyetik sütun kullanarak atılır olan.
NOT: Bu procedu Kritik adımlaryeniden üretici tarafından gösterilir: bu topakların bulunması yıkama aşaması esnasında sütun bloke çünkü reaksiyon sadece tek hücreler içeren çok önemlidir; Byotin kokteyl ilave edilmeden önce hücre sayımı örnek saflık derecesi için önemlidir ve işlem spesifik antikor bağlantıları en aza indirmek için, buz üzerinde yapılmalıdır.
OT-I T-hücreleri ile Akut Beyin Dilimleri ve Co-kültür 3. Hazırlık
- Akut beyin hazırlanmasından önce 19, 200 mM sakaroz, 20 mM PIPES, 2.5 mM KCI, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 10 mM MgSO 4, 0.5 CaCl2 ve 10 mM dekstroz ile placedine buz soğukluğunda fizyolojik yemek tuzu çözeltisi hazırlamak dilimler ve yapay serebrospinal akışkan (ACSF) 125 mM NaCI, 2.5 KCl, ile 1.25 NaH 2 PO 4, 24 mM NaHCO 3, 2 mM MgSO 4, 10 mM dekstroz, 2 mM CaCl2,. Usin ile 7,35 her çözeltinin pH ayarlamag NaOH. ACSF pH değerinin ayarlanması önce çözelti,% 95 O2 ve% 5 CO2 karışımı ile kabarcıklar halinde olmalıdır.
- Çözüm Öncesi serin.
- 8 uyutmak - (10 haftalık fareler gibi, C57Bl% 5.0 izofluran,% 5.0 halotan veya bekleyin ip üzerinden 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg vücut ağırlığı ksilazini enjekte kullanarak kontrol veya inhalasyon ile transgenik ODC-OVA fareler 17 gibi / 6 anestezi. anestezi düzeyini değerlendirmek ve bir kerede onları başını kesmek için bir ayak tutam kullanmak ve kurumsal hayvan bakımı göre fareler Euthanize ve ötenazi için komite kriterlerini kullanabilirsiniz.
- Ventral pozisyonda fare koyun. Dezenfekte ve sagittal saç derisini kesti. , Sagitally kranial kemik açın, bir kepçe yardımı ile hızlı bir şekilde beyin kaldırmak ve tutkal kullanarak bir vibratome plaka üzerine sabitleyin.
- Hazırlanan placedine buz soğukluğunda fizyolojik yemek tuzu çözeltisi ile plaka doldurun.
- Vibratome ile 300 mikron koronal dilim kesin.
NOT: Bu prosedür biliyorumn, en az 8 saat, 19-21 arasında bir zaman aralığı içinde işlevsel hücresel çalışmalar için uygun olan canlı sağlam doku örneklerinin elde edilir. Nitekim, zaten 6 saat sonra başlayan bu süre, sonra, hazırlık azaltılmış kalite, aksiyon potansiyeli üretimi ve yayılması gibi temel ve fonksiyonel özelliklerinde yani değişiklikleri gösterir. - Kesit sonra ACSF ile dolu bir 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, hemen bir dilim aktarın.
- Dilim başına dikkatli bir şekilde 5 x 10 5 OT-I T hücrelerinin ekleyin.
- Bir kuluçka makinesi içinde en fazla 8 saat (37 ° C,% 5 CO2) için dilim inkübe edin.
- Kuluçka dönemi, hasat dilimleri ve sonra Ekim bileşik Doku Tek kullanarak onları gömmek ve sıvı azot onları dondurmak. Değerlendirilmesi, örneğin, daha fazla histolojik çalışmalar için -20 ° C 'de nöronal yapı (örneğin, kullanılarak anti-MAPII ya da anti-sinaptofisin antikorlar) ya da apoptozu (saklayın örneğin, bir anti-Kaspaz-3 antikorları, anti-neun anti kullanarakorganları), standart prosedürlere göre yöntem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oligodendrosit yönelik CD8 + T hücreleri ile beyin dilimlerindeki inkübasyondan sonra, oligodendrositler olarak nöronlar apoptoz (Şekil 2A ve 1C, sırasıyla) tabi tutulur. Apoptoz histolojik bulgular (örneğin, Kaspaz-3, Tünel) ilk inkübasyon 3 saat sonra tespit edilebilir. Kuluçka dönemi hazırlanması ve tekrarlanabilir sonuçlar iyi kalitesini garanti etmek için uzun 8 saat daha olmamalıdır. Apoptotik hücreler tüm miyelinli alanlarda üstünlüğü ile dilim üzerinde bulunabilir. Yapısal bütünlük ve apoptotik nöronların dilim örnekleri histolojik boyama Şekil 1A-C'de gösterilmiştir.
