Protocol
Все эксперименты на мышах должны быть выполнены в соответствии с руководящими принципами соответствующей институциональной уходу и использованию животных комитета.
1. Общие Комментарии к экспериментах на мышах
- Держите мышей под патогена условиях и позволяют им доступ к пище и воде вволю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать возрасту и полу соответствием мышей в экспериментальных группах, потому что иммунологические образцы могут варьироваться в зависимости от возраста и пола.
2. Подготовка и активация OVA-специфических CD8 + Т-клетки (ОТ-я)
- Выполните стимуляции OT-я Т-клеток, как описано ниже 5 дней перед приготовлением кусочки мозга.
Примечание: 5 х 10 5 активированного CD8 + эффекторные ОТ-I Т-клеток (CD8 + Т-клетки трансгенных мышей, распознающих только OVA 257-264 пептида в контексте молекул MHC-I) необходимы в срезе концентрации 5 х 10 5 был выбран экспериментсоюзника в оптимальной отдавать предпочтение хорошее взаимодействие клетка-клетка сразу, что клетки начинают мигрировать в часть и, в то же время, количество клеток не было слишком высоким, чтобы вызвать чрезмерную реакцию, позволяющую одной клетки подсчета 8,18. - Подготовка среды для культивирования ОТ-I Т-клеток. Дополнение 500 мл DMEM с 5% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 1% заменимых аминокислот и 25 мкг / мл гентамицина. Хранить среду при 4 ° С до использования.
- Снимите селезенки OT-I трансгенных мышей, в ссылке 16. Передача их в подготовленную среду.
- Генерация суспензии отдельных клеток путем затирания селезенки через сито и центрифуги суспензии 70 мкм при 300 х г в течение 5 мин, 4 ° С.
- Инкубируйте клеточной суспензии 5 мл аммония-хлорида калия (ACK) буфера (150 мМ NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,3) в течение 5 мин, чтобы лизировать красные кровяные клетки.
- Стоп incubatiна 10 мл среды и центрифуги его снова, как описано выше.
- Развести клеточной суспензии в среде и рассчитать число. Пластина клеток при плотности 3 × 10 7 клеток / лунку в 12-луночный планшет и простое их путем инкубации с OVA 257 - 264 (SIINFEKL; 1 нМ) и интерлейкин-2 (ИЛ-2) (500 МЕ / мл) в течение 5 дней.
- После 4 дней, добавить IL-2 в концентрации 500 МЕ / мл снова.
- После стимуляции, очистить OT-I T-клеток из клеточной суспензии с помощью отрицательного отбора, основанного мышь набор для выделения Т-клеток CD8 + в соответствии с инструкциями изготовителя. Очистка основана на истощение всех не CD8 + клеток с использованием коктейля антител против CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC класса II, трет-119, и TCRγ / δ, которые затем отбрасывают с использованием магнитных колонки для элюирования очищенных CD8 + Т-клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Критические шаги в этом процедуры, применяемыеRe обозначены производит: важно, что реакция включает в себя только отдельные клетки, поскольку присутствие комков может блокировать столбец в течение стадии элюирования; Подсчет клетки перед добавлением Byotin коктейль имеет важное значение для степени чистоты образца и процедура должна быть выполнена на льду, чтобы минимизировать неспецифических привязки антител.
3. Подготовка острой мозга ломтиками и сотрудничеству в культуре с OT-I Т-клеток
- До подготовки острого мозга ломтики 19, подготовить placedine ледяной физиологический раствор, используя 200 мМ сахарозы, 20 мм Трубы диаметром 2,5 мм KCl, 1,25 мМ NaH 2 PO 4, 10 мМ MgSO 4, 0,5 CaCl 2 и 10 мМ декстрозы и искусственный спинномозговой жидкости (ACSF) с помощью 125 мМ NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 мМ NaHCO 3, 2 мМ MgSO 4, 2 мМ CaCl 2, 10 мМ декстрозы. Отрегулируйте рН каждого раствора 7,35 по Усинг NaOH. Перед регулировкой рН ACSF, раствор должен быть барботируют смесью 95% O 2 и 5% CO 2.
- Pre-охлаждать решения.
- Обезболить 8 - 10 недель старых мышей (например, C57BL / 6 в качестве контроля или трансгенных ODC-OVA мышей 17 с помощью ингаляции 5,0% изофлуран, 5,0% галотана или инъекции 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг веса тела с помощью ксилазина IP Подождите для анестезии и использовать ОО щепотку для оценки уровня анестезии и обезглавить их сразу. Эвтаназии мышей, как в учреждениях для животных и использовать критерии Комитет по эвтаназии.