Sonuç parametreleri değerlendirmek için ilgi inkübasyon sırasında farklı zaman noktaları vardır. Laboratuarımızda yapılan tipik bir zaman süreci sonra, yani, hücre-hücre etkileşimleri zaman 0, daha sonra 3, 4, ve 6 saat sonra (en fazla etkileşim gözlenen), analiz parametrelerini içeriretkileşim başladı. Genellikle çok kısaca anlatılmıştır uygulanabilir histolojik analizler ötesinde bazı tipik tahliller:
T-hücresi geri kazanımı ve analiz
8 saat kadar bir kuluçka döneminden sonra, T-hücrelerinin dilimler elde edilebilir ve sitokin üretiminin veya yayılması gibi hücre içi efektör molekülleri göre parametreleri analiz etmek için değerlendirilebilir. T hücresi elde etmek üzere, dilimleri mekanik ayrıştırılmış ve her deneysel koşul için bir araya toplanmış. Hücreler, 2500 rpm'de arayüzünden 30 dakika boyunca% 30 ila% 50 Percoll (Amersham, Freiburg, Almanya) sonra yoğunluk gradyanlı santrifüj izole edilmiştir. Bu şekilde, bu, örneğin CD8, yıkandı ve bu protokolde, adres istiyorum, çalışmaya bağlı olarak değişir antikorların farklı sayıda ve tip teknikler kullanılarak (FACS) akış sitometrisi kullanılarak hemen lekeli mononükleer hücreler elde etmek mümkündür + 18.
Şekil 1D gösterildiği gibi nöronal sağlığı ve işlevselliği hakkında bilgi, böyle bir aksiyon potansiyelleri (AP) nesil olarak nöronların temel özelliklerini değerlendirmek, elektrofizyolojik kayıt örneğin yaparak değerlendirilebilir.
Şekil 1. dilim morfolojik yapısı hem de temsili sonuçlar. Inkübasyondan sonra bir dilim 8 saat (A) morfolojik yapısı. Ölçek çubuğu 10 mikron gösterir. MAPII (yeşil) ve sinaptofisin (kırmızı) boyama için ko-boyama ile ortaya (B) olarak nöronlar sinaptik bağlanır. Ölçek çubuğu 10 mikron temsil eder. (C) hipokampus a apoptotik hücreler (Kaspaz-3, kırmızı) ve nöronlar (neun, yeşil) Temsilcisi resimfter 6 saatlik bir bekletme. Ölçek çubuğu 10 mikron temsil eder. (D) bir fare kortikal nöron depolarizasyon akımı adımları izleyerek nöronal aksiyon potansiyeli nesil Tek hücre yama-kelepçe kayıtları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Çoklu Renklendirmeler protokol özgüllüğü değerlendirmek için seslendirdi. (A), NogoA (kırmızı) eş-boyama, olgun oligodendrositler (ODCs) ve Caspase3 (apoptoz, yeşil) için bir belirteç ODCs CD8 + T hücreleri tarafından olduğunu göstermektedir. Caspase3 (kırmızı) GFAP, glial hücreler (yeşil) için bir marker ile birlikte boyandı olduğu zaman, (B) etkileşim sonucu negatiftir. Ölçek çubuğu 10 mikron temsil eder. (C) Specificiprotokol ty soldan başlayarak, Caspase3 (kırmızı) ile nöronal hücre ko-boyama (mavi DAPI) tarafından desteklenmektedir: RT hayvanlar WT hayvanlar OTI-I T hücrelerinin maruz ODC OVA ve ODC OVA OTI-I T hücrelerinin maruz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Farklı hayvan modelleri MS gibi inflamatuar demiyelinizan hastalıklarının patolojik özellikleri ele son on yıl içinde tarif edilmiştir. In vivo fare hem de sıçan modelleri yaygın bir hastalık patofizyolojik özelliklerini taklit etmek için kullanılır, yani, demiyelinasyon ve remiyelinizasyon işlemlerinin sonuçlarının analizi ve inflamasyon ve nörodejenerasyonda içiçe bölüm. Bununla birlikte, sadece bir ex vivo yaklaşım tam altında yatan mekanizmaları incelemek için izin verir.