- Положите мышь в брюшной положении. Лечить и сократить кожу головы в сагиттальной. Откройте кости черепа сагиттально, извлечь мозг быстро с помощью совка и закрепить его на пластины vibratome с помощью клея.
- Заполните табличку с подготовленной placedine ледяной физиологическом растворе.
- Вырезать 300 мкм корональные срезы с vibratome.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура знаюп для получения жизнеспособных образцов интактной ткани, подходящие для функциональных клеточных исследований в течение периода времени, равного по меньшей мере 8 ч 19-21. Действительно, после этого периода времени, уже начиная после 6 часов, препарат показал снижение качества, а именно изменения в основных и функциональных свойств, таких как генерации потенциала действия и распространения. - После секционирования, передавать один кусок непосредственно в каждую лунку 12-луночного планшета, заполненной ACSF.
- Добавить внимательно 5 х 10 5 OT-я Т-клеток в срезе.
- Инкубируйте ломтики в течение до 8 ч в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2).
- После инкубационного периода, урожай ломтиками и вставлять их с помощью октября соединение тканей-Tek и заморозить их в жидком азоте. Хранить их при температуре -20 ° С для дальнейших гистологических исследований в например, оценку нейрональной структуры (например, с использованием анти-MAPII или анти-антитела синаптофизина) или апоптоз (например, с использованием анти-каспазы-3 антитела и анти-анти NeuNорганы) в соответствии со стандартными процедурами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После инкубации срезов головного мозга с олигодендроцитов-направленный CD8 + Т-клеток, олигодендроциты, а также нейроны претерпевают апоптоз (2а и 1С, соответственно). Гистологические признаки апоптоза (например, ген каспазы-3, Tunel) могут быть обнаружены после ранней 3 ч инкубации. Инкубационный период не должен быть больше, чем 8 часов для того, чтобы гарантировать хорошее качество подготовки и воспроизводимых результатов. Апоптоза клетки могут быть найдены на всем протяжении кусочек с преобладанием в миелиновых областях. Примерный гистологическое окрашивание среза для структурной целостности и апоптоза нейронов изображены на рис 1А-C.
Есть разные моменты времени в течение инкубации, которые представляют интерес для оценки параметров исхода. Типичное время, конечно выполнена в нашей лаборатории включает в себя параметры анализов, а именно, межклеточных взаимодействий в момент времени 0, а затем 3, 4 и 6 ч (максимальное взаимодействие наблюдается) после того, каквзаимодействие началось. Некоторые типичные анализы за пределами гистологических анализов, которые часто могут быть применены, описаны очень кратко:
Восстановление и анализ Т-клеток
После инкубационного периода до 8 часов, Т-клетки могут быть выделены из ломтиками и могут быть оценены для анализа параметров по отношению к внутриклеточных эффекторных молекул, таких как продукции цитокинов или пролиферации. Для того чтобы восстановить Т-клетки, срезы диссоциируют механически и объединяли для каждого экспериментального состояния. Клетки были выделены из интерфейса 30% до 50% Перколла (Amersham, Фрайбург, Германия) после центрифугирования в градиенте плотности в течение 30 мин при 2500 оборотах в минуту. Таким образом, можно получить мононуклеарные клетки, которые промывали и окрашивали сразу же с помощью проточной цитометрии (FACS методов) с использованием различное число и тип антител, которые изменяются в зависимости от исследования, мы хотим обратиться, в данном протоколе, например, CD8 + 18.
Информация о нейронной здоровья и функциональности можно оценить путем проведения электрофизиологического записи, например, для оценки основных свойств нейронов, такие как потенциалы действия (AP) поколения, как показано на рисунке 1D.
Рисунок 1. Морфологическая структура ломтик а также показательные результаты. () Морфологическая структура среза 8 ч после инкубации. Масштабная линейка показывает 10 мкм. (B) Нейроны синаптически соединены, как показали совместным окрашиванием по MAPII (зеленый) и синаптофизина (красный) окрашивания. Масштабная линейка составляет 10 мкм. (C) представитель картина апоптоза клеток (каспазы-3, красный) и нейронов (Neun, зеленый) в гиппокампе аосле 6 ч инкубации. Масштабная линейка составляет 10 мкм. (D) одной клетки патч-зажим записи нейронов генерации потенциала действия следующие деполяризующие текущих шагов в мышиной коркового нейрона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Несколько окрашивание Для оценки специфичности протокола. () Co-окрашивание NogoA (красный), маркер для зрелых олигодендроцитов (ДДК) и Caspase3 (апоптоз, зеленый) показывает, что КДЦ напали на CD8 + Т-клеток. (B) результат взаимодействия отрицательным, когда Caspase3 (красный) совместно окрашенных GFAP, маркера для глиальных клеток (зеленый). Масштабная линейка представляют 10 мкм. (C) SpecificiТы протокола поддерживается совместным окрашиванием нервных клеток (DAPI, голубой) с Caspase3 (красный), начиная слева: WT животных, WT животных, подвергшихся воздействию OTI-I Т-клеток, ODC-OVA и ODC-OVA воздействию OTI-я Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Различные модели на животных были описаны в последние десятилетия для решения патологические особенности воспалительных заболеваний демиелинизирующих как MS. В естественных условиях мышей и крыс модели широко используются для выполнения патофизиологические особенности заболевания, а именно, анализ последствий демиелинизации и процессы ремиелинизации и приобщены эпизодов воспаления и нейродегенерации. Тем не менее, только экс естественных подход позволяет анализировать точные основные механизмы.