Akut beyin dilimlerinin hazırlanması da çok geniş dağılımlı bir modeldir ve güvenilir ve tekrarlanabilir olarak kabul edilebilir. Hücre etkileşimleri - izolasyon ve oligodendrosit-spesifik immün hücrelerin inkübasyonu ile birlikte, özellikle bir mekanizma ve bir immün hücre krizi ve hücre kinetiği çalışılarak açısından spesifik deneysel soruları kullanılabilir. Diğer ex vivo yaklaşımlar bilinen ve yaygın olan22 kullanılan ancak yani OT-I T hücrelerinin maruz maruz veya WT Caspase3 immünoreaktivitesi doğrulayarak, farklı "dışlama" co-lekelenmelerinin yaparak itiraz edilebilir hedef özgüllüğü bizim protokol yenilik (Şekil 2C bakınız) .
Hazırlanması sırasında bazı kritik noktalar deneyler metodolojik doğru yapılmaktadır emin olmak için göz, yani deneysel ayarları, önüne alınmalıdır; İç geçerliği, izolasyon ve kullanılan bağışıklık hücrelerinin uyarılması için analiz (FACS) akış sitometrisi, örneğin üzerinden düzenli olarak kontrol edilmelidir. Ayrıca, beyin dilimleri kontrol canlılık şiddetle tavsiye edilir. Deneysel gruplar yaş ve cinsiyet uyumlu olmalıdır. Deneyler hep hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak yapılmalıdır.
Protokolün bazı sınırlamalar göz önünde tutulması gerekir. En önemlisi, sunulan bir modeldirBir eks vivo yaklaşımı ve tam bağışıklık, merkezi sinir sistemi bozuklukları, karmaşık immünolojik durumu taklit etmek için uygun değildir. Ayrıca, model, CD8 + T-hücresi bağışıklık yanıtını tahrik kullandığı göz önüne alınmalıdır. CD4 + T hücreleri ve B hücreleri, daha az belirgin bir rol oynar. Bu hücre tiplerini ele alırken diğer oligodendrosit spesifik immün hücre alt tipleri kullanılarak, alternatif protokoller dikkate alınmalıdır. beklenen histolojik bulgu oligodendroglial (Şekil 2A) ve nöronal apoptoz (Şekil 1C bakınız). Seçenek olarak ise, diğer hücre tipleri arasında apoptoz, örneğin, astroglial veya nöronal antijene özgü bağışıklık hücreleri ve transgenik sistemler kullanılarak elde edilebilir. Bu özel protokol, astroglial hücrelerde de Caspase3 immünoreaktivitesi sistemdeki (Şekil 2B) spesifikliğine negatifti.
Açıklanan protokol, temel nöro olarak kabul edilebilirimmünolojik deneysel yaklaşım ve diğer uygulamalar için modifiye edilebilir. spesifik CD4 + T-hücreleri ve - deney prosedürü, kolay bir şekilde farklı antijene özgü bağışıklık hücre alt tipi (örneğin, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) kullanımı ile bir arada çeşitli beyin dilimleri (örneğin, farklı transjenik fare suşu) ile diğer protokoller uygulanabilir Beyin oligodendroglial ve nöronal apoptosis üzerindeki etkisini gidermek için C57BL / 6 farelerinden elde dilim). bağışıklık hücrelerinin in vitro aktivasyonu özgü bağışıklık soru (T H 1 ya da T, H 17 hücre) içine örneğin, kutuplaşmayı değiştirilebilir.
Bazen, beyin dilimleri gelişmiş veya azalmış apoptoz deneysel bir meydan okuma olabilir. Sorun giderme için bazı öneriler şunlardır:
İlk başta, beyin dilimleri kalitesi bizim pH değeri, osmolarite ve oksidasyon durumu yanı sıra hazırlık süresi son derece bağlıdıred çözüm. Bu koşullar, bağımsız deneyler arasındaki karşılaştırılabilir olması sağlanmalıdır. Ayrıca, bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu düzenli olarak kontrol edilmelidir. En uygun antijen konsantrasyonu, değişebilir. Deney kurulurken antijenin bir titrasyon düşünün.
Yukarıda tarif edildiği gibi, söz konusu protokol, merkezi sinir sistemi, bütünlüğü üzerinde daha fazla immün hücre alt tipi (örneğin, CD4 + T-hücreleri, B-hücreleri) etkisini analiz etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Bu yaklaşımlar, histolojik analiz iyice tespit edilebilir olarak oligodendroglial ve nöronal hücreler üzerinde etki ayrılması için özellikle uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
- Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
- Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
- Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
- Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
- Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
- Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
- Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
- Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
- Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
- Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
- Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
- Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121 (2013).
- Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
- McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
- Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
- Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41 (2012).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
- Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
- Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).