Получение острых срезах мозга также широко распространены модели и может рассматриваться в качестве надежной и воспроизводимой. В сочетании с изоляцией и инкубации олигодендроцитов конкретных иммунных клеток, он может быть использован для решения конкретных экспериментальных вопросы, особенно с точки зрения изучения механизма и кинетики иммунной атаки клеток и клеток - клеточных взаимодействий. Другие Экс Vivo подходы известны и широкоиспользуется 22, но новизна нашего протокола в специфике цели, которая может быть оспорена выполнения различных "Исключение" побочные окрашивания, а именно проверки иммунореактивности Caspase3 в мас подвергается или не подвергается OT-я Т-клеток (рис 2С) ,
Некоторые критические точки при подготовке следует принимать во внимание, а именно экспериментальных условиях, чтобы убедиться, что эксперименты проводятся методически правильно; для внутреннего действия, изоляции и стимуляции, используемых иммунных клеток следует контролировать на регулярной основе через, например, проточной цитометрии (FACS анализа). Кроме того, проверка жизнеспособности срезах мозга рекомендуется. Экспериментальные группы должны строиться с учетом возраста и пола соответствием. Эксперименты всегда должны быть выполнены в соответствии с правилами защиты животных.
Некоторые ограничения протокола должны быть сохранены в памяти. Самое главное, представленная модель являетсяПодход экс виво и не подходит для полностью имитировать сложный иммунологический положение аутоиммунных расстройств центральной нервной системы. Кроме того, следует учитывать, что модель использует только CD8 + Т-клеток иммунного ответа приводом. CD4 + Т-клетки и В-клетки играют менее важную роль. Альтернативные протоколы, использующие другие олигодендроцитов конкретных подтипов клеток иммунной системы должны учитываться при решении этих типов клеток. Ожидается, гистологическое вывод олигодендроглиальным (рис 2а) и апоптоз нейронов (рис 1в). С другой стороны, апоптоз клеток других типов может быть достигнуто с использованием, например, астроглиальных или нейронные антиген-специфических иммунных клеток и трансгенных систем. В этом конкретном протоколе Иммунореактивность Caspase3 в астроглиальных клеток был отрицательным из-за специфики системы (рис 2б).
Описанный протокол может рассматриваться в качестве основного нейроиммунологическая экспериментальный подход и могут быть изменены для других приложений. Экспериментальная процедура может быть легко применены к другим протоколам путем изменения срезах мозга (например, различные трансгенных линий мышей) в сочетании с различными антиген-специфических подтипов клеток иммунной системы (например, использование миелин олигодендроцитов гликопротеин (MOG) - специфических CD4 + T-клеток и срезах мозга, полученные от мышей C57BL / 6, чтобы решать свои эффекты на олигодендроглиальных и нейронов апоптоза). В пробирке активации иммунных клеток может изменяться для специфических иммунологических ответов (например, поляризации в T H 1 или T H 17 клеток).
Иногда, усиление или ослабление апоптоза в срезах мозга может быть экспериментальной задачей. Некоторые рекомендации для устранения неисправностей:
Во-первых, качество срезов головного мозга в значительной степени зависит от времени подготовки, а также значение рН, осмолярность и окисления статуса компанииРешение ред. Следует убедиться, что условия сопоставимы между независимыми экспериментами. Кроме того, активация иммунных клеток следует контролировать на регулярной основе. Оптимальная концентрация антигена может варьироваться. Рассмотрим титрование используется антигена при установлении эксперименты.
Как описано выше, упомянутый протокол может быть использован в качестве отправной точки для анализа влияния дополнительных подтипов иммунных клеток (например, CD4 + Т-клеток, В-клеток) на центральную нервную целостности системы. Эти подходы особенно подходит для разделения их воздействие на олигодендроглиальным и нервных клеток, как гистологический анализ может быть полностью оценены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
- Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
- Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
- Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
- Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
- Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
- Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
- Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
- Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
- Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
- Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
- Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
- Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121 (2013).
- Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
- McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
- Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
- Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41 (2012).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
- Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
- Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).
